DE2902676A1

DE2902676A1 - Immunoassays unter verwendung von f(ab') tief 2 -untergruppen

Info

Publication number: DE2902676A1
Application number: DE19792902676
Authority: DE
Inventors: Cesar Lorenzo Cambiaso; Joseph Nicolas Limet; Pierre Lucien Masson; Claude Henri Moussebois; Jean-Pierre Vaerman
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1978-01-26
Filing date: 1979-01-24
Publication date: 1979-08-02
Anticipated expiration: 1999-01-25
Also published as: IT1119257B; AU4356579A; CA1118345A; JPH02276968A; FR2415809B1; IT7967165A0; GB2013211A; BE873673A; JPS54119292A; GB2013211B; JPH0521186B2; AU524656B2; SE445393B; US4397960A; SE7900661L; FR2415809A1; NL7900586A; CH639208A5; JPS6338668B2; DE2902676C2

Description

TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y., VStA

Immunoassays unter Verwendung von F(ab·)p-Untergruppen

Die Erfindung betrifft Immunoassays und insbesondere solche, bei denen von den Bindungseigenschaften von Immunglobulinen Gebrauch gemacht wird, sowie bestimmte Reagenzien, die in derartigen Assays Verwendung finden können.

Bekanntlich verbinden sich Immunglobulinantikörper mit den entsprechenden spezifischen Antigenen oder Haptenen (Ag), wovon in vielen Immunoassay-Verfahren Gebrauch gemacht wird. Beispielsweise können menschliche Seren auf die Anwesenheit eines bestimmten Antigens unter Verwendung des entsprechenden Immunglobulinantikörpers untersucht werden, beispielsweise aufgrund der kompetitiven Bindung oder der Latexagglutinierung. Diese und andere Verfahren sind dem Fachmann wohl bekannt.

Eine Schwierigkeit, die in derarten Immunoassays auftreten kann, besteht darin, daß andere in dem zu untersuchenden Serum vorhandene Proteine stören können. Insbesondere enthält das menschliche Serum den Rheumatoidfaktor (RF) und die Komponente C1 q (eine Komplementkomponente), und diese beiden Substanzen binden sich gleichfalls an das Immunglobulin. Außerdem können die Mengen an dem Rheumatoidfaktor und der Komponente C1 q in menschlichen Seren in sehr weiten Grenzen variieren, weshalb es normalerweise erforderlich ist, die Seren vor der Durchführung des Assays einer Behandlung zur Inaktivierung oder Entfernung von endogenem Rheumatoidfaktor und der Komponente C1q zu behandeln. Wenn dies nicht getan wird, können die Assayergebnisse und insbesondere jegliche quantitativen Ergebnisse beträchtliche Fehler aufweisen.

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Es v/urde nun ein Verfahren für ein Immunoassay gefunden, bei dem von der bindenden Eigenschaft der Immunglobuline für Antigene (immer einschließlich Haptene) Gebrauch gemacht wird und das in Gegenwart des Rheumatoidfaktors und bzw. oder der Komponente C1q durchgeführt werden kann, ohne daß es durch die Anwesenheit gestört wird. Dabei werden insbesondere die F(ab¹)p-Untergruppen des Immunglobulins anstelle von Gesamtimmunglobulin verwendet. Die F(ab')?~ Untergruppen von beispielsweise Immunglobulin G besitzen die Eigenschaft, sich spezifisch an Antigene, d.h. nicht an den Rheumatoidfaktor oder die Komponente C1q zu binden. (Die F(c)-Untergruppe der Immunglobuline ist für die Bindungsreaktion des Immunglobulins an den Rheumatoidfaktor oder die Komponente C1q, jedoch nicht für die Bindungsreaktion mit einem spezifischen Antigen verantwortlich.) Daraus ergibt sich, daß bei diesem Vorgehen die Spezifität des Immunglobulins gegenüber einem bestimmten Antigen aufrecht- erhalten bleibt, jedoch ohne die damit einhergehende Eigenschaft der Bindung an den Rheumatoidfaktor und bzw. oder die Komponente C1q.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Immunoassay-Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Antigen in einer Flüssigkeit mit den F (ab¹ )₂-Untergruppen eines Immunglobulins, das für das Antigen spezifisch ist, umsetzt, wobei die Umsetzung praktisch in Abwesenheit von Gesamtimmunglobulin und der F(c)-Untergruppen davon durchgeführt wird.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zum Nachweis und bzw. oder zur Bestimmung eines Antigens in einer Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man (a) eine Probe der Flüssigkeit mit den F(ab' ^-Untergruppen eines Immunglobulins, das gegenüber dem Antigen spezifisch wirkt, zu einem Reaktionsgemisch vermischt, das praktisch frei von Gesamtimmunglobulin und den F(c)-Untergruppen davon ist; 30983 1/0706

