DE69624920T2

DE69624920T2 - Testreagentien und Testvorrichtungen

Info

Publication number: DE69624920T2
Application number: DE69624920T
Authority: DE
Inventors: Yvonne Elizabeth Penfold; David Alan Percival
Original assignee: Inverness Medical Switzerland GmbH
Current assignee: Alere Switzerland GmbH
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 2003-09-18
Anticipated expiration: 2016-09-28
Also published as: CA2215042A1; DE69624920D1; AU734197B2; EP0833157B1; EP0833157A1; ES2187622T3; AU3684197A; US7153681B1; US6133048A; JP3939403B2; CA2215042C; ATE228247T1; US20070259446A1; JPH10111292A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich auf Reagenzien, die in Immunoassays verwendbar sind und auf Vorrichtungen, die derartige Reagenzien verwenden.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Derzeit sind viele Assays erhältlich, welche die in der EP-A- 291 194 beschriebene Technologie einsetzen, worin eine teilchenförmige Direktmarkierung, wie ein Goldsol oder ein gefärbtes Latexteilchen, eingesetzt wird, um das Ergebnis eines in einem porösen Träger, wie einem porösen Streifen, durchgeführten Assays anzuzeigen. Das Konzentrieren der teilchenförmigen Markierung in einer verhältnismäßig kleinen Nachweiszone im Streifen zeigt das Assayergebnis an. Es ist allgemeine Praxis für den Streifen, eine normalerweise stromabwärts von der Nachweiszone angeordnete Kontrollzone einzubeziehen, in der ebenfalls ein gefärbtes Signal erzeugt wird, um den Verwender abzusichern, dass der Test korrekt durchgeführt wurde. In den meisten auf diesem Konzept basierenden kommerziellen Produkten werden die Test- und Kontrollsignale unter Verwendung derselben teilchenförmigen Markierung erzeugt.
Diese Technologie kommt sehr gut mit den meisten Testsituationen zurecht, aber es kann extreme Situationen geben, in denen die Klarheit der Signale verbessert werden könnte. Beispielsweise kann das Kontrollzonensignal eher schwach erscheinen, wenn die Konzentration des Analyten sehr hoch ist und bewirkt, dass der größte Teil der Teilchenmarkierung in der Nachweiszone gebunden wird, wodurch unzureichend Markierung zurückgelassen wird, um weiter befördert zu werden und ein starkes Kontrollsignal zu liefern.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Reagenzien und Assayvorrichtungen bereitzustellen, in denen eine verbesserte Klarheit der Assaysignale erhalten wird, ungeachtet der Menge an Analyten, die in einer zu testenden Probe vorhanden sein kann.
Ein weiteres Ziel ist es, gute, klare Assaysignale ohne die Verwendung überschüssiger Mengen markierten Reagenzes bereitzustellen.

ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Durch die Erfindung stellen wir ein in Immunoassays verwendbares Reagenz zur Verfügung, umfassend eine teilchenförmige Direktmarkierung, ko-sensitiviert mit einem spezifischen Bindungsagens mit Spezifität für einen Analyten oder ein Analyt- Analogon und mit einem nicht-spezifischen Protein, das in einer Kontrollreaktion mit einem weiteren spezifischen Bindungsagens teilnehmen kann, das weder an das erste spezifische Bindungsagens bindet, noch bei der Bildung eines Komplexes, durch den der Nachweis des Analyten oder Analyt-Analogons erreicht wird, teilnimmt.
Vorzugsweise übersteigt die Menge an spezifischem Bindungsagens auf dem ko-sensitivierten Teilchen die Menge an nicht- spezifischem Protein hierauf. Bevorzugt liegt mindestens ein 2 : 1-Gewichtsverhältnis zwischen diesen zwei Materialien auf dem Teilchen vor, insbesondere bevorzugt mindestens etwa 5 : 1, idealerweise etwa 10 : 1. Die primäre spezifische Aktivität im Hinblick auf die Analytbindung und Kontrollsignalbildung ist daher hauptsächlich zugunsten der Analytbindung verschoben. Optional umfasst das Reagenz zusätzlich eine zweite Population der allein mit dem nicht-spezifischen Protein sensitivierten teilchenförmigen Direktmarkierung.
Bevorzugt ist das erste spezifische Bindungsagens ein in einer ersten Spezies gezüchteter Antikörper und das nicht- spezifische Protein ist ein Immunglobulin einer anderen Spezies. Beispielsweise kann das erste spezifische Bindungsagens ein Maus-Antikörper sein.
Das nicht-spezifische Protein kann beispielsweise ein Kaninchen-Immunglobulin darstellen, aber jedes Immunglobulin von irgendeiner Spezies kann verwendet werden, vorausgesetzt, es bindet weder an den Analyten noch an irgendein Reagenz, das beim Nachweis des Analyten teilnimmt.
Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Reagenz umfasst gefärbte Latexteilchen eines Durchmessers von weniger als 0,5 um, kosensitiviert mit einem monoklonalen Anti-hCG-Maus-Antikörper und mit Kaninchen-IgG. Vorzugsweise umfasst dieses Reagenz zusätzlich die gleich-gefärbten Latexteilchen eines Durchmessers von weniger als 0,5 um, allein sensitiviert mit IgG, wobei das Gewichtsverhältnis der ko-sensitivierten Teilchen zu den zweiten Teilchen mindestens 2 : 1, insbesondere bevorzugt etwa 3 : 1, beträgt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt eine Assayvorrichtung des Typs dar, worin eine Probenflüssigkeit ein markiertes Reagenz wiederherstellt und dieses in eine Nachweiszone und eine Kontrollzone trägt, wobei das markierte Reagenz in diesen Zonen unter Anzeigen des Assayergebnisses gebunden wird, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte Reagenz so ist wie in irgendeinem der vorangehenden Abschnitten beschrieben.
Vorzugsweise enthält die Nachweiszone ein immobilisiertes spezifisches Bindungsagens, das als direktes oder indirektes Abfangmittel für den Analyten oder das Analyt-Analogon dient, aber das nicht an das nicht-spezifische Protein bindet, und die Kontrollzone enthält ein spezifisches Bindungsagens, das das nicht-spezifische Protein bindet, aber nicht das auf den ersten Teilchen ko-sensitivierte spezifische Bindungsagens.
Die Teilchen können jegliche Mikroteilchen sein, die als mobile Markierungen in Streifenformat-Assays eingesetzt werden können. Derartige Assays sind beschrieben in vielen Veröffentlichungen, einschließlich der EP-A-291 194, der EP-A-383 619, der WO 96/09553 und der WO 96/09546. Geeignete Teilchen umfassen Latex(Polystyrol)teilchen, in der Regel mit einem Durchmesser von weniger als etwa 0,5 um, Metallsole, wie Goldsole, nicht-metallische Elementarsole, wie Selen oder Kohlenstoff, und Farbstoffsole.
Die Erfindung wird insbesondere in Bezug auf Test-Kits beschrieben, die zur Überwachung von Körperflüssigkeitsanalyten und insbesondere zur Überwachung zuhause von Urinanalyten mit Relevanz für die Bestimmung der Schwangerschaft (hCG) oder des Fruchtbarkeitsstatus des menschlichen Ovulationszyklus (durch Messen beispielsweise von LH und/oder E3G und/oder P3G) verwendbar sind. Dies ist nur beispielhaft und es ist festzustellen, dass die Erfindung in vielen anderen Zusammenhängen, wo andere Probenflüssigkeiten und Analyten einbezogen sind, wie Assays für Krebsmarker, Herzmarker, Blutglucose, Arzneimittelmissbrauch, Hormone, infektiöse Erkrankungsmarker, Tests bei der therapeutischen Arzneimittelüberwachung, Herstellungs- und Rohmaterial-Qualitätskontrolle sowie Tests auf Abwasser- und Verschmutzungsgehalte, verwendbar ist.
Bevorzugt enthält die Nachweiszone ein immobilisiertes spezifisches Bindungsagens, das als direktes oder indirektes Abfangmittel für hCG dient, wobei die Kontrollzone einen immobilisierten Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper enthält, und das mobile markierte Reagenz farbige Latexteilchen eines Durchmessers von weniger als 0,5 um umfasst, die mit einem monoklonalen Anti-hCG-Maus-Antikörper und mit Kaninchen-IgG ko-sensitiviert sind.
Die Herstellung der neuen Reagenzien der Erfindung und die Herstellung der Assayvorrichtungen unter Verwendung dieser neuen Reagenzien können beide unter Verwendung herkömmlicher Verfahren erreicht werden. Die ko-sensitivierte teilchenförmige Markierung kann durch Kontaktieren kommerziell erhältlicher teilchenförmiger Markierungen, wie Latex(Polystyrol)teilchen, geeigneter Dimension in wässeriger Suspension mit einer Mischung von zwei Materialien, mit denen die Teilchen sensitiviert werden müssen, hergestellt werden. Beispielsweise können diese Materialien eine Mischung eines monoklonalen Maus- Antikörpers, gerichtet gegen die α-Kette von hCG, zusammen mit einem nicht-spezifischen polyklonalen Antikörper, wie Kaninchen-IgG, sein. Diese Materialien müssen in einem geeigneten Gewichtsverhältnis, wie hier bereits beschrieben, vorhanden sein. Die Ko-sensitivierung muss unter gepufferten Verhältnissen, wie es Standardpraxis darstellt, durchgeführt werden. Nach einem geeigneten Zeitintervall, in dem man das Material sich auf den Teilchen abscheiden lässt, können ungebundene Materialien durch herkömmliche Verfahren, wie Zentrifugieren, Filtrieren und/oder Ultrafiltrieren, abgetrennt werden und die ko-sensitivierten Teilchen in einer für die Herstellung eines Assays gebrauchsfertigen herkömmlichen Speicherpufferlösung resuspendiert werden. Ein spezifisches Beispiel eines Kosensitivierungs-Verfahrens ist nachfolgend angegeben.
Um die Vorteile der Erfindung in Einzelheiten zu beschreiben, können wir als Beispiel ihre Anwendbarkeit im Zusammenhang mit einem Schwangerschaftstest, basierend auf immunchromatographischem Format unter Verwendung gefärbter Latexteilchen als mobile Direktmarkierung in einem Assaystreifen, ansehen. Der Assaystreifen, der beispielsweise aus Nitrocellulose einer Porengröße von etwa 8 um, verstärkt mit "Mylar"-Polyester, hergestellt ist, enthält zwei querlaufende Linien von abgeschiedenen, immobilisierten spezifischen Bindungsreagenzien, nämlich eine Testlinie, enthaltend ein Anti-β-hCG-Maus-Monoklonales und eine Kontrolllinie stromabwärts von der Testlinie, enthaltend ein gegen Kaninchen-IgG gezüchtetes immobilisiertes Maus-Monoklonales. An einer Stelle stromaufwärts von der Testlinie befindet sich ein mobiles Reagenz, umfassend gefärbte Latexteilchen eines Durchmessers von etwa 0,3 um. Diese Stelle kann auf der Nitrocellulose oder in einem getrennten Kissen oder Docht porösen Materials sein, die stromaufwärts im Strömungsweg liegt, in dem Probenflüssigkeit (Urin) die Nitrocellulose erreichen kann. Das mobile Reagenz umfasst zwei Populationen von Latexteilchen, nämlich:
a) Teilchen, ko-sensitiviert mit einem Anti-α-hCG-Maus-Monoklonalen und mit demselben Kaninchen-IgG, gegen das der Kontrolllinien-Antikörper gezüchtet wurde, und
b) eine zweite Population desselben Latexteilchens, das einfach nur das Kaninchen-IgG trägt.
Das Aufbringen einer Urinprobe mobilisiert die Latexteilchen. Wenn der Urin hCG enthält, kann sich zwischen dem Anti-hCG- Monoklonalen auf dem ko-sensitivierten Teilchen und dem AntihCG-Antikörper in der Testlinie ein Sandwich-Komplex ausbilden. Folglich wird zumindest ein Teil der ko-sensitivierten Teilchen in der Testlinie gebunden, um ein gefärbtes Signal zu liefern, das die Gegenwart von hCG anzeigt. Verbleibende mobilisierte ko-sensitivierte Teilchen, die in der Testlinie nicht gebunden werden, z. B. weil sie, bezogen auf die Menge des in der Probe vorhandenen hCG, im Überschuss vorliegen, können durch Wechselwirkung zwischen dem Kontrolllinien-Antikörper und dem Kaninchen-IgG auf den ko-sensitivierten Teilchen stromabwärts in der Kontrolllinie gebunden werden. Zusätzlich wird die zweite Population an Latexteilchen, die nur das Kaninchen-IgG tragen, mobilisiert und zur Testlinie getragen, um das Kontrollsignal zu verstärken.
Wir haben in der Praxis festgestellt, dass, wenn die hCG- Konzentration in der Urinprobe vergleichsweise hoch ist (obwohl nicht so hoch, um den gut bekannten "Hook-Effekt" zu induzieren, der einen Abfall des erscheinenden hCG-Signals bewirkt), der größte Teil der Anti-hCG-Teilchen in der Testlinie gebunden wird. Typischerweise tritt dies auf, wenn die hCG- Konzentration zwischen etwa 5000 und etwa 15000 mIU/ml liegt. Unter diesen Umständen gäbe es ein sehr starkes Testliniensignal, aber ein eher schwaches oder vollständig fehlendes Kontrollliniensignal. Jedoch stellt das Vorsehen der zweiten Population an Latexteilchen, die nicht in der Lage sind, in der Testlinie zu binden, sicher, dass ein starkes Kontrollliniensignal sogar unter diesen Umständen nach wie vor erhalten wird. Eine geeignete Mischung der ko-sensitivierten Teilchen und der mono-sensitivierten Teilchen liegt bei etwa 3 : 1. In einem Sandwich-Format-Assay liefert diese Kombination von Teilchen unter den meisten Assaybedingungen ein gutes klares Testsignal und Kontrollsignal, mit der Ausnahme von extrem hohen Analyt-Konzentrationen, wobei die minimale Gesamtanzahl von Teilchen erforderlich ist. Wesentlich mehr Teilchen wären erforderlich, wenn Testsignal und Kontrollsignal durch vollständig getrennte Populationen erzeugt würden.

BEISPIEL

Dieses Beispiel beschreibt ein Sensitivierungsverfahren, das eingesetzt werden kann, um erfindungsgemäße Reagenzien herzustellen.
Ein Latexteilchen-Reagenz, ko-sensitiviert mit einem monoklonalen Anti-α-hCG-Maus-Antikörper und mit Kaninchen-Immunglobulin, kann wie folgt hergestellt werden.
10 ml einer kommerziell erhältlichen Suspension (10% Feststoff) von blau gefärbten Latexteilchen eines Durchmessers von etwa 0,3 um werden zu 40 ml eines 100 mM-Boratpuffers, pH 8,5, zugegeben und heftig gerührt. Diese Mischung wird 10 Minuten bei 13500 UpM zentrifugiert und der flüssige Überstand entfernt. Die Latex-Pellets werden in 20 ml desselben Puffers resuspendiert.
Zu getrennten 20 ml desselben Puffers werden 400 ug/ml eines monoklonalen Anti-β-hCG-Maus-Antikörpers und 50 ug/ml Kaninchen-IgG zugegeben. Der Latex enthaltende Puffer und der Antikörper enthaltende Puffer werden beide in einem Wasserbad auf 40ºC erhitzt und bei Erreichen dieser Temperatur werden zu jedem 5 ml Ethanol zugegeben. Die Antikörperlösung wird dann unmittelbar zur Latexsuspension gegeben, unter Verwendung eines Magnetrührers gemischt und im Wasserbad für 60 Minuten inkubiert. Bei diesem Punkt werden 50 ml einer Lösung von Rinderserum Albumin (RSA) in demselben Puffer, vorerwärmt auf 40ºC, zugegeben, und die Inkubation wird bei 40ºC für weitere 30 Minuten fortgesetzt. Danach wird die Lösung 25 Minuten bei 13500 UpM zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Pellets werden in 50 ml 100 mM-Trispuffer, pH 9,0, resuspendiert, um eine 2% Feststoff enthaltende Suspension zu liefern. Gegebenenfalls können Konservierungsmittel, wie Saccharose mit 20% (w/v) und BSA mit 10% (w/v), zugegeben werden. Diese Latexsuspension ist für die Herstellung einer Assayvorrichtung gebrauchsfertig.
Ein identisches Verfahren kann eingesetzt werden, um allein mit Kaninchen-Immunglobulin sensitivierte Latexteilchen herzustellen. In diesem Fall werden 20 ml Suspension von Latexteilchen mit 20 ml Puffer, enthaltend 150 ug/ml Kaninchen-IgG, kombiniert.
Bei der nachfolgenden Herstellung einer Assayvorrichtung unter Verwendung einer Kombination der ko-sensitivierten und mono- sensitivierten Teilchen können die zwei Suspensionen von sensitivierten Teilchen in geeigneten Mengen kombiniert (um eine geeignete Mischung, z. B. 3 zu 1, der zwei Populationen an Teilchen bereitzustellen) und als einzelnes kombiniertes Reagenz auf einem Teststreifen oder in einem separaten Kissen oder Docht, die Teil einer Assayvorrichtung bilden, aufgebracht werden.

Claims

1. Reagenz, verwendbar in Immunoassays, umfassend eine teilchenförmige Direktmarkierung, ko-sensitiviert mit einem spezifischen Bindungsagens mit Spezifität für einen Analyten oder ein Analyt-Analogon und mit einem nicht-spezifischen Protein, das in einer Kontrollreaktion mit einem weiteren spezifischen Bindungsagens teilnehmen kann, das weder an das erste spezifische Bindungsagens bindet, noch bei der Bildung eines Komplexes, durch den der Nachweis des Analyten oder Analyt-Analogons erreicht wird, teilnimmt.

2. Reagenz nach Anspruch 1, worin das erste spezifische Bindungsagens einen in einer ersten Spezies gezüchteten Antikörper und das nicht-spezifische Protein ein Immunglobulin einer weiteren Spezies darstellt.

3. Reagenz nach Anspruch 2, worin das erste spezifische Bindungsagens einen Maus-Antikörper darstellt.

4. Reagenz nach Anspruch 2, worin das nicht-spezifische Protein ein Kaninchen-Immunglobulin darstellt.

5. Reagenz nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, das zusätzlich eine zweite Population der teilchenförmigen Direktmarkierung, die allein mit dem nicht-spezifischen Protein sensitiviert ist, umfasst.

6. Reagenz nach Anspruch 2, umfassend gefärbte Latexteilchen eines Durchmessers von weniger als 0,5 um, ko-sensitiviert mit einem monoklonalen Anti-hCG-Maus-Antikörper und mit Kaninchen-IgG.

7. Reagenz nach Anspruch 6, das zusätzlich gleich-gefärbte Latexteilchen eines Durchmessers von weniger als 0,5 um umfasst, die allein mit Kaninchen-IgG sensitiviert sind, wobei das Verhältnis der ko-sensitivierten Teilchen zu den zweiten Teilchen mindestens 2 : 1, insbesondere etwa 3 : 1, beträgt.

8. Assayvorrichtung des Typs, worin eine Probenflüssigkeit ein markiertes Reagenz wiederherstellt und dieses in eine Nachweiszone und eine Kontrollzone trägt, wobei das markierte Reagenz in diesen Zonen unter Anzeigen des Assayergebnisses gebunden wird, gekennzeichnet durch ein markiertes Reagenz nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche.

9. Assayvorrichtung nach Anspruch 8, worin die Nachweiszone ein immobilisiertes spezifisches Bindungsagens enthält, das als direktes oder indirektes Abfangmittel für den Analyten oder das Analyt-Analogon dient, aber das nicht an das nicht-spezifische Protein bindet, und die Kontrollzone ein spezifisches Bindungsagens enthält, das das nicht- spezifische Protein bindet, aber das auf dem ersten Teilchen ko-sensitivierte spezifische Bindungsagens nicht bindet.

10. Assayvorrichtung nach Anspruch 9, worin die Nachweiszone ein immobilisiertes spezifisches Bindungsagens enthält, das als direktes oder indirektes Abfangmittel für hCG dient, wobei die Kontrollzone einen immobilisierten Anti- Kaninchen-IgG-Antikörper enthält und das markierte Reagenz ein solches gemäß Anspruch 6 oder Anspruch 7 ist.