DE3781335T2 - Immunoassay mit verwendung von kolloidalem gold. - Google Patents
Immunoassay mit verwendung von kolloidalem gold.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunoassays, und im spezielleren betrifft sie einen neuen Immunoassay unter Verwendung von kolloidalem Gold und von Membranen für den Nachweis von Molekülen in Ham oder anderen Körperflüssigkeiten, darunter kleinen Molekülen, wie z. B. jenen, die eine einzelne Epitopstelle enthalten.
- Viele Gesundheitszustände des Menschen können unter Anwendung von Immunoassays auf immunologischer Basis festgestellt werden. Bei solchen Tests verläßt man sich auf die Spezifität der Reaktion zwischen Immunglobulinen, sei es auf monoklonaler oder polyklonaler Basis, und deren jeweiligen Bindungspartnern, welche Haptene, Antigene oder andere Analyten sein können, die allesamt nachstehend kollektiv und austauschbar als Liganden und Liganden-Bindungspartner oder generell als biologisch aktive Moleküle bezeichnet werden. Immunoassays sind Verfahrensweisen, bei welchen die spezifische Bindungsfähigkeit zwischen Liganden und Liganden-Bindungspartnern zum Feststellen des Vorliegens oder Fehlens von Liganden oder deren Bindungspartnern in einer flüssigen Probe ausgenützt wird. Viele solcher Verfahrensweisen sind bekannt, und sie umfassen Sandwich-Assays, Konkurrenzbindungsassays und dgl. mehr. Obgleich im Rahmen der vorliegenden Erfindung die grundlegenden lehren solcher Assays benützt werden, wird es nicht für notwendig erachtet, solche herkömmlicherweise bekannten Verfahrensweisen im einzelnen zu besprechen.
- Horisberger und Rosset, J. Histochem., Cytochem., 25:295-305 [1977] haben einen Agglutinationstest auf Mannan unter Verwendung von kolloidalem Gold als Label beschrieben. Obgleich solche Agglutinationsassays unter Verwendung von kolloidalem Gold kürzlich auf den Markt gebracht worden sind, weisen sie dennoch Nachteile auf, welche mit ihrer Geschwindigkeit, der Schwierigkeit, subjektive Endpunkte durch Farbe festzustellen und dgl. mehr zusammenhängen.
- Ein Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Verwendung von kolloidalem Gold als Label, unter gleichzeitiger Vermeidung der Nachteile, die mit Horisbergers Agglutinationsassays verbunden sind.
- In der US-PS Nr. 4 313 734 wird von Leuvering ein neues Immunoassayverfahren beschrieben, welches die Verwendung von kolloidalen Metallsubstanzen umfaßt. Obgleich im Rahmen dieser Verfahrensweisen die Verwendung eines neuen Labels, nämlich eines kolloidalen Metalles, beschrieben wird, waren alle diese Verfahrensweisen von der Verwendung von Spektrophotometern oder von flammenlosen Atomspektrophotometern zum Identifizieren des Vorliegens des kolloidalen Metalles abhängig, nachdem dasselbe aus der Stelle der immunologischen Reaktion chemisch her ausgelaugt worden war. Demzufolge waren Leuverings Assays von umständlichen Verfahrensweisen und von einer teuren Ausstattung mit Geräten abhängig, um relativ unempfindliche Ergebnisse zu erhalten. Es ist daher nicht überraschend, daß die von leuvering beschriebenen Verfahren des Auslaugens sich auf dem Markt nicht durchsetzen konnten, wo schnelle, empfindliche und wirtschaftliche Verfahrensweisen verlangt werden, welche durchgefunrt werden können, ohne daß man von einer teuren Ausstattung mit Geräten abhängig ist.
- Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung eines Labels aus kolloidalem Gold, wie dasselbe von Leuvering beschrieben worden ist, aber in der Benützung des Lebels in einer völlig neuen Verfahrensweise, mit welcher alle Mängel der Leuvering-Verfahrensweisen überwunden werden.
- In der auf Janssen übertragenen, europäischen Patentanmeldung 0 158 746 sind Methoden von Blot-Overlay-Assays beschrieben, bei denen man sich auf eine Diffusion zur Oberfläche verläßt. Zwar stellen diese Methoden eine dramatische Verbesserung gegenüber Leuvering dar, doch kranken die beschriebenen Methoden noch immer an den übermäßigen Anforderungen, die sie an die Zeit stellen, um eine minimal annehmbare Empfindlichkeit zu erzielen. Janssen hat auch neue Techniken zum Verbessern der Empfindlichkeit oder der Sichtbarmachungsfähigkeit von Testergebnissen durch innovative Verfahrensweisen der Silberverstärkung beschrieben.
- Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, noch weitere Verbesserungen gegenüber den Methoden von Janssen sowohl hinsichtlich der Empfindlichkeit als auch hinsichtlich der Testgeschwindigkeit zu schaffen.
- In der US-PS Nr. 3 888 629 hat Bagshawe eine Immunoassay-Verfahrensweise beschrieben, bei welcher Radioisotope mit einer Patrone benützt werden, welche Patrone eine Reaktionsoberfläche aufweist, die in Berührung mit einem absorbierenden Material steht, um Flüssigkeiten durch die Membran zu ziehen. Obgleich fur die Einrichtung von Bagshawe beansprucht wird, daß sie eine hohe Empfindlichkeit aufweist, so stellt sie dennoch eine weniger wünschenswerte Lösung insofern dar, als man sich dabei auf Isotopen-Labels stützt. Solche Labels verlangen eine hochentwickelte Nachweisausrüstung zum Feststellen des Vorliegens der Labels auf der Reaktionsoberfläche. Außerdem verursachen Radioisotope, wie wohlbekannt ist, wesentliche Schwierigkeiten hinsichtlich der Gesundheit und des Vorgehens, wodurch solche Verfahrensweisen generell viel weniger wünschenswert werden.
- Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sollen die mechanischen Aspekte der Bagshawe-Einrichtung verbessert und die mit Isotopenverfahrensweisen generell verbundenen Nachteile vermieden werden.
- In den für Deutsch et al. ausgegebenen US-PS'en 4 235 601 und 4 361 537 sind verwandte Testeinrichtungen zum Feststellen einer besonderen Eigenschaft einer Probe, wie z. B. zum Bestimmen des Vorliegens einer Substanz in einer flüssigen Probe, beschrieben. Bei der Einrichtung gemäß Deutsch et al. wird ein Streifenelement verwendet, welches eine Mehrzahl von Zonen für die Aufnahme einer flüssigen Probe oder für die Einverleibung verschiedener Reagenzienkomponenten aufweist. Ein Ende des Streifenelementes wird dann in eine Entwicklerflüssigkeit getaucht, welche durch die Kapillargänge nach oben fließt, wodurch sie mit der Probe in Berührung kommt und die Probe in einer fortgesetzten Aufwärtsrichtung durch andere Zonen befördert, welche verschiedene Reagenzien enthalten. Eine solche Zone könnte z. B. ein markiertes Reagens enthalten (z. B. die Zone 14 in Figur 1), und eine andere Zone (z. B. die Zone 15 in der Figur 1) könnte ein immobilisierendes Element, wie z. B. einen Antikörper zum Festhalten des Labels an dieser Stelle enthalten, wenn die auf die erste Zone 13 aufgebrachte Probe dasjenige Element enthält, für welches das Label und der immobilisierte Antikörper spezifisch waren. Somit sind alle iumunologisch reaktiven Komponenten auf dem Streifenelement vorrätig, wobei das einzige flüssige Reagens die Entwicklerflüssigkeit ist, welche dahingehend beschrieben wurde, daß sie eine wässerige Lösung von Natriumbarbital, Chlorwasserstoffsäure, Thimerosal und Dinatriumethylendiamintetraacetat umfaßt.
- Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine ähnliche Methode wie Deutsch et al. anzuwenden, jedoch die Notwendigkeit einer Verwendung komplizierter Entwicklerlösungen zu vermeiden, wie dieselben von Deutsch et al vorgeschrieben werden, dabei aber überlegene Labelsysteme zu verwenden.