(b) das Gemisch zur Ermöglichung der Umsetzung zwischen den P(ab¹ ^-Untergruppen und dem vorhandenen Antigen, bebrütet und

(c) ggf» das Ausmaß, bis zu dem die Umsetzung in dem Gemisch erfolgt ist, bestimmt und dadurch den Nachweis und bzw. oder die Bestimmung des Antigens in der Flüssigkeitsprobe durchführt.

Immunglobuline, wie IgG können in ihre Bestandteile F(ab*)p u¹¹^ F(^c) ^auf bekannte Weise, beispielsweise durch enzymatische Behandlung mit Pepsin, gespalten werden. Die F(ab¹)2"" Untergruppen können dann von den F(c)-Untergruppen abgetrennt und in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Ein Beispiel für die Herstellung von F(ab')p besteht darin, daß man Gesamtimmunglobulin mit Pepsin (2 mg Pepsin je 100 mg Immunglobulin) in einem 0,1m Acetatpuffer vom pH 4,5 vermischt. Das Gemisch wird bei 37 °C 24 h lang bebrütet. Das gebildete F(ab')2 wird anschließend an einer Säule von Ultrogel AcA 4,4 abgetrennt, wobei man 80 bis 90% der theoretischen Ausbeute von FCabOp erhält.

Die F(ab^l^-Immunglobulin-Untergruppen können erfindungsgemäß anstelle des Gesamtimmunglobulins bei einer Vielzahl von Immunoassays verwendet werden, bei denen eine spezifische Umsetzung zwischen dem Immunglobulin und einem Antigen erfolgt, wobei jedoch keine Umsetzung zwischen dem Immunglobulin und dem Rheumatoidfaktor oder der Komponente C1q erforderlich ist. (Es gibt selbstverständlich Assays, bei denen der Rheumatoidfaktor oder die Komponente C1q als Reagenz zur Umsetzung mit dem Immunglobulin zugesetzt wird. Bei derartigen Assays können die F(ab*^-Untergruppen nicht einfach als Ersatz für Gesamtimmunglobulin verwendet werden.) Somit können die F(ab·^-Untergruppen in Lösung in beispielsweise bestimmten Assays mit kompetitiver Bindung verwendet werden. Es ist häufig von Vorteil, bei derartigen Assays sowie anderen Assays ein radioaktives Atom oder eine andere

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Markierung zu verwenden, und die F(ab')p-Untergruppen können eine derartige Markierung tragen. (Das Ausmaß der Umsetzung zwischen dem Antigen und den Untergruppen wird in diesen Fällen durch Verwendung der Markierung bestimmt} Bei einem Beispiel für einen erfindungsgemäßen Assay mit kompetitiver Bindung wird die das Antigen enthaltende Flüssigkeit mit sowohl markierten als auch unmarkierten F(ab·)p-Untergruppen vermischt, wobei eine kompetitive Bindungsreaktion zwischen den Untergruppen und dem Antigen eintritt und wobei die Menge an markierten Untergruppen, die entweder mit dem Antigen umgesetzt wurde oder in dem Gemisch nicht umgesetzt zurückblieb, analysiert wird und dadurch die Anwesenheit und bzw. oder die Menge an vorhandenem Antigen in der Flüssigkeit bestimmt wird.

Die F(ab^f^-Untergruppen können weiter in unlöslichgemachter Form verwendet werden, d.h. an ein wasserunlösliches Substrat gebunden (wobei darunter sowohl adsorbiert als auch mit kovalenter Bindung verknüpft zu verstehen ist). Die Art des Substrats kann in weiten Grenzen variieren: beispielsweise kann es in Folienform vorliegen oder in Form einer hohlen Röhre oder als teilchenförmiges Material. Eine bevorzugte Form von teilchenförmigem Material ist magnetisch anziehbar, so daß nach der Umsetzung zwischen dem zu bestimmenden Antigen und den Untergruppen das teilchenförmige Material unter Anwendung eines Magnetfelds abgetrennt werden kann. Assays dieser Art sind in der BE-PS 852 327 beschrieben.

Eine weitere bevorzugte Form unlöslichgemachter F(ab¹^-Untergruppen besteht in einer Latexsuspension, und derartige Suspensionen können anstelle von Gesamtimmunglobulin bei Latexagglutinierungste st s auf Antigene verwendet werden. Bei derartigen Tests wird eine Probe der auf ein Antigen zu untersuchenden Flüssigkeit (beispielsweise

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menschliches Serum) mit Latexteilchen vermischt, die einen Überzug aus einem Antikörper für dieses Antigen aufweisen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden anstelle des Antikörpers aus Gesamtimmunglobulin in dem Überzug F(ab')2~ Untergruppen verwendet. Die spezifische Bindung zwischen dem Überzug und dem Antigen verursacht, daß die Latexteilchen agglutiniert werden. Das Ausmaß der Agglutinierung kann visuell (für qualitative Ergebnisse) beobachtet werden oder auch quantitativ durch Auszählen bestimmt werden, indem vorzugsweise die agglutinierten oder insbesondere die nicht agglutinierten Teilchen automatisch gezählt werden.

Gegenstand der Erfindung ist daher weiterhin ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines Antigens in einer Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Probe der Flüssigkeit mit Latexteilchen, an die die F(ab^f^-Untergruppen gebunden sind, unter Ausbildung eines Reaktionsgemisches vermischt wird, wobei die Umsetzung zwischen dem Antigen und den F(ab'^-Untergruppen eine Agglutinierung des Latex hervorruft, und das Gemisch ggf. untersucht wird, um das Ausmaß der Agglutinierung zu bestimmen, wodurch die Anwesenheit und bzw. oder die Menge an dem Antigen in der Flüssigkeitsprobe bestimmt wird.

Es ist zu bemerken, daß bei den Latexagglutinierungstests unter Verwendung von F(ab')p-Untergruppen kein Dithiothreit (DTT) vorhanden sein darf, da dieses die Agglutinierung verhindert. Etwa vorhandenes Dithiothreit kann durch Oxydation mit Wasserstoffperoxid inaktiviert werden.

Das Assayverfahren gemäß der Erfindung kann in geeigneten Fällen nach dem dem Fachmann bekannten Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses durchgeführt werden, wobei einzelne Abschnitte aus dem Reaktionsgemisch, getrennt durch einen Abschnitt aus inertem Material, wie beispielsweise Luft, und gewünschtenfalls durch einen Abschnitt aus Waschflüssig-

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keit, entlang einer Leitung geführt werden. Dieses Verfahren ist in der US-PS 2 797 149 beschrieben.

Unlöslichgemachte F(ab¹^-Untergruppen können auf verschiedene Weise hergestellt werden. Die Untergruppen können beispielsweise an die Oberfläche eines geeigneten Substrats adsorbiert werden. Alternativ kann Gesamtimmunglobulin, beispielsweise IgG, an eine Substratoberfläche kovalent gebunden und anschließend zur Abtrennung der F(c)-Untergruppen behandelt werden, wobei die F(ab')p~ Untergruppen an dem Substrat kovalent gebunden bleiben. Auf diese Weise kann mit F(ab^!)? überzogener Latex auf eine dieser Weisen hergestellt werden, d.h. der Latex mit einem für eine Adsorption geeigneten Überzug auf den Latexteilchen kann mit F(ab¹ )₂-Untergruppen in einem Puffer vermischt werden, worauf die F(ab¹)₂-Untergruppen unmittelbar an den Latex adsorbiert werden, oder Gesamt-IgG-Antikörper kann an den Latex gekuppelt und davon die F(c)-Untergruppen abgespalten werden, die anschließend aus dem Gemisch entfernt werden, wonach die F(ab' ^-Untergruppen, an den Latex gebunden, zurückbleiben. In einem Beispiel für dieses Vorgehen wird das Immunglobulin an den Latex nach dem Verfahren gemäß der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung

P (die der britischen Patentanmeldung 3238/78

entspricht) gebunden. Dieses Verfahren besteht, kurz gesagt, daraus, daß man zunächst den Latex mit einem Protein beschichtet, das fest an dem Latex klebt und gegenüber Proteolyse verhältnismäßig resistent ist. Ein Beispiel für ein derartiges Protein ist Lactoferrin. Die Immunglobulinantikörper werden dann an das Lactoferrin kovalent gebunden, indem man beispielsweise das Leuchs-Anhydrid von N- £ -Chloracetyllysin (NCA) als Kupplungsmittel verwendet. Die Latex-Lactoferrin-NCA-Antikörper werden anschließend mit Pepsin digeriert, beispielsweise unter den folgenden Bedingungen:

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0,2m Acetatpuffer, pH 3,2, Pepsin/lmmunglobulin-Verhältnis = 1/10, 0,5%ige Latexsuspensionj, Bebrütung 60 min bei 37°C Auf diese Weise werden Latexteilchen erhalten, die die F (ab¹) ,,-Untergruppe des Immunglobulins tragen.

Die Latexteilchen (öderen anderen F(ab*),,-Untergruppen tragenden Substrate), die auf diese Weise und nach dem Adsorptionsverfahren erhalten worden sind, werden durch die Rheumatoidfaktor-Konzentrationen, wie sie in Seren, die reich an dem Rheumatoidfaktor sind, vorkommen, nicht agglutiniert. Die Latexteilchen können mit Erfolg bei den Latexagglutinierungstests für Antigene selbst in Gegenwart von Rheumatoidfaktor oder der Komponente C1q eingesetzt werden.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Reagenz zur Verwendung in Immunoassays, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Suspension aus feinverteiltem teilchenförmigen! Material enthält, an das die F(ab¹^-Untergruppen eines Immunglobulins gebunden sind, wobei die Suspension praktisch frei von dem Immunglobulin und den F(^-Untergruppen davon ist. In derartigen Reagenzien können die F (ab¹)p-Untergruppen beispielsweise an die Teilchen kovalent gebunden oder adsorbiert sein. Die Teilchen können magnetisch anziehbares Material enthalten^ und die Untergruppen können eine sie identifizierende Markierung tragen. Die Teilchen können von jeder zweckmäßigen Größe sein, im allgemeinen sind sie jedoch etwa 1 bis 20 /U groß. Besonders, jedoch nicht ausschließlich im Falle ihrer Verwendung bei Verfahren nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip beträgt das spezifische Gewicht der Teilchen etwa 1,4 bis 3,2, um ein unzweckmäßiges Aufschwimmen oder Absetzen der Teilchen in dem Umsetzungsgemisch zu verhindern.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen näher erläutert.

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Beispiel 1

Herstellung von F(ab^!^-Latexteilchen durch Adsorption

Eine 10%ige Suspension aus Latexteilchen (Dow, 0,794/U Durchmesser, S.D.0,044/U, No. 41943, Serva FeinMochemica, D-6900 Heidelberg 1) wird auf das 20-fache mit 0,02m Glycin/O,O35m NaCl-Puffer vom pH 9,1 verdünnt und einmal mit diesem Puffer gewaschen. 1/10 Volumen der-F(ab^f)₂~Lösung, 2 bis 3 mg/ml, hergestellt wie oben, wird daraufhin zugesetzt, und nach 10 bis 15 min Bebrüten bei Raumtemperatur wