DE10102065C2 - Diagnostikmembran und Verfahren zur Herstellung einer Diagnostikmembran - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Diagnostikmembran für einen im­ munchromatographischen Test, im Wesentlichen bestehend aus einer mikroporösen Membran aus einem Polymermaterial und ei­ nem Polymer mit hohem Bindevermögen.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstel­ lung einer Diagnostikmembran für einen immunchromatographi­ schen Test.

Diagnostische in vitro Schnelltests wurden vor etwa 20 Jahren eingeführt, um Vorhandensein und Menge von spezifischen Mole­ külen im Menschen schnell nachzuweisen. Sie werden immunchro­ matographische Nachweise genannt, da sie auf der überaus spe­ zifischen Antikörper-/Antigenreaktion beruhen und sind heu­ te meist in Form eines einstufigen lateralen Teststreifens konzipiert.

Die bekannten immunchromatographischen Tests funktionieren in ähnlicher Weise. Als essentielle feste Phase wird meist eine mikroporöse Cellulosenitratmembran (DE 45 38 381 A1; EP 0 421 235 A2; US 5,980,746) benutzt, auf welcher die Antikörper-/­ Antigenreaktionen stattfindet, wobei ein Farbsignal sichtbar wird.

Ein immunchromatographischer Test, wie er beispielweise in der US 5,980,746 beschrieben ist, besteht aus folgenden Kom­ ponenten:

• - Einem Vorfilterkissen bzw. Probeaufnahmestreifen aus Fa­ sermaterial, wie z. B. Papier, Glasfaser- oder Polymer­ vlies, zur Vorfiltration der flüssigen Probe (diese ist gewöhnlich Vollblut, Serum oder Urin, kann jedoch prin­ zipiell jede Körperflüssigkeit sein);
• - einem Konjugat-Kissen, welches gleichfalls aus Faserma­ terial, wie Glasfaser oder Polymervlies besteht. Dieses Kissen wird vor dem Zusammenfügen der Testkomponenten mit dem Konjugat-Reagens imprägniert. Das Konjugat- Reagens besteht üblicherweise aus farbigen Partikeln, wie z. B. Goldkolloid (siehe DE 37 81 335 T) oder ge­ färbtem Latex, welche mit einem spezifischen Antikörper gegen ein Epitop des gesuchten Analyts umhüllt sind;
• - einem Streifen aus einer mikroporösen Cellulosenitrat- Membran. Diese wird vor dem Einbau in den Test-Kit ge­ wöhnlich mit einer Linie eines sekundären Antikörpers versehen, welcher zur Erkennung eines zweiten, anderen Epitops des Analyts befähigt ist. Üblicherweise werden zwei Antikörper, ein capture bzw. Test-Antikörper und ein Kontroll-Antikörper in zwei getrennten Linien auf die Membrane aufgebracht;
• - einem meist aus Cellulosefasern (Papier) bestehenden Saugkissen (absorbent pad) am Streifenende zum Ansaugen und Aufnehmen der überschüssigen Probenflüssigkeit.

Ein kompletter immunchromatographischer Teststreifen, bei­ spielweise ein Schwangerschaftstest (DE 37 81 335 T2, US 5,980,746 A) arbeitet in der folgenden Weise:
Die Probe wird am Streifenanfang auf das Vorfilterkissen auf­ gebracht, welches neben seiner Hauptfunktion als Vorfilter auch Reagenzien zur gezielten Konditionierung der Probe (z. B. pH-Wert, Viskosität, u. s. w.) enthalten kann. Die Probe wandert dann infolge von Kapillarkräften zum angrenzenden Konjugat-Kissen. Die Probe mobilisiert die im Konjugat-Kissen enthaltenen Konjugat-Partikel, wobei bei Anwesenheit des Schwangerschaftshormons hcG in der Probe gleichzeitig eine Komplexbildung zwischen diesem und dem Konjugat-Antikörper erfolgt. Die Probe wandert weiter und tritt in die angrenzen­ de, überlappende Cellulosenitrat-Membran ein. Auf dem Weg durch die schwammartige Struktur der Membran wird eine gute Durchmischung der Probe erreicht. Beim Erreichen der Testli­ nie mit dem aufgebrachten aktiven zweiten (capture) Antikör­ per wird das hcG im gebildeten hcG-Antikörper-Konjugat- Komplex erkannt und der gesamte Komplex abgefangen und dort konzentriert, so dass die vorher nicht sichtbare Linie ge­ färbt erscheint. Die Probenflüssigkeit wandert weiter in der Membrane und erreicht die zweite Linie mit dem aufgebrachten Kontroll-Antikörper. Dieser ist spezifisch nur zur Erkennung des Konjugat-Antikörpers befähigt und immobilisiert so das überschüssige Antikörper-Konjugat unter Bildung einer zweiten gefärbten Linie (Positiv-Kontrolle). Ein Überschuss an Konju­ gat-Antikörper ist stets gegeben, selbst bei stark positiven Proben, die eine intensiv gefärbte Testlinie erzeugen, so dass immer einige Konjugat-Partikel an der Kontroll-Linie ab­ gefangen werden und so ein erkennbares Kontrollsignal erge­ ben. Dieses Kontrollsignal zeigt an, dass der gesamte Testab­ lauf normal funktioniert hat und das Testergebnis richtig ist.

Die mikroporöse Membran fungiert in den bekannten Tests als feste Phase, an die ein Test-Reagens (z. B. ein Antikörper oder Antigen) gebunden wird und die anschließend den Trans­ port einer flüssigen Probe durch die Zone mit dem dort gebun­ denen Test-Reagens ermöglicht. Diese Tests können nach dem sogenannten "lateral flow"-Prinzip oder nach dem sogenannten "flow-through"-Prinzip, bei welchem die Reagenzien schritt­ weise zugegeben werden, gestaltet sein. Als Membranmaterial wird vorzugsweise wegen seines einzigartigen Bindevermögens für Proteine, sowie seiner Fähigkeit zur Bildung von Membra­ nen mit extrem großen Porenweiten, Cellulosenitrat einge­ setzt. Proteine werden beim Kontakt mit mikroporösen Cellulo­ senitrat-Membranen an die Membranstruktur gebunden, wobei der Mechanismus auf elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den stark polarisierten -O-NO₃-Estergruppen des Cellulosen­ nitrats und den Aminogruppen des aus Aminosäuren aufgebauten Proteins beruht. Der Bindevorgang an die Cellulosenitrat- Membran erfolgt sehr schnell, wobei die gesamte verfügbare Oberfläche der Membran mit einer monomolekularen Schicht von Protein belegt wird. Die mikroporösen Membranen besitzen auf­ grund ihrer schwammartigen Struktur eine sehr hohe Gesamt­ oberfläche von etwa 20-400 cm² je cm² Membranfläche, die für die Bindung von Proteinen zur Verfügung steht. Diese Ka­ pazität wird bei immunchromatographischen Tests nur zum ge­ ringen Teil in Anspruch genommen, da das in Aufsicht regist­ rierte Testsignal nur den oberflächennahen Bereich mit einer Sichttiefe von etwa 10-20 µm wiedergibt. Die Gesamtdicke einer solchen Membran beträgt jedoch etwa 50-200 µm, im Re­ gelfall etwa 140 µm.

Weiterhin ist aus der WO 00/78850 A1 ein Verfahren zur Her­ stellung einer Verbundmembran bekannt, die einen porösen Film aus einem ersten Polymer umfasst, dessen Poren ein zweites Polymer enthalten, dass in gelöster Form in die Poren einge­ bracht wird. Der Film des ersten Polymers ist dabei in Kontakt mit der Oberfläche einer ersten Elektrode, wobei wenigs­ tens eine zweite Gegenelektrode mit der Lösung des zweiten Polymers in Verbindung steht und wobei eine solche Potenti­ aldifferenz über die beiden Elektroden appliziert wird, dass das zweite Polymer zur ersten Elektrode wandert und den Film aus dem ersten Polymer durchdringen muss.

Nachteilig bei einem derartigen Verfahren bzw. einer derarti­ gen Membran ist, dass das zweite Polymermaterial nicht in vorbestimmbaren Spots bzw. Bereichen, sondern nur innerhalb der Poren angeordnet wird und diese komplett mit dem zweiten Polymer gefüllt sind.

Weiterhin ist aus der US 6 156 271 A eine Assayvorrichtung bekannt, die einen Kompositstreifen aufweist, umfassend min­ destens zwei Körper eines porösen, flüssigkeitsleitenden Ma­ terials, die über eine Grenzfläche in Flüssigkeitskontakt miteinander stehen und zusammen mindestens einen Teil eines Flüssigkeitsfließweges definieren, auf dem während der Durch­ führung eines Assays Flüssigkeit fließen muss. An der Grenzfläche, bezogen auf die Richtung des Flüssigkeits­ fließweges, ist die laterale Dimension des Kontaktbereiches des stromaufwärts liegenden Körpers derart verengt, dass der Flüssigkeitsfluss vom stromaufwärts liegenden Körper in den stromabwärts liegenden Körper in Richtung der Mittellinie des Fließweges in den stromabwärts liegenden Körper fokussiert wird. Der stromaufwärtsliegende Körper kann dabei ein Probenaufnahmeelement oder einen Docht sein. Innerhalb eines Probeaufnahmeelementes ist bei einer innerhalb eines Gehäuses versteckten Stelle ein Vorrat an mobilisierbarem markierten Reagenz aufgetragen, das im feuchten Zustand innerhalb des Probenaufnehmers und des porösen Streifens beweglich ist. Die sich fortbewegende Probenflüssigkeit kann dieses mobilisierbare Reagenz aufnehmen und in Richtung einer Nachweiszone tragen, in der das markierte Reagenz akkumulieren und ein auf das Testergebnis hinweisendes Assay- Signal erzeugen kann.

Weiterhin ist aus der US 5 629 084 A eine poröse Verbundmemb­ ran bekannt, die ein poröses Membran-Substrat mit einer mitt­ leren Porengröße zwischen 0,01 und 10 µm enthält, das aus ei­ nem ersten Polymer gebildet wird, wobei das Substrat über seine gesamte Oberfläche durch Imprägnieren mit einer zweiten Polymerzusammensetzung in einem Lösungsmittel direkt be­ schichtet wird, welches vernetzt wird, und welches in situ auf dem Substrat mit einem Initiator für die freie radikali­ sche Polymerisation in Abwesenheit eines Vernetzungsreagenzes unlöslich gemacht wird. Die poröse Verbundmembran besitzt da­ bei im Wesentlichen dieselbe Konfiguration wie das poröse Membran-Substrat.

Aus der US 5 565 789 A ist eine Vorrichtung zur Bestimmung von Analyten mit einem Probenaufgabepunkt, mehreren getrenn­ ten Probeentnahmezonen, die durch jeweils eine kapillare Transportstrecke mit dem Probenaufgabepunkt verbunden sind, bekannt. Die Vorrichtung weist mehrere Testelemente zur Ein­ zelbestimmung von Analyten auf, wobei auf mindestens einer der Transportstrecken eine Verzögerungszone vorgesehen ist. Da beispielsweise drei parallel angeordnete Testelemente bzw. Teststreifen von dem Probenaufgabepunkt unterschiedliche Ent­ fernungen aufweisen, muss zum nächstliegenden Teststreifen hin eine Verzögerungszone angeordnet werden.

Nachteilig bei den bekannten Diagnostikmembranen bzw. Test­ verfahren ist, dass infolge der starken Bindekräfte des Cel­ lulosenitrats die überschüssige Bindekapazität der Membran blockiert werden muss, damit der Analyt und das Konjugat- Reagens nicht auf ihrer lateralen Migration durch die Membran abgefangen werden bevor sie die Zone mit dem Test-Reagens er­ reichen. Der Membranstreifen ist üblicherweise 1-4 cm lang, so dass die flüssige Probe, vom Konjugat-Kissen kommend, eine entsprechende Strecke in der Membran wandert, bevor sie die Test-Linie erreicht. In diesem Bereich müssen die Nitratester-Bindestellen abgesättigt werden, so dass Konjugat- Partikel und/oder evtl. vorhandene nachzuweisende Moleküle abgefangen werden. Zur Absättigung der überschüssigen Binde­ stellen wird nach einer ersten Methode die gesamte Membran in ein Blockierungsbad nach dem Auftragen der Antikörper-Linien und vor der Endmontage des Test Kits eingebracht, wobei als Blockiersubstanzen üblicherweise Protein oder geeignete che­ mische Substanzen verwendet werden. Nachteilig ist dabei, dass mehrere zusätzliche Fertigungsschritte benötigt werden, wie das Einbringen der Membran in das Blockierbad, Waschen und Trocknen.

Eine zweite Methode besteht in einem Zusatz von Blockierungs­ mittel im Konjugat-Kissen, wobei eine Blockierung einer über­ schüssigen Bindestellen in situ erst während der Benutzung des Test Kits erfolgt. In diesem Fall wird mit einem deutli­ chen Überschuss von Blockiermittel im Verhältnis zu Konjugat und Analyt gearbeitet, so dass die noch vorhandenen Binde­ stellen vorrangig von Blockiermolekülen besetzt werden. Bei der zweiten Methode ist zwar kein zusätzlicher Fertigungs­ schritt erforderlich, da das Eintragen des Blockiermittels in das Konjugat pad gemeinsam mit dem Konjugat erfolgt, jedoch ist hierbei ein Verlust an Konjugat und nachzuweisenden Mole­ külen zu erwarten, mit den Folgen einer merklichen Hinter­ grundfärbung und einer Schwächung des Positiv-Signals.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die bekann­ ten Diagnostikmembranen so zu verbessern, dass zum einen auf zusätzliche, zeitaufwendige Fertigungsschritte verzichtet werden kann und zum anderen eine Schwächung des Positiv- Signals vermieden werden kann, so dass eine Verbesserung der Test-Sensitivität erreicht wird.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß in Verbindung mit dem O­ berbegriff des Anspruches 1 dadurch gelöst, dass das Polymer­ material ein sehr niedriges Bindevermögen aufweist und dass das Polymer mit hohem Bindevermögen nur in vorbestimmten Spots auf der Membran angeordnet ist.

Dadurch, dass das Polymermaterial der mikroporösen Membran ein sehr niedriges bzw. ein sehr wenig ausgeprägtes Bindever­ mögen aufweist, ist hier eine Absättigung überschüssiger Bin­ destellen nicht notwendig. Das hohe Bindevermögen, welches im Bereich des Test-Reagens und des Kontroll-Reagens benötigt wird, wird dadurch erreicht, dass Polymer mit hohem Bindever­ mögen nur in vorbestimmten Spots auf der Membran angeordnet ist, nämlich da wo es benötigt wird. Da keine Verluste an A­ nalyt oder Konjugat durch unspezifische Adsorption an die Membran stattfinden können, wird eine erhebliche Verbesserung der Test-Sensitivität erreicht. Das Aufbringen des Polymers mit hohem Bindevermögen in vorbestimmten Spots, also eine zo­ nenweise Imprägnierung der Trägermembran, kann vom Hersteller diagnostischer Kits leicht in das bisherige Fertigungsverfah­ ren ohne zusätzlichen Zeitaufwand integriert werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst ein erster Spot einen Bereich, auf dem Test-Reagens anorden­ bar ist und ein zweiter Spot einen Bereich auf dem ein Kon­ troll-Reagens anordenbar ist. Dadurch wird vorteilhaft er­ reicht, dass lediglich im Bereich des Test- und Kontroll- Reagens die Diagnostikmembran ein hohes Bindevermögen auf­ weist.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Membran in einem Abstand zu den Spots einen Bereich auf, auf den Konjugat-Reagens direkt aufbringbar ist.

Durch die Verwendung einer mikroporösen Membran aus einem Po­ lymermaterial mit einem sehr niedrigen unspezifischen Binde­ vermögen wird es ermöglicht, das Konjugat-Reagens direkt auf die Membran aufzubringen. Dadurch kann auf einen speziellen Konjugatstreifen aus Glasfaser oder Vlies, aus welchem das darin enthaltene Konjugat-Reagens mit einem bestimmten Volu­ men an Probenflüssigkeit freigesetzt wird, verzichtet werden.

Das Freisetzen ist nur sehr schwer zu erreichen, da das Kon­ jugat-Reagens bis zum Gebrauch lange Zeit im Streifen bleiben muss, ohne an dessen Fasern gebunden zu werden. Darüber hin­ aus haben diese aus Fasern aufgebauten Streifen keine homoge­ ne Struktur, so dass die tangentiale Durchströmung nicht ganz gleichmäßig ist. Diese Nachteile werden durch das nunmehr mögliche direkte Aufbringen von Konjugat-Reagens auf die mik­ roporöse Membran vermieden. Bei Verwendung einer niedrig bin­ denden Membran kann man außerdem das Konjugat-Reagens in ei­ nem enger definierten Abstand von der Testlinie bzw. von dem ersten Spot positionieren, was eine sowohl besser zu kontrol­ lierende Durchmischung der Probe mit dem Konjugat-Reagens als auch eine gleichmäßige Migration zur Folge hat.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin­ dung ist die Membran als Teststreifen ausgebildet. Der Test­ streifen weist dabei an einem ersten Ende einen Probeaufnah­ mestreifen zur Aufnahme einer einen Analyten enthaltenden flüssigen Probe und einen dem Probeaufnahmestreifen benach­ barten Bereich mit dem Konjugat-Reagens auf, zudem in einem ersten Abstand der erste Spot mit Test-Reagens als Testlinie und in einem zweiten Abstand der zweite Spot mit dem Kon­ trollreagens als Kontrolllinie angeordnet ist.

Durch die Ausbildung der Diagnostikmembran bzw. Membran als Teststreifen wird ein besonders einfach zu handhabendes Dia­ gnostikverfahren ermöglicht.

Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist der Teststreifen quer zu seiner Längsrichtung zwischen dem Be­ reich mit dem Konjugat-Reagens und dem ersten Spot mit dem Test-Reagens eine eine Engstelle bildende Verjüngung auf. Durch die Engstelle kann, falls die zur Verfügung stehende Zeit bis zum Erreichen der Testlinie für eine vollständige Komplexbildung zwischen Analyt und Konjugat-Reagens zu kurz ist, der Migrationvorgang verlangsamt werden.

Die Verfahren zur Herstellung einer Diagnostikmembran für ei­ nen immunchromatographischen Test weisen die oben genannten Nachteile auf.

Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die bekannten Verfahren zur Herstellung einer Diagnostikmembran so zu verbessern, dass ohne zusätzliche zeitaufwendige Ferti­ gungsschritte eine Verbesserung der Test-Sensitivität er­ reicht wird.

Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des An­ spruches 12 dadurch gelöst, dass auf eine mikroporöse Membran mit niedrigem Bindevermögen ein Polymer mit hohem Bindevermö­ gen in vorbestimmten Spots auf die Membran aufgebracht wird und anschließend zum immunologischen Nachweis dienende Rea­ genzien auf die Spots appliziert werden.

Dadurch, dass ein Polymer mit hohem Bindevermögen lediglich in vorbestimmten Spots auf die Membran aufgebracht wird, auf die anschließend zum immunologischen Nachweis dienenden Rea­ genzien appliziert werden, kann zum einen auf zeitaufwendige zusätzliche Fertigungsschritte, wie das Einbringen der Memb­ ran in eine Blockierbad, Waschen und Trocken, verzichtet wer­ den und zum anderen wird eine Verbesserung der Test- Sensitivität erreicht, da keine Verluste an Analyt und/oder Konjugat durch unspezifische Adsorption an das Membranmateri­ al stattfinden können.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin­ dung wird als Polymer eine Cellulosenitratlösung auf die Membran aufgebracht und einem Trocknungsvorgang unterzogen, so dass sich Cellulosenitrat in den vorbestimmten Spots auf der Membran abscheidet. Durch die Verwendung von Cellulose­ nitrat kann dessen bekanntes einzigartiges Bindevermögen für Proteine genutzt werden. Das Aufbringen der Cellulosenitrat­ lösung kann dabei in situ beim üblichen Fertigungsprozess er­ folgen. Dabei können die bekannten präzisen positionierbaren Dosierverfahren mittels spezieller Dispenser angewandt werden.

Das Aufbringen der Lösungen auf die Membran kann sowohl im Kontaktverfahren als auch berührungslos erfolgen. Nach dem Abscheiden des Cel­ lulosenitrats auf der Membran bleibt die mikroporöse Struktur der Membran weitgehend erhalten. Nach dem Trocknen können die Reagenzien im üblichen Verfahren aufgebracht werden und zwar genau an den Stellen, wo zuvor das Cellulosenitrat aufge­ bracht wurde.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Konjugat-Reagens direkt auf die niedrig bindende Membran aufgebracht.

Durch die Verwendung einer niedrig bindenden Membran lässt sich das Konjugat-Reagens vorteilhaft auf die Membran auf­ bringen.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass aufgrund der defi­ nierten Membranstruktur eine kontrollierte, exakte, zeitliche und mengenmäßige Abstimmung der einzelnen Reaktionspartner im Volumenstrom ermöglicht wird. Der sonst notwendige Blockier­ schritt zur Absättigung der restlichen Membranfläche ist durch die niedrig bindende Membran überflüssig.

Durch die erfindungsgemäße Diagnostikmembran ist die wesent­ liche Voraussetzung für den Bau von quantitativen anstelle der bisherigen qualitativen Tests gegeben.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert.

In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1: Eine schematische Darstellung einer Diagnostikmemb­ ran in Form eines immunchromatographischen Test­ streifens,

Fig. 2: einen typischen Aufbau eines immunchromatographi­ schen Teststreifens nach dem Stand der Technik,

Fig. 3: eine schematische Darstellung eines Analyten mit drei verschiedenen Epitopen als Reaktionspartner,

Fig. 4: eine schematische Darstellung eines mobilen Konju­ gat-Reagens (Konjugat-Antikörper, gebunden an kol­ loidale Partikel, z. B. Gold oder gefärbtes Latex) als Reaktionspartner,

Fig. 5: eine schematische Darstellung eines immobilisierten Test-Reagens (membrangebundener Test-Antikörper) als Reaktionspartner,

Fig. 6: eine schematische Darstellung eines immobilisierten Kontroll-Reagens (membrangebundener Kontroll- Antikörper) als Reaktionspartner,

Fig. 7: eine schematische Darstellung der Bildung eines mo­ bilen Komplexes aus Analyt und Konjugat-Reagens,

Fig. 8: eine schematische Darstellung der Immobilisierung des mobilen Komplexes an der Testlinie (erster Spot) und

Fig. 9: eine schematische Darstellung der Immobilisierung von überschüssigen Konjugat-Reagens an der Kon­ trolllinie (zweiter Spot).

Eine Diagnostikmembran für einen immunchromatographischen Test in Form eines Teststreifens 1 besteht im Wesentlichen aus einem Probenaufnahme-/Vorfilterstreifen 2, einer mikro­ porösen Membran 3 mit einem Bereich 4 für ein Konjugat- Reagens, einem ersten Spot 5, einem zweiten Spot 6 und einem Absorberstreifen 7.

Die mikroporöse Membran 3 besteht aus einem Polymermaterial, das ein sehr niedriges unspezifisches Bindevermögen aufweist.

Als Polymermaterial werden dabei regenerierte Cellulose, Cel­ luloseacetat, Polyethersulfon, PVDF (Polyvinylidenfluorid), Polyamid oder PTFE (Polytetraflurethylen) verwendet. Die mik­ roporöse Membran 3 weist eine Porengröße im Bereich von 0,02 µm bis 30 µm auf. Membranen mit einer hydrophoben Charakteris­ tik haben dabei seitens des Membranherstellers eine hydrophi­ lisierende Behandlung erhalten.

An seinem ersten Ende 8 weist der Teststreifen 1 den Probe­ aufnahme-/Vorfilterstreifen 2 auf. Dem Probeaufnahme-/­ Vorfilterstreifen 2 benachbart ist auf der mikroporösen Memb­ ran 3 der Bereich 4 angeordnet, auf dem das mobile Konjugat- Reagens 9 (Konjugat-Antikörper, gebunden an kolloidale Parti­ kel, z. B. Gold oder gefärbtes Latex) direkt aufgebracht ist.

In einem Abstand zu dem Bereich 4 für das Konjugat-Reagens 9 weist die mikroporöse Membran 3 den ersten Spot 5 und in ei­ nem weiteren Abstand den zweiten Spot 6 auf. Die Spots 5, 6 sind aus einem Polymer mit hohem Bindevermögen, vorzugsweise Cellulosenitrat ausgebildet. Als Cellulosenitrat kommen dabei alkohol- und/oder esterlösliche Cellulosenitrattypen (soge­ nannte A- bzw. E-Wollen) zum Einsatz.

Der erste Spot 5 bildet eine Testlinie 10 und weist zu diesem Zweck ein immobilisiertes Test-Reagens (membrangebundener Test-Antikörper) 11 auf. Der zweite Spot 6 bildet eine Kon­ trolllinie 12 und weist zu diesem Zweck ein immobilisiertes Kontroll-Reagens (membrangebundener Kontroll-Antikörper) 13 auf. An seinem dem ersten Ende 8 abgewandten zweiten Ende 14 weist der Teststreifen 1 den Absorberstreifen 7 auf. Zwischen dem Bereich 4 für das Konjugat-Reagens 9 und dem ersten Spot 5 weist der Teststreifen 1 eine Engstelle 16 auf. Die Engstelle 16 wird durch eine Verjüngung 15 bzw. einen beid­ seitigen Einschnitt über die Breite gebildet. Es ist aber grundsätzlich auch möglich, die Engstelle durch eine Verrin­ gerung der Dicke der Membran 3 zu bilden.

Das Aufbringen der Spots 5, 6 bzw. der Cellulosenitratlösung erfolgt in situ beim üblichen Fertigungsprozess. Dabei wird ein genaues Dosierverfahren mittels spezieller Dispenser ver­ wendet. Das Aufbringen der Cellulosenitratlösung auf die Membran kann sowohl im Kontaktverfahren als auch berührungs­ los erfolgen. Die Cellulosenitratlösung besteht dabei aus ei­ ner Lösung von einem oder mehreren Cellulosenitratpolymeren unterschiedlicher Viskosität in einem oder mehreren Lösungs­ mitteln. Als Lösungsmittel werden Alkohole, wie z. B. Etha­ nol, Isopropan bzw. Ester, wie z. B. Ethylacetat, Methylace­ tat u. s. w. verwendet. Die Wahl des Cellulosenitrattyps und Lösungsmittels hängt dabei in erster Linie von der chemischen Resistenz der verwendeten Basismembran ab, da diese beim Auf­ tragen der Cellulosenitratlösung nicht angelöst werden darf, was zu einem Zusammenbrechen der mikroporösen Struktur führen würde.

Nach dem Aufbringen der Cellulosenitratlösung wird die Memb­ ran bei Raumtemperatur oder vorzugsweise bei höherer Tempera­ tur oder Heißluft getrocknet. Dabei verdampfen die Lösungs­ mittel und das Cellulosenitrat scheidet sich auf der Membran 3 unter Bildung der Spots 5, 6 ab, wobei die mikroporöse Struktur weitgehend erhalten bleibt. Sobald die Membran 3 trocken ist, kann das übliche Aufbringen der Reagenzien 11, 13 erfolgen und zwar an genau den Stellen, wo zuvor das Cel­ lulosenitrat aufgebracht wurde.

Eine einen Analyten 17 enthaltende Probe 18 wird auf den Pro­ beaufnahme-/Vorfilterstreifen 2 aufgebracht, welcher neben seiner Hauptfunktion als Vorfilter auch Reagenzien zur ge­ zielten Konditionierung der Probe (z. B. pH-Wert, Viskosität u. s. w.) enthalten kann. Die Probe 18 wandert dann infolge von Kapillarkräften zu dem Bereich 4 welches das Konjugat- Reagens 9 enthält. Die Probe 2 mobilisiert die im Bereich 4 enthaltenen Konjugat-Partikel, wobei ein mobiler Komplex 19 aus Analyt 17 und Konjugat-Reagens 9 gebildet wird. Die Probe wandert weiter zu dem ersten Spot 5 bzw. der Testlinie 10 hin. Im Bereich des ersten Spot 5 kommt es zu einer Immobilisierung des mobilen Komplexes 19. D. h., beim Erreichen der Testlinie 10 mit dem aufgebrachten aktiven zweiten (capture) Antikörper wird beispielsweise bei Anwesenheit eines Schwan­ gerschaftshormons hcG in der Probe 18 das hcG im gebildeten hcG-Antikörper 1-Konjugat-Komplex erkannt und der gesamte Komplex abgefangen und konzentriert so dass die vorher nicht sichtbare Testlinie gefärbt erscheint. Die Probenflüssigkeit wandert weiter und erreicht den zweiten Spot 6 bzw. die Kon­ trolllinie 12 mit dem aufgebrachten Kontroll-Reagens 13 bzw. dem Kontroll-Antikörper. Dieser ist spezifisch nur zur Erken­ nung des Konjugat-Antikörpers befähigt und immobilisiert so das überschüssige Antikörper 1-Konjugat unter Bildung einer zweiten gefärbten Linie (Positiv-Kontrolle). Ein Überschuss an Antikörper-Konjugat ist stets gegeben, selbst bei stark positiven Proben, die eine intensiv gefärbte Testlinie erzeu­ gen, so dass immer einige Konjugat-Partikel an der Kontroll­ linie abgefangen werden und so ein erkennbares Kontrollsignal ergeben. Dieses Kontrollsignal zeigt an, dass der gesamte Testverlauf normal funktioniert hat und das Tastergebnis richtig ist.

Claims (14)

1. Diagnostikmembran für einen immunchromatographischen Test im Wesentlichen bestehend aus einer mikroporösen Membran aus einem Polymermaterial und einem Polymer mit hohem Binde­ vermögen, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymermaterial ein sehr niedriges Bindevermögen aufweist und dass das Poly­ mer mit hohem Bindevermögen nur in vorbestimmten Spots (5, 6) auf der Membran (3) angeordnet ist.

2. Diagnostikmembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, dass ein erster Spot (5) einen Bereich umfasst, auf dem ein Test-Reagenz (11) anordenbar ist und dass ein zweiter Spot (6) einen Bereich umfasst, auf dem ein Kontroll-Reagens (13) anordenbar ist.

3. Diagnostikmembran nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge­ kennzeichnet, dass die Membran (3) in einem Abstand zu den Spots (5, 6) einen Bereich aufweist, auf den ein Konjugat- Reagens (9) direkt aufbringbar ist.

4. Diagnostikmembran nach einem der Ansprüche 1 bis 3, da­ durch gekennzeichnet, dass die mikroporöse Membran (3) eine Porengröße zwischen 0,02 µm und 30 µm aufweist.

5. Diagnostikmembran nach einem der Ansprüche 1 bis 4, da­ durch gekennzeichnet, dass das Polymermaterial der mikroporö­ sen Membran (3) regenerierte Cellulose, Celluloseacetat, Po­ lyethersulfon, PVDF, Polyamid oder PTFE aufweist.

6. Diagnostikmembran nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da­ durch gekennzeichnet, dass das auf der Membran (3) angeordne­ te Polymer mit hohem Bindevermögen ein Cellulosenitrat- Polymer ist.

7. Diagnostikmembran nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich­ net, dass das Cellulosenitrat-Polymer aus alkohol- und/oder esterlöslichen Cellulosenitrattypen ausgebildet ist.

8. Diagnostikmembran nach einem der Ansprüche 1 bis 7, da­ durch gekennzeichnet, dass die Membran (3) als Teststreifen (1) ausgebildet ist.

9. Diagnostikmembran nach Anspruch 8, dadurch gekennzeich­ net, dass der Teststreifen (1) an einem ersten Ende (8) einen Probeaufnahmestreifen (2) zur Aufnahme einer einen Analyten (17) enthaltenden flüssigen Probe (18) und einen dem Probe­ aufnahmestreifen (2) benachbarten Bereich (4) mit dem Konju­ gat-Reagens (9) aufweist zu dem in einem ersten Abstand der erste Spot (5) mit dem Test-Reagens (11) als Testlinie (10) und in einem zweiten Abstand der zweite Spot (6) mit dem Kon­ troll-Reagens (13) als Kontrolllinie (12) angeordnet ist.

10. Diagnostikmembran nach Anspruch 9, dadurch gekennzeich­ net, dass der Teststreifen (1) an seinem dem ersten Ende (8) abgewandten zweiten Ende (14) der Kontrolllinie (12) in einem Abstand benachbart einen Absorber-Streifen (7) aufweist.

11. Diagnostikmembran nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Teststreifen (1) quer zu seiner Längsrichtung zwischen dem Bereich (4) mit dem Konju­ gat-Reagens (9) und dem ersten Spot (5) mit dem Test-Reagens (11) eine eine Engstelle (16) bildende Verjüngung (15) auf­ weist.

12. Verfahren zur Herstellung einer Diagnostikmembran für einen immunchromatographischen Test, dadurch gekennzeichnet, dass auf eine mikroporöse Membran (3) mit niedrigem Bindever­ mögen ein Polymer mit hohem Bindevermögen in vorbestimmten Spots (5, 6) auf die Membran (3) aufgebracht und anschließend zum immunologischen Nachweis dienende Reagenzien auf die Spots (5, 6) appliziert werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Polymer eine Cellulosenitratlösung auf die Membran (3) aufgebracht und einem Trocknungsvorgang unterzogen wird, so dass sich Cellulosenitrat in den vorbestimmten Spots (5, 6) auf der Membran (3) abscheidet.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekenn­ zeichnet, dass ein Konjugat-Reagens (9) direkt auf die nied­ rigbindende Membran (3) aufgebracht wird.