- In der EPA 164 194 ist ein ähnliches System unter Verwendung eines Streifenelementes beschrieben, wobei jedoch die Neuheit dieser Erfindung einzig und allein auf die Verwendung von Laserstrahlen zum Ausschneiden der Streifenelemente gerichtet zu sein scheint, wodurch eine gleichförmige Höhe der sich vorwärtsbewegenden Flüssigkeitsfront gewährleistet ist.
- Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung neuer Immunoassay-Methoden, welche im wesentlichen unempfindlich gegenüber den Verfahren der Streifenerzeugung sind und somit die die lehren der EPA 164 194 bildenden Methoden nicht benötigen.
- In der EPA 143 574 ist ein Streifenelement-Immunoassay-System beschrieben, bei welchem ein Bindemittel zum Aggregieren von Erythrozyten (RBCs) an der Luft/Flüssigkeitsgrenzfläche auf dem aufsaugenden Element verwendet wird. Bei diesem Assay verläßt man sich auf herkömmliche ELISA-Techniken, und der Verfasser geht so weit, auf Seite 22 zu erwähnen, daß einzelne Labels nicht ausreichend sein werden, um die gewünschte Empfindlichkeit zu erzeugen, und daß daher Enzym-Labels erforderlich seien, von denen ein jedes eine Mehrzahl von feststellbaren Molekülen liefern kann.
- Wieder ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, Immunoassays zur Verfügung zu stellen, bei denen ähnliche Streifenelemente benützt werden, welche aber keine Enzym-Labels erfordern, und welche noch immer visuell ablesbar sind.
- Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, Testverfahren zur Verfügung zu stellen, welche zur Gänze visuell interpretiert werden können, ohne daß man sich auf eine Ausstattung mit Geräten verlassen müßte, welche aber auch im Zusammenhang mit einer Ausstattung mit Geräten angewendet werden können, falls eine höhere Empfindlichkeit erwünscht ist, oder in alternativen Quantifizierungsverfahrensweisen angewendet werden können.
- Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, Assays zur Verfügung zu stellen, welche in wirtschaftlicher Weise erzeugt werden können, welche rasch durchgeführt werden können, und bei denen die erforderliche Empfindlichkeit erreicht wird, welche notwendig ist, damit der Test in allen medizinischen Umgebungen, und zwar sowohl für den stationären als auch für den chargenweisen Gebrauch, eine zufriedenstellende leistung erbringen kann.
- In Übereinstimmung mit den Aspekten und Zielen der vorliegenden Erfindung wird eine neue Immunoassay-Verfahrensweise zur Verfügung gestellt, nämlich ein Verfahren zum Bestimmen des Vorliegens von Antikörpern oder Liganden, wie z. B. Drogen oder Rauschgift in flüssigen Proben, wie z. B. Harn, Zerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Vollblut, Blutkomponenten oder anderen wässerigen Körperausflüssen bzw.-ausscheidungen oder löslich gemachten Ausflüssen bzw. Ausscheidungen.
- Der Test wird mit einer Matrixoberfläche durchgeführt, die von einem gewundenen Pfad durchsetzt wird, und die zwei Enden hat, und die entweder einen Liganden oder den Liganden-Bindungspartner aufweist, der innerhalb der Membran immobilisiert ist, je nachdem, ob ein Test vom Typus eines Konkurrenztests oder vom Typus eines Sandwichtests durchgeführt werden soll. Die Matrixoberfläche oder Membran ist vorzugsweise ihrer Natur nach aufsaugend, wodurch Kapillargänge für das Fließen von Flüssigkeiten durch die Membran zur Verfügung gestellt werden, wodurch die Flüssigkeit mit dem Liganden oder Liganden-Bindungspartner in Berührung gebracht wird, der innerhalb der Membran an einer oder an mehreren Stellen immobilisiert ist. Anschließend wird ein flüssiges Reagens zur Verfügung gestellt, welches einen Liganden-Bindungspartner oder einen Liganden enthält, wobei dieser Liganden-Bindungspartner oder Ligand direkt oder indirekt mit kolloidalem Gold markiert ist; ein Ende des Membranstreifens wird mit der Probe und - gleichzeitig oder darauffolgend - mit dem flüssigen Reagens in Berührung gebracht, wodurch eine immunologische Reaktion in dem Maße durchgeführt wird, als die Probe und das Reagens von dem einen Ende zu dem anderen Ende des Membranstreifens wandern. Die Membran wird auf das Vorliegen von Farbe beobachtet, deren Abstand von dem einen Ende mit dem Vorliegen von kolloidalem Gold und des Liganden in der Probe korrelierbar ist.
- In höchstem Maße bevorzugt werden die den Liganden enthaltende Probe und ein mit kolloidalem Gold markiertes, biologisch aktives Molekül vorvermischt und dann mit einem Ende des aufsaugenden Streifens in Berühung gebracht. Das Gemisch wird dann durch Kapillarwirkung durch die Matrix gezogen, wobei das Lokalisieren von kolloidalem Gold in jenen Flächenteilen zugelassen wird, welche einen immobilisierten Bindungspartner aufweisen, wahrend ungebundenes kolloidales Gold im Verlaufe des Verfahrens weggewaschen wird. Bei Immunglobulintests wird es in höchstem Maße bevorzugt, daß die Probe und das mit dem kolloidalen Gold markierte Reagens nacheinander, mit dazwischengeschobenen Waschstufen, hinzugefügt werden. Überraschenderweise führt das in der Matrix zurückbleibende, kolloidale Gold zu dem Vorhandensein eines sehr starken, visuell feststellbaren, gefärbten Flecks.
- Erfindungsgemäß wird auch ein Kit für den Gebrauch in einem Test für den Nachweis eines liganden in einer flüssigen Probe zur Verfügung gestellt, welcher Kit umfaßt: eine Membran, welche einen Liganden-Bindungspartner oder einen Liganden zum Binden an den Liganden oder an den Liganden-Bindungspartner aufweist, welcher Liganden-Bindungspartner oder Ligand kontinuierlich, durch die gesamte Membran hindurch, oder in getrennten Zonen immobilisiert ist; und einen Behälter, der einen mit kolloidalem Gold markierten Liganden oder Liganden-Bindungspartner zum Binden an den Liganden-Bindungspartner auf der Membran in einem Wettbewerbstest, oder zum Binden an den Liganden in der flüssigen Probe in einem Sandwich-Test, enthält.
- Als Ergebnis der vorliegenden Erfindung werden weniger flüssige Reagenzien als in herkömmlichen Assays benötigt, nämlich z. B. ein Reagens mit einer fakultativen Waschflüssigkeit, im Gegensatz zu vier oder noch mehr Reagenzien, welche für ELISA-Verfahrensweisen erforderlich sind. Zum Ablesen der Ergebnisse sind keine Meßgeräte erforder lich, doch können dieselben fakultativ zum Messen des Vorliegens von kolloidalem Gold auf der Basis von dessen Fähigkeit zum Streuen oder Absorbieren von Licht verwendet werden. Darüberhinaus kann das gesamte Vorgehen, einschließlich sämtlicher Handhabungsstufen und einer einzelnen Inkubationsstufe, im allgemeinen in kürzerer Zeit als vergleichbare Assays durchgeführt werden, wobei aber eine hohe Empfindlichkeit noch immer leicht erreichbar ist. Im Falle von LH (Luteinisierendem Hormon) wird routinemäßig eine Empfindlichkeit von 20 mIE/ml Harn, oder eine noch bessere Empfindlichkeit, mit einer aus zwei bis drei Tropfen bestehenden Probe und einer Gesamtzeit für die Durchführung des Tests von annähernd 5 min erreicht, einschließlich der Zeitspannen für das Inkubieren und für die Handhabung. Ein weiterer, sich ergebender Vorteil ist die Eliminierung von mit dem Inkubieren in Beziehung stehenden Fehlern, weil bei Tests auf Antigene und Haptene keine Waschstufen erforderlich sind. Weiterhin führt die Beendigung der Testergebnisse zu einern stabilen Endpunkt.
- Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben überraschenderweise entdeckt, daß die keineswegs naheliegende Kombination einer Streifenmatrix oder Membranoberfläche mit Immmnoassays, bei welchen kolloidales Gold als Label verwendet wird, zu äußerst raschen und empfindlichen Assays führen kann, welche Ergebnisse liefern, die visuell feststellbar sind. Ein solcher Assay ist besonders nützlich für große und kleine Moleküle, sowie für Antikörper, er ist jedoch nicht darauf beschränkt. Solche Tests sind bisher nicht möglich gewesen. Dies trifft besonders deshalb zu, weil bei herkömmlichen Oberflächenassays einfach nicht genügend kolloidales Gold zur Verfügung steht, um visuell feststellbar zu sein, und weil frühere Methoden ELISA-Techniken oder Meßgeräte für den Nachweis fluoreszierender Labels erfordert haben. Überraschenderweise stellt eine Membranoberfläche viele "Lagen" zur Verfügung, welche, eher unerwartet, eine ausreichende Konzentration von kolloidalem Gold zur Verfügung stellen, damit dasselbe visuell feststellbar ist. Diese Beobachtung hat eine herausragende Rolle im Zusammenhang mit einem Membran-Assay unter Verwendung von kolloidalem Gold ("colloidal gold membrane assay", COGMA) gespielt, welcher Assay in der gleichzeitig mit der vorliegenden Patentanmeldung unt unter Beanspruchung der Priorität der USSN 872 355 - ORD 63 eingereichten europäischen Patentanmeldung 87305026.4 (Veröffentlichungsnummer 0 258 963) beschrieben ist. Zum Unterschied von jenem Test erreicht man mit dem vorliegenden Test im allgemeinen eine höhere Empfindlichkeit je ml Probe, weil die gesamte Probe an Flächenteilen von immunologischer Komponente in dem Teststreifen vorbeifließt und nicht nur durch gewisse Abschnitte, wie bei dem COGMA, fließt. Als ein damit zusammenhängender Vorteil wird weniger von der mit kolloidalem Gold markierten Komponente benötigt, um eine vergleichbare Empfindlichkeit zu erzielen.
- Der vorliegende Test wird am wirksamsten unter Verwendung eines von einem gewundenen Pfad durchsetzten, z. B. aufsaugenden, Membranstreifens durchgeführt, welcher den kapillaren Fluß von Flüssigkeiten durch diesen gewundenen Pfad ermöglicht, und an welchem Membranstreifen immunologisch wirksame Komponenten befestigt werden können. Unter Verwendung einer solchen von einem gewundenen Pfad durchsetzen Membran wird eine Reaktionskinetik ermöglicht, welche normalerweise in der Lösungsphase ablaufenden Reaktionen zugeordnet wird; und dies trotz der Tatsache, daß eine der immunologischen Reaktionen an einer Festphasenoberfläche stattfinden. Außerdem gestatten solche Materialien eine Flexibilität hinsichtlich der Ausrichtung, weil die Strömungsrichtung nicht kritisch ist. Obgleich eine Anzahl von Typen von Filtermembranen verwendet werden können, darunter z. B. aktiviertes "Whatman 31-ET- Chromatography Paper", aktiviertes "Nylon 66" (z.B. "Biodyne " von Pall), und aktiviertes PVDF (Polyvinylidenfluorid, wie z.B. "Immobilon " von Millipore), ist das in höchstem Maße bevorzugte Material - wegen der leichtigkeit der Handhabung - das Whatman-Material.
- Unter Verwendung von LH (Luteinisierdendem Hormon) als Beispiel für die Anwendung der vorliegenden Erfindung in einem Sandwich-Assey-Format, würde man LH-spezifischen Antikörper an der Membran befestigen. Obgleich die Membran vorzugsweise ein Streifen mit Abmessungen wie z.B. 5 x 90 mm ist, läßt die vorliegende Erfindung große Freiheit hinsichtlich der physikalischen Konstruktion. Der Anti-LH-Antikörper kann entweder kontinuierlich, durch den gesamten Membranstreifen hindurch, oder in gleichmäßig voneinander beabstandeten Zonen längs des Membranstreifens befestigt werden.
- Die Probe, wie z. B. Harn, in welchem das Vorhandensein von LH vermutet wird, wird mit einem flüssigen Reagens vermischt, welches einen (direkt oder indirekt, über einen Zwischen-Antikörper oder über eine andere Bindung) mit kolloidalem Gold markierten Anti-LH-Antikörper enthält, welcher spezifisch für eine andere Epitopenstelle als der in der Membran immobilisierte Antikörper ist.
- Das Gemisch aus Probe und Reagens wird dann im Idealfall auf ein Ende der freigelegten Membran aufgebracht und durch den Streifen wandern gelassen. Obgleich bei dem vorliegenden Test eine außerordentliche Variation hinsichtlich des Volumens möglich ist, so ist es dennoch bemerkt worden, daß vorteilhafterweise - zum Verbessern der Empfindlichkeit des Tests - ansteigende Volumensanteile verwendet werden können; welche nur durch das Absorptionsvermögen der Membran und die Menge des Reagens begrenzt sind.
- Unter Fortsetzung des LH-Beispiels wird das im Harn von Frauen vorhandene (und im allgemeinen der einsetzenden Ovulation zugeordnete) LH während der Vermischungsstufe von dem markierten Antikörper gefangen und wird dann innerhalb der Membran an den darin immobilisierten Anti- LH-Antikörpern befestigt. Die Herstellung solcher Antikörper von entweder polyklonaler oder monoklonaler Natur, ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt und braucht hier nicht im einzelnen beschrieben zu werden. Vom Standpunkt der Spezifität und der Herstellung aus werden die in höchstem Maße bevorzugten Antikörper monoklonale Antikörper sein, welche nach den Verfahren von Köhler und Millstein hergestellt worden sind, welche Verfahren zuerst 1975 beschrieben wurden und über welche umfassend in sonstigen Publikationen berichtet worden ist.
- Das nicht-gebundene, mit kolloidalem Gold markierte Reagens sowie die restlichen Teile der Probe, einschließlich des flüssigen Anteiles der Probe und der Nicht-LH-Liganden, werden durch den restlichen Teil der Membran gezogen. Als Ergebnis wird man das kolloidale Gold (eine blaurote Farbe) über einen Abstand von dem Ende des Streifens beobachten können, auf welches die Probe aufgebracht worden ist (z. B. von dem Ende, das in das Probe-Reagens-Gemisch eingetaucht wurde). War der immobilisierte Antikörper kontinuierlich, durch den gesamten Streifen hindurch, aufgebracht worden, dann wird ein gewisser Teil des Streifens eine kontinuierliche Farbe zeigen. Die Länge der Membran, welche Farbe zeigt, wird der Menge des in der Probe vorhandenen LH proportional sein. In ähnlicher Weise werden verschiedene Zonen "Stufen" von Farbe zeigen, und die Anzahl der Fartstufen oder -zonen kann mit der LH-Konzentration korreliert werden. Solche Zonen werden insofern bevorzugt, als sie als Konzentrationsmechanismen der markierten Komponente wirken, wodurch es ermöglicht wird, niedrigere Konzentrationen von markierten Komponenten zu verwenden, während gleichzeitig der Kontrast zwischen den Zonen und den Hintergrundsflächenteilen auf dem Streifenelement beibehalten oder sogar verstärkt wird. Als ein damit in Beziehung stehender Vorteil werden Waschstufen vermieden, weil die markierte Komponente durch die Probe verdünnt wird, die zur Gänze durch die Reaktionszone fließt. Mehr LH in der Probe wird zu einem größeren Abstand oder zu einer größeren Anzahl gefärbter Zonen sowie zu einer größeren Farbintensivitat in den gefärbten Zonen führen.
- Da das erhöhte LH, welches in größeren Konzentrationen als den normalen Hintergrundsengen (welche z. B. gleich oder weniger als 10 mIE/ml Harn betragen) vorliegt, während einer Anzanl (z.B. 6-9) von Tagen in der Mitte des Menstruationszyklus überwacht werden sollte, wird ein bevorzugtes Handelsprodukt oder ein bevorzugter Kit eine gleiche Anzahl (6-9) Membranen plus eine oder mehrere Reagenzienflaschen, welche das mit dem kolloidalen Gold markierte Reagens enthält bzw. enthalten, und im Idealfall auch Gebrauchanweisungen umfassen. Der Kit kann auf neun Tests für solche Frauen erweitert werden, welche unter unregelmäßigen Menstruationszyklen leiden. Gewünschtenfalls kann auch eine zusätzliche positive Kontrolle (LH, das entweder direkt mit kolloidalem Gold markiert ist, oder das für das Vermischen mit mit kolloidalem Gold markiertem Antikörper-Reagens zur Verfügung gestellt wird) mit Teststreifen zur Verfügung gestellt werden. Alternativ könnte eine interne Kontrolle zur Verfügung gestellt werden, wobei auf dem Membranstreifen eine zusätzliche Zone oder Bande von LH vorgesehen ist. Gewünschtenfalls kann das LH (oder ein äquivalenter Ligand) auf bekannte Konzentrationen kalibriert werden, um eine Standardfarbvergleichszone zur Verfügung zu stellen. Solche internen Vergleichszonen sind zusätzliche, neue Aspekte der vorliegenden Erfindung. Obgleich man nunmehr eine fakultative Waschstufe zum Entfernen ungebundenen Materials anwenden kann, wird bei der aufgrund verfahrensmäßiger Einfachheit in höchstem Maße bevorzugten Ausführungsform vorteilhafterweise Zeit gespart und eine solche Waschstufe weggelassen, da dieselbe zur Erzielung der klinisch relevanten Empfindlichkeitsbereiche unnötig ist.
- Versuche haben gezeigt, daß eine wesentliche Vielfalt von Teilchengrößen des kolloidalen Goldes verwendet werden kann, wobei diese Teilchengrößen aufgrund des Verhältnisses zwischen den bei 540 nm und 600 nm gemessenen optischen Dichten gemessen werden, darunter solche Verhältnisse von etwa 1,7 (große Teilchen) bis zu solchen von 3,0 (kleine Teilchen), wobei ein bevorzugtes Verhältnis in einen Bereich von 2 bis 2,5 fällt. Obgleich die Verhältniszahl 1,7 der Teilchengröße der größten, untersuchten Teilchen zugeordnet wird, besteht kein Grund für die Annahme, daß noch größere Teilchen, auch wenn dieselben schwieriger herzustellen sind, nicht ebenfalls in befriedigender Weise verwendet werden könnten. Kolloidale Goldteilchen, welche in den bevorzugten Bereich für die Größe oder das optische Verhältnis fallen, können, wenn sie sich in Lösung befinden, als rötlich-blaue Farbe visuell beobachtet werden. Bevorzugte Verfahren zur Herstellung kolloidalen Goldes und zu dessen Bindung an Immunglobuline werden nachstehend beschrieben.
- Obgleich gemäß dem besten Modus das direkte Markieren des Liganden oder Liganden-Bindungspartners mit kolloidalem Gold vorgesehen ist, ist es ebenso vorgesehen, daß ein gleichwertiges indirektes Markieren angewendet werden kann, und unter gewissen Umständen sogar bevorzugt sein kann. Für ein solches indirektes Markieren wurde man typischerweise ein drittes Immunglobulin verwenden, welches selbst mit dem kolloidalen Gold markiert ist und mit dem zweiten Immunglobulin spezifisch reaktiv ist, welches letztgenannte seinerseits spezifisch für den nachzuweisenden Liganden ist. Solche Verfahren sind besonders nützlich für Antikörpertests unter Verwendung von mit kolloidalem Gold markiertem Anti-Globulin. Auch hier gilt wieder, daß Verfahrensweisen des indirekten Markierens Gegenstände bilden, mit welchen erfahrene Praktiker auf diesem Fachgebiet durchaus vertraut sind.
- Obgleich es in höchstem Maße bevorzugt wird, daß man den Membranstreiren während einer bestimmten Zeitspanne, z. B. 5 min, entwickeln läßt, nachdem dieser Streifen mit dem Gemisch aus der den Liganden enthaltenden Probe und dein mit kolloidalem Gold markierten Reagens in Berührung gebracht worden ist, sind keine speziellen Inkubationsbedingungen erforderlich, wobei die Zimmertemperatur vollkommen angemessen ist. Die Ergebnisse können dann zu irgendeinem späteren, praktischen Zeitpunkt direkt beobachtet werden. Es leuchtet ohneweiteres ein, daß bei Immunglobulintests vorzugsweise nacheinander die Zugabe der Probe, eine Zwischenwaschstufe und die Zugabe des mit kolloidalem Gold markierten Reagens zu der Streifermembran vorgenommen werden.
- Man wird feststellen, daß infolge der vorliegenden Erfindung weniger flüssige Reagenzien erforderlich sind, um einen Test durchzuführen (in der Tat wird für die meisten Assays nur ein Reagens mit einer biologisch aktiven Komponente erforderlich sein), und daß auch weniger Stufen durchzuführen sind. Demzufolge kann die typische Reaktion oft in weniger als 5 min für Liganden, oder 10 min für Antikörper, durchgeführt werden, wobei noch immer ein Ausmaß von Empfindlichkeit erreicht wird, das mit den besten herkömmlichen Tests vergleichbar ist, wobei aber, im Gegensatz zu diesen anderen Assays, mit erstaunlicher Geschwindigkeit visuell feststellbare, eindeutige Ergebnisse geliefert werden.
- Die vorliegende Erfindung bietet auch noch andere Vorteile. So brauchen weder die Reagenzien noch die ein biologisch aktives Molekül enthaltende Membran auf Zimmertemperatur zu sein, wenn der Test durchgeführt wird. Dies steht in völligem Kontrast zu herkömmlichen ELISA-Verfahrensweisen, welche hochgradig temperaturempfindlich sind.
- Durch die Erfindung werden weiterhin jene Nachteile vermieden, welche mit ELISA-Techniken verbunden sind, darunter der kritische Charakter, welcher dem zeitlichen Koordinieren der Stufen, dem pH-Wert und der Temperatur der Lösungen zukommt. Im Gegensatz hierzu werden solche Beschränkungen durch die vorliegende Erfindung vermieden.
- Vielleicht besteht der überraschendste Aspekt der vorliegenden Erfindung in der Tatsache, daß eine positive Reaktion überhaupt visuell feststellbar ist. Obgleich dieser Aspekt der Erfindung bis jetzt von den Erfindern der vorliegenden Erfindung noch nicht voll durchschaut wird, so wird dennoch angenommen, daß die viellagige Natur der Membran zusammen mit den Lichtstreuungseigenschaften des kolloidalen Goldes zu einer Akkumuliernng, wenn nicht überhaupt einer Verstännung der visuellen Wirkung des Vorliegens von kolloidalem Gold führt.
- Auf andere Nicht-Antikörper-Moleküle kann in ähnlicher Weise wie auf das LH geprüft werden. Beispielsweise können kleine Moleküle mit einer einzigen Epitopenstelle nach Verfahrensweisen eines Konkurrenzassays nachgewiesen werden. Solche kleinen Moleküle umfassen Drogen oder Rauschgift, Digoxin, Theophyllin und viele andere, deren Vorhandensein klinisch relevant ist. Im Falle des Theophyllins (THEO) in einer Blutprobe würde der Test wie folgt durchgeführt werden: Spezifische Anti- THEO-Antikörper werden in schmalen Bändern, welche in gleichem Abstand voneinander längs der Längenerstreckung des Streifens angeordnet sind, kovalent an den Membranstreifen gebunden. Ein Ende des Membranstreifens, welcher somit befähigt ist, Theophyllin immunologisch zu binden, wird in ein Röhrchen eingetaucht, welches eine vorvermischte Suspension einer Blutprobe und von mit kolloidalem Gold markiertem THEO enthält. Das nicht-markierte THEO aus der Probe wird somit mit dem mit kolloidalem Gold markiertem THEO um die Antikörper-Bindungsstellen auf dem Papier konkurrieren. Demzufolge ist das Ausmaß des visuell feststellbaren Farbsignals der Theophyllinkonzentration in der Probe direkt proportional.
- Alternativ kann man das Theophyllin in schmalen Bändern (kreuzweise) längs der gesamten Längenerstreckung des Streifens direkt an den Membranstreifen binden. Alternativ kann das biologisch aktive Molekül, sowohl bei diesem als auch bei dem vorhergehenden Beispiel, kontinuierlich längs der Längenerstreckung des Membranstreifens, statt in Zonen, befestigt werden. Ein Ende des Membranstreifens, welcher befähigt ist, Anti-Theophyllin-Antikörper immunologisch zu binden, wird in ein Röhrchen eingeführt, welches eine vorvermischte Suspension der unmarkiertes Theophyllin enthaltenden Blutprobe und des mit kolloidalem Gold markierten Anti-Theophyllin-Antikörpers enthält. Auch hier gilt wieder, daß das Ausmaß des visuell feststellbaren Signals der Theophyllinkonzentration in der Probe direkt proportional ist.
- In einer Reihe von Fällen wird das Vorliegen von Antikörpern dazu benützt, festzustellen, ob das zu prüfende Individuum der Einwirkung krankheitserregender Organismen ausgesetzt war. Solche Tests umfassen z.B. Rubella-IgG, Rubella-IgM, Toxoplasmose-IgG und -IgM, Cytomegalovirus-IgG und -IgM, HTLV III, Anti-EBNA, Mononukleose, Anti-Core, HAA, Herpes, und Anti-Streptolysin O. Generell werden Antikörpertests im wesentlichen in gleicher Weise wie der Test auf kleine Moleküle insofern ausgeführt, als der Ligand oder das Antigen selbst auf der Membran immobilisiert wird, um mit dem Antikörper in der Patientenprobe zu reagieren. Das mit kolloidalem Gold markierte Reagens kann dann, je nach Zweckdienlichkeit, in geeigneter Weise als ein Anti-Human- IgG oder -IgM ausgewählt werden. Das Ausmaß der Farbe wird dann der Menge des in der Probe vorhandenen Antikörpers proportional sein.
- Die vorliegende Erfindung kann auch zum Nachweisen des Vorliegens von infektiösen Krankheitserregern, darunter Mikroorganismen, wie z.B. Streptococcus, Chlamydia, Gonococcus, oder von viralen Organismen, wie z. B. Hepatitis-Antigenen und dgl., angewendet werden.
- Die in höchstem Maße bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die Fähigkeit aufweisen, daß man damit unter Verwendung der gleichen Probe Mehrfachtests durchführen kann. Bei solchen Ausführungsformen wird eine Mehrzahl von Zonen, und zwar jede mit einer unterschiedlichen Spezifität für Probenliganden oder -antikörper, verwendet. Vorgesehen ist das gleichzeitige Durchführen eines Tests auf in Blutproben vorhandene Antikörper, welche spezifisch für das Hepatitis- core-(= Binnenkörper-)Antigen, für HTLV-III (Aids), CMV und dgl. mehr sind. Ein vorzügliches Beispiel stellt die sogenannte TORCH-Reihe (Toxoplasmose, Rubella, Cytomegalovirus und Herpes) dar. In solchen Fällen sollte(n) die Kontrollzone(n), falls eine solche verwendet wird bzw. falls solche verwendet werden, vorzugsweise am oberen Ende (d.h. am weitesten von der Probezugabe entfernt) angeordnet sein, um zu gewährleisten, daß alle vorhergehenden Zonen richtig funktioniert haben und nicht in Abwesenheit von Gold neutralisiert worden sind. Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden aufgrund des Studiums der Begleitbeispiele klar verständlich sein.
- Alle Glaswarenoberflächen, die mit verkauftem kolloidalem Gold in Berührung kamen, wurden unter Verwendung von 1 %igem Silwet 720 (Union Carbide) dadurch silikoniert, daß man die betreffende Glasware während 10 min darin eintauchte und dann mit destilliertem Wasser (D.W.) abspülte. ("Silwet 720" ist eine eingetragene Handelsmarke.) 1 Liter filtrierten destillierten Wassers wurde während wenigstens 10 min auf 100º C erhitzt. Dann wurden 10 ml einer 1 %igen Goldchloridlösung (Aldrich) in D.W., welches durch Milli-Q filtriert worden war, zu dem Reaktor hinzugefügt und während 1 min vermischt. ("Milli-Q" ist eine eingetragene Handelsmarke.) 10 ml von 34 mM Natriumcitrat oder 10 ml von 64 mM Natriummalat oder Apfelsäure mit einem pH-Wert von 4,2 wurden zu dem Reaktor hinzugefügt, um als Reduktionsmittel zu wirken, und das rasche Mischen wurde während 20 min fortgesetzt. Eine Farbänderung zeigte die erfolgreiche Bildung eines Goldsols an. Die Wärmequelle wurde entfernt, und der Reaktor wurde auf 15 bis 30º C abgekühlt. 1 ml von 1 %igem PEG 20.000 wurde hinzugefügt, und der pH-Wert des Sols und des Reaktors würde durch Zugabe von 0,1 M K&sub2;CO&sub3; auf 7,1 ± 0,1 eingestellt. Die optische Dichte (O.D.) des kolloidalen Goldes kann bei 540 nm und bei 600 nm gemessen werden. In dieser Form ist das Goldsol für das Kuppeln mit dem Antikörper geeignet. Das so erzeugte kolloidale Gold hat eine Teilchengröße von etwa 40 nm bis etwa 50 nm, welche aufgrund des OD-Verhältnisses bei 540/600 bestimmt wurde, wobei diese Teilchengröße von den Bedingungen des chemischen Reduzierens abhängt.
- Der Antikörper wurde unter Verwendung eines Dialyseschlauches mit Ausschluß von Molekulargewichten von 12.000 bis 14.000 und von 300 ml Lösung/ml des Antikörpers während 18 h gegen eine 0,01 M HEPES-(N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure)-Pufferlösung mit einem pH- Wert von 7,1 dialysiert und wurde dann durch ein 0,45 um-SWINEX -Filter filtriert. Die Proteinkonzentration des Antikörpers kann dadurch erhalten werden, daß man die Absorption des Antikörpers bei 280 nm mißt; und der Antikörper wird auf eine Konzentration von 3-4 mg/ml mit 0,01 M HEPES vom pH 7,1 verdünnt, um ein optimales Adsorptionskuppeln, welches mit dem zu markierenden Antikörper bestimmt wird, zwischen dem Antikörper und dem kolloidalen Goldsol zu erzielen. Während sich das Sol noch in dem Reaktor von Beispiel 1 befand, würde der so gefilterte und verdünnte Antikörper zugesetzt, während das Sol bei Zimmertemperatur gerführt wurde. Das Rühren würde während annähernd 30 min fortgesetzt, wonach (0,1 x Solvolumen) ml des Puffers (D) mit einem Gehalt von 0,01 M HEPES; 0,3 M D-MANNIT; 0,05 % PEG 20,000; 0,1 % BSA VON RIA-Qualität und 0,05 % Natriumazid zugesetzt wurden. Das Rühren wurde bei Zimmertemperatur während 30 Minuten fortgesetzt. Dann würde die Lösung in eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge überführt, zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Dann wurde das Sol viermal unter Verwendung des obgenannten Puffers D gewaschen und erneut auf 1/10 der Ausgangssolkonzentration suspendiert, durch eine 0,45 um-Membran filtriert und in Polypropylen bei 2-8º C gelagert.
- Man mengt eine äquivalente Gewichtsmenge von BSA (100 mg BSA je 100 mg Sol) einem gemäß Beispiel 1 hergestellten Sol bei, dessen pH-Wert zuvor auf 6,0 eingestellt worden war. Es wird während 2 h bei Zimmertemperatur gerührt. Dann filtriert man durch ein 0,22 um-Membranfilter, um große Teilchen zu entfernen. Man mißt die OD bei 540 und 600 nm und berechnet das OD-Verhältnis; das OD 540/OD 600 eines annehmbaren Materials sollte 2,50 ± 0,30 betragen. Man nimmt 200 ml des so hergestellten BSA-Sols, zentrifügiert (25.000 x g während 30 min) und wäscht einmal mit destilliertem Wasser. Man vermischt die gewaschenen Teilchen mit 1 % (Gew./Vol.) von Glutaraldehyd und rührt während 2 h. Man zentrifugiert (25.000 x g während 30 min) und wäscht dreimal mit destilliertem Wasser. Man vermischt die aktivierten und gewaschenen Teilchen mit 2 mg des entsprechenden, gereinigten monoklonalen IgG in Phosphatpuffer van pH 7,4 und rührt über Nacht bei 2 bis 8º C. Man fügt 2,5 mg Natriumborhydrid hinzu, um das Kuppeln zu stabilisieren. Man rührt während 30 min und schreckt dann mit 5 ml Glycin-BSA-Puffer vom pH 8,0 ab. Man zentrifugiert (25.000 x g während 30 min) und wäscht dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (vom pH 8,0). Man suspendiert erneut und stellt die Farbstoffkonzentration mit Puffer vom End-pH 8 (50 mM Triethanolamin, 100 mM NaCl, 0,2 % BSA, 0,1 % NaN&sub3;) auf eine O. D. von etwa 10 bei 540 nm ein. Man filtriert durch ein 0,22 um-Filter und lagert bei 2-8º C.
- Whatman-31ET-Papier (90 x 152 mm) wurde in Pyridinlösung (Baker) mit einem Gehalt an 0,2 M 1,1'-Carbonyldiimidazol eingetaucht und bei Zimmertemperatur während 60 min inkubiert. Der Membranstreifen wurde dann mit Tetrahydrofuran (Baker) gewaschen. Die Membran wurde auf eine Glasplatte (TLC-Platte) gelegt und zur leichteren Handhabung mit einem Band befestigt. Unter Verwendung eines Auftraggerätes vom Typus "LINO- MAT " wurden, 0,8 ul/cm (2 ul/Inch) von monoklonalem Mäuse- Anti-Theophyllin-Antikörper horizontal, an in regelmäßigem Abständen voneinander befindlichen Stellen längs der Längenerstreckung des Streifens, aufgebracht. Die Membran wurde von der Platte entfernt und bei Raumtemperatur während 30 min inkubiert. Auf die Membran wurde eine Blockierungslösung aufgetragen, welche 0,5 % (Gew./Vol.) Casein des Typus 1, 0,1 % (Gew./Vol.) TWEEN und PBSS enthielt, und die Membran wurde während 90 min bei 37º C inkubiert. Die Membran wurde während 15 min bei Zimmertemperatur mit einem Waschpuffer gewaschen, welcher 0,1 % (Gew./Vol.) von TWEEN in PBSS enthielt und einen pH-Wert von 7,3 hatte. Der Membranstreifen wurde in eine 0,5 %ige (Gew./Vol) Polyvinylalkohollösung (DuPont) eingetaucht und während 30 min inkubiert. Anschließend wurde die Membran bei 37 ºC getrocknet und bis zum Gebrauch in einem die Feuchtigkeit ausschließenden Behälter, wie z.B. einem Aluminium- oder Plastikbeutel, der ein austrocknendes Mittel enthält, bei 2 bis 30º C gelagert. Für eine mit Antigen überzogene Membran (bei den Theophyllin-Beispielen) wurde anstelle des Antikörpers ein Theophyllin- BSA-Konjugat aufgetragen.
- 20 ul von mit kolloidalem Gold markiertem Anti-LH-Antikörper wurden zu zwei Tropfen (100 ul) einer Urinprobe zugesetzt und in einem Proberöhrchen vermischt. Ein Ende eines Membranstreifens, der gemäß Beispiel 3 hergestellt worden war, und auf welchen Anti-LH-Antikörper aufgetragen worden war, würde in das Proberöhrchen eingetaucht. Es wurden die folgenden Prüfungen auf die Empfindlichkeit unter Verwendung eines LH- Standards, der in den Konzentrationsbereichen von 0 mIE je ml bis 200 mIE je ml hergestellt worden war, durchgefürt, wobei die nachstehenden Ergebnisse beobachtet wurden: Empfindlichkeit mIE/ml LH Standards Beobachtete Reaktion
- Es wurde nach der Verfahrensweise von Beispiel 4 vorgegangen, wobei Urinproben aus zwei Frauen mit Menstruationszyklen von 28 Tagen verwendet wurden. Die Proben wurden über einen Zeitraum von fünf Tagen gesamelt, und die Testergebnisse wurden mit einer Testeinrichtung van Typus "Advanced Care's Ovutime Test " (Ortho Pharmaceutical Corporation) verifiziert, wobei die folgenden Ergebnisse beobachtet wurden: Patientin A Tag im Zyklus Testergebnis "Ovutime"-Ergebnis Patientin B Tag im Zyklus Testergebnis "Ovutime"-Ergebnis
- Es wurde ein Membranstreifen gemäß Beispiel 4 hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, daß der Streifen zwei Reagenzienbanden aufwies. Die untere Bande war mit Anti-LH-Antikörper beschichtet (und bildete die Testbande), während die obere Bande mit LH (oder mit hCG, welches aufgrund von Kreuzreaktivität ähnlich reagiert) beschichtet war und als Kontrollbande diente. Der mit kolloidalem Gold markierte Anti-LH-Antikörper wurde gemäß Beispiel 2 hergestellt. Die Verfahrensweise war wie folgt: 20 ul von mit kolloidalem Gold markertem Anti-LH-Antikörper wurden zusammen mit 100 ul einer Urinprobe in ein Proberöhrchen gegeben und miteinander vermischt. Ein Ende des obgenamten Membranstreifens wurde in das Gemisch in dem Proberöhrchen eingeführt und während 5 min entwickeln gelassen. Es wurden die nachstehenden Ergebnisse beobachtet.
- Es wurden die gleichen zwei Frauenurinproben A und B untersucht, die auch im Beispiel 5 geprüft worden waren, wobei das gleiche Ergebnis erhalten und die Ergebnisse somit bestätigt wurden. Außerdem zeigt bei diesem Test eine Testverfährenskontrollbande für alle Tests, ob er richtig durchgeführt worden ist. Patientin A Tag im Zyklus Testbande Kontrollbande Bezugstesteinrichtung ("Ovutime") Patientin B Tag im Zyklus Testbande Kontrollbande Bezugstesteinrichtung ("Ovutime")
- Die obige Verfährensweise wurde wiederholt, wobei der mit dem kolloidalen Gold markierte Antikörper in dem Proberöhrchen lyophilisiert war. Drei Tropfen (100 ul) Urin wurden in das Proberöhrchen gegeben und vermischt, und anschließend wurde ein Ende des Membranstreifens eingeführt und während 5 min entwickelt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse waren identisch.
- Der Test wurde mit klinischen Proben wiederholt: Anzahl der Proben Anzahl positiv Anzahl negativ Urin aus Frauen
- Es wurde auch ein Bezugstest mit der "Ovutime "-Testeinrichtung mit den gleichen Proben durchgeführt, wobei die Ergebnisse bestätigt wurden.
- Eine BIODYNE-Membran (Porengröße 3,0 um) wurde in eine Lösung eines monoklonalen Anti-hCG-Antikörpers (1,2 ug/ml) gelegt, welche Lösung mit 0,02M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBSS) gepuffert war. Die Memban wurde unter konstantem Hin- und Herbewegen während 30 min bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Membran wurde aus der Antikörperlösung entfernt und durch Filtration mit einer PBSS-0,1 % Tween-20-Waschlösung gewaschen. Die gewaschenen Membranen wurden in eine Blockierungslösung von 0,5 % Trockenmilch in PBSS gelegt und während 1 h bei 37º C inkubiert. Die Membranen würden durch Filtration mit einer PBSS-0,1 % Tween-Waschlösung gewaschen, bei 37º C getrocknet und in einem die Feuchtigkeit ausschließenden und ein austrocknendes Mittel enthaltenden Behälter bei 2 bis 30º C gelagert. Der monoklonale Anti-hCG-Antikörper wurde mit kolloidalem Gold markiert. Diese Antikörper wurden dann mit hCG gesättigt, wodurch ein Label-Antikörper-Analyt-Komplex gebildet wurde. Die zuvor hergestellten Membranen wurden zu Streifen mit den Abmessungen von 50 mm x 6 mm geschnitten. Eine 500 ul-Urinprobe wurde mit 100 ul des Markers vermischt. Die Streifen wurden (auf eine Tiefe von 5 mm) in eine Probelösung gelegt, und die Flüssigkeit wurde zum oberen Ende des Streifens wandern gelassen. Der Abstand, über welchen der kolloidale Farbstoff von der Oberfläche der Probelösung gewandert war, wurde visuell beobachtet. Dabei wurden die folgenden Ergebnisse beobachtet: HCG-Probe (mIE/ml) zurückgelegter Abstand (mm) (ober Ende
- Die Verfährensweise des Beispiels 7 wurde wiederholt, jedoch mit der Annahme, daß zum Markieren des monoklonalen Anti-hCG-Antikörpers FITC verwendet wurde, und daß die Ergebnisse dadurch beobachtet wurden, daß man die FITC (Fluoresceinthiocyanat) enthaltenden Streifen beleuchtete. Dabei wurden die folgenden Ergebnisse erhalten: HCG-Probe (mIE/ml) zurückgelegter Abstand (mm) (oberes Ende)
- Eine Membran mit den Abmessungen von 90 x 5 mm wurde im wesentlichen gemäß den im Beispiel 3 beschriebenen Verfahrensweisen hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, daß der Anti-Theophyllin-Antikörper in 11 Banden aufgetragen wurde. Gemäß Beispiel 2 wurde ein Konjugat aus kolloidalem Gold - BSA - Theophyllin hergestellt (z.B. wurde anstelle des monoklonalen Antikörpers Theophyllin verwendet, welches chemisch, mit Amidbindungen, an das BSA gekuppelt war), und es wurde wie folgt vorgegangen: 20 ul des mit kolloidalem Gold markierten Reagens wurden zusammen mit 130 ul einer Serumprobe in ein Proberöhrchen gegeben und vermischt. Ein Ende des Membranstreifens wurde in das Gemisch eingeführt, während 10 min entwickeln gelassen und dann abgelesen. Es wurden Theophyllinstandards in Konzentrationsbereichen von 0 ug/ml bis 40 ug/ml hergestellt, und aufgrund eines Standarddurchlaufes wurde ein Kontrolldiagram (Standardkonzentration gegen Höhe der Bande) angefertigt. Dabei wurden die folgenden Ergebnisse beobachtet. Kontrolldiagramm Konzentration Höhe der Bande (mm) Höhe (mm) Wert (ug/l) Kontrolle
- Man wird bemerken, daß das Vorliegen von Mehrfachbanden mithilft, einen klaren Kontrast zwischen dem Signal und dem Hintergrund zu erzielen, wodurch der Kontrast verstärkt wird und die Ergebnisse leichter zu interpretieren sind. Die Testergebnisse waren nicht zeitabhängig, und sie blieben zu einem beliebigen Zeitpunkt nach dem Entwickeln beabachtbar. Weiterhin ermöglicht die Anfertigung von Kontrolldiagrammen die Quantifizierung der Theophyllinkonzentration in solchen Fällen, wo qualitative Ergebnisse (z.B. "über einer vorbestimmten Höhe") nicht ausreichen.
- Es wurde gemäß Beispiel 4 ein Membranstreifen hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, daß der Streifen zwei Reagenzienbanden aufwies. Die untere Bande war mit Anti-hCG-Antikörper beschichtet (und bildete die Testbande), während die obere Bande mit hCG beschichtet war und als Kontroll/Kalibrierungsbande diente. Der mit kolloidalem Gold markierte Anti-hCG-Antikörper wurde gemäß Beispiel 2 hergestellt. Es würde wie folgt vorgegangen:
- 40 ul des mit kolloidalem Gold markierten Anti-hCG-Antikörpers wurden zusammen mit 100 ul einer Urinprobe in ein Proberöhrchen gegeben und vermischt. Ein Ende des vorstehend beschriebenen Membranstreifens wurde in das Gemisch in dem Proberöhrchen eingeführt und während 5 min entwickeln gelassen. Dabei wurden die folgenden Ergebnisse beobachtet: Anzahl der Proben Anzahl positiv (zwei Banden) Anzahl negativ (eine Bande) Urin aus schwangeren Frauen Urin aus nicht schwangeren Frauen
- Die Testergebnisse waren in völliger (100 %iger) Übereinstimmung mit dem hCG-Test van Typus "TANDEM ICON " der Firma Hybritech.
- Ein Membranstreifen (90 x 10 mm) wurde gemäß Beispiel 10 hergestellt, und es wurde dementsprechend mit Vollblutproben geprüft. Dabei wurde wie folgt vorgegangen.
- 10 ul der Vollblutprobe wurden auf die Membran auf die Stelle zwischen der Testbande und dem unteren Ende aufgetupft. Dann wurde der Membranstreifen in ein Proberöhrchen eingeführt, welches ein Gemisch aus 40 ul von mit kolloidalem Gold markiertem Anti-hCG-Antikörper und 160 ul Puffer (0,1 M PBS plus 5 % BSA, 0,05 % Tween-20) enthielt. Nach 10 min wurden die folgenden Ergebnisse beobachtet: Anzahl der Proben Anzahl positiv (zwei Banden) Anzahl negativ (eine Bande) Vollblut aus schwangeren Frauen Vollblut aus nicht schwangeren Frauen
- Die Testergebnisse waren in völliger (100 %iger) Übereinstimmung mit dem hCG-Test vom Typus "TANDEM ICON " der Firma Hybritech.
- Es wurde ein Membranstreifen gemäß Beispiel 6 hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, daß der Streifen zwei Reagenzienbanden aufwies. Die untere Bande war mit Rubella-Antigen (Immuno Search, Toms River, NJ) beschichtet, und die obere Bande war mit Human-IgG beschichtet und diente als Kontroll/Kalibrierungsbande. Der mit kolloidalem Gold markierte Mäuse-Anti-Human-Antikörper wurde gemäß Beispiel 2 hergestellt. Dabei wurde wie folgt vorgegangen:
- 10 ul der Serumprobe wurden mit 25 ul vom Puffer A (0,1M PBS plus 5 % BSA, 0,05 % Tween-20) in einem Proberöhrchen verdünnt. Ein Ende des oben beschriebenen Membranstreifens wurde in das Proberöhrchen eingeführt und während 1 min entwickeln gelassen. Dann Den weitere 25 ul des Puffers A zu dem Proberöhrchen zugesetzt, und der Streifen wurde während zwei Minuten weiter entwickelt. Schließlich wurde der Streifen in ein zweites Proberöhrchen transferiert, welches ein Gemisch von 30 von mit kolloidalem Gold markiertem Mäuse-Anti-Human-Antikörper und 100 ul von Puffer A enthielt. Der Streifen wurde während 7 min entwickeln gelassen; und die dabei beobachteten Ergebnisse waren die folgenden: Anzahl der Proben Anzahl positiv (zwei Banden) Anzahl negativ (eine Bande)
- Die Testergebnisse waren in völliger (100 %iger) Übereinstimmung mit einem ELISA-Rubella-Test.
- Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Flexibilität, in den Membranstreifen ein Merkmal einzubauen, um zu gewährleisten, daß die flüssigen Reagenzien und die biologisch aktiven Moleküle auf dem Membranstreifen aktiv sind, und daß die Teststufen, einschließlich der Zugabe der wässerigen Probe, richtig durchgeführt worden sind. Dies ist besonders nützlich im Zusammenhang mit Immunglobulintests, und ist näher in der gleichzeitig mit der vorliegenden Anmeldung eingereichten europäischen Patentanmeldung 87 305 028.0 (Veröffentlichungsnummer 0 249 418) (für welche die Priorität der USSN 872 358 ORD 66 in Anspruch genommen wird) beschrieben. Zusammenfassend sei erwähnt, daß der Membranstreifen eine Reaktionszone einverleibt enthalten würde, welche Reaktionszone eine immobilisierte Komponente aufweist, welche befähigt ist, spezifisch mit einer Probenkomponente zu reagieren, welche letztgenannte in allen ähnlichen Proben aus verschiedenen Quellen gleichzeitig zu finden ist. Danach wird die markierte Komponente im Idealfall so ausgewählt, daß sie sowohl mit dem Immunglobulin oder dem sonstigen, zu bestimmenden Liganden als auch mit der überall zu findenden Probenkomponente reagieren kann. Man erkennt somit, daß als integrierender Bestandteil des Assays eine verinnerlichte Kontrolle durchgeführt wird.
- Aus den vorstehenden Ausführungen wird der Fachmann leicht erkennen, daß hinsichtlich der Auswahl der immunologisch aktiven Komponenten, der Membranen und des flüssigen Reagens zahlreiche Änderungen vorgenommen werden können, wobei aber nach wie vor das Wesen der Erfindung zur Anwendung kommt, welches in der Kombination besteht, daß ein mit kolloidalem Gold markiertes Reagens in einem Immunoassay verwendet wird, der in einer Matrixmembran durchgeführt wird, wobei die Materialien zur Erzielung eines visuell feststellbaren Ergebnisses durch die Membran fließen gelassen werden.
Claims (16)
1. Verfahren zum Nachweisen eines Liganden in einer Probe, welches die
folgenden Stufen umfaßt:
a) Zur-Verfügung-Stellen eines Membranstreifens, der von einem
gewundenen Pfad durchsetzt wird, wobei diese Membran zwei Enden hat
und einen Liganden oder einen Liganden-Bindungspartner aufweist,
der innerhalb der Membran immobilisiert ist;
b) Zur-Verfügung-Stellen eines flüssigen Reagens, welches einen
Liganden-Bindungspartner oder einen Liganden enthalt, wobei
dieser Liganden-Bindungspartner oder Ligand direkt oder indirekt mit
kolloidalem Gold markiert ist;
c) Inberührungbringen von einem Ende des Membranstreifens mit der
Probe und - gleichzeitig oder darauffolgend - mit dem flüssigen
Reagens, wodurch eine immunologische Reaktion in dem Maße
durchgeführt wird, als die Probe und das Reagens von dem einen Ende
zu dem anderen Ende des Membranstreifens wandern; und
d) Beobachten der Membran auf das Vorliegen von Farbe, deren Abstand
von dem einen Ende mit dein Vorliegen von kolloidalem Gold und des
Liganden in der Probe korrelierbar ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in der Stufe b) ein direkt oder
indirekt mit kolloidalem Gold markierter Ligand verwendet wird,
welcher mit dem liganden in der Probe um den
Liganden-Bindungspartner in Wettbewerb tritt; und wobei
das Reagens und die Probe vor ihrem gleichzeitigen Aufbringen auf
das eine Ende des Streifens miteinander vermischt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der ligand ein Antigen ist, das
eine einzige epitope Stelle aufweist;
der Ligand in der Stufe a) ein Antigen ist, das die gleiche
immunologische Reaktivität wie das Proben-Antigen aufweist;
der Liganden-Bindungspartner in der Stufe b) ein Antikörper ist, der
direkt oder indirekt mit kolloidalem Gold markiert ist, und der
spezifisch für das Proben-Antigen ist;
und wobei das Reagens und die Probe vor ihrem gleichzeitigen
Aufbringen auf das eine Ende der Streifenmembran miteinander
vermischt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei:
der Ligand in der Probe ein Antikörper ist;
der Liganden-Bindungspartner in der Stufe a) ein Antigen ist, für
welches der Antikörper spezifisch ist; und
der Liganden-Bindungspartner in dem Reagens ein Immunglobulin ist,
das direkt oder indirekt mit kolloidalem Gold markiert ist, und
welches für diesen Antikörper spezifisch ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei
der Ligand in der Probe ein Antigen ist, das wenigstens zwei epitope
Stellen aufweist;
der Liganden-Bindungspartner in der Stufe a) ein Antikörper ist, der
spezifisch für eine erste epitope Stelle auf dem Antigen ist; und
der Liganden Bindungspartner in der Stufe b) ein Antikörper ist, der
direkt oder indirekt mit kolloidalem Gold markiert ist, und der
spezifisch für eine zweite epitope Stelle auf dem Antigen ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei
der ligand in der Probe ein Antigen ist, welches wenigstens zwei
epitope Stellen aufweist;
der Ligand in der Stufe a) ein Antigen ist, das die gleiche
immunologische Reaktivität wie das Proben-Antigen aufweist;
der Liganden-Bindungspartner in der Stufe b) ein Antikörper ist, der
direkt oder indirekt mit kolloidalern Gold markiert ist, und der
spezifisch für die Antigene ist;
und wobei das Reagens und die Probe vor ihrem gleichzeitigen
Aufbringen auf das eine Ende der Streifenmembran miteinander
vermischt werden.
7. Verfahren nach einem der Anspruche 1 bis 3, 5 und 6, wobei das
Proben-Antigen Luteinisierendes Hormon (LH) ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das kolloidale
Gold ein Verhältnis der optischen Dichten von 1,7 bis 3,0, gemessen
als das Verhältnis der optischen Dichte bei 540 nm zu der optischen
Dichte bei 600 nm, aufweist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Verhältnis 2 bis 2,5
ausmacht.
10. Verfahren nach einem der Anspruche 1 bis 9, wobei der
Membranstreifen aktiviertes Nylon 66, aktiviertes aufsaugendes Papier oder
aktiviertes Polyvinylidendifluorid enthält.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das eine Ende
des Membranstreifens mit einer Waschlösung in Berührung gebracht
wird, nachdem es mit der Probe in Berührung gebracht worden ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, welches weiterhin die
Stufe des Inkubierens dieser Membran bei Zimmertemperatur während
einer Zeitspanne von weniger als etwa 10 min vor der Stufe des
Beobachtens umfaßt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das gesamte
Verfahren in weniger als etwa 30 s durchgeführt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei dieser
Membranstreifen weiterhin eine Kalibrierung für den nachzuweisenden
Liganden umfaßt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der
Membranstreifen eine Mehrzahl von verschiedenen Liganden-Bindungspartnern
aufweist, welche innerhalb der Membran in getrennten Zonen
immobilisiert sind, wodurch eine Mehrzahl von Liganden nachgewiesen
werden kann.
16. Kit für den Gebrauch in einem Test für den Nachweis eines
Liganden in einer flüssigen Probe, nach Anspruch 1, welcher Kit
umfaßt eine Membran, welche einen Liganden-Bindungspartner oder
einen Liganden zum Binden an den Liganden oder an den Liganden-
Bindungspartner aufweist, welcher Liganden-Bindungspartner oder
Ligand kontinuierlich, durch die gesamte Membran hindurch, oder in
getrennten Zonen immobilisiert ist; und einen Behälter, der einen
mit kolloidalem Gold markierten Liganden oder
Liganden-Bindungspartner zum Binden an den Liganden-Bindungspartnern auf der Membran
in einem Wettbewerbstest, oder zum Binden an den Liganden in der
flüssigen Probe in einem Sandwich-Test, enthält.
Applications Claiming Priority (1)
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---|---|---|---|
US87235786A | 1986-06-09 | 1986-06-09 |
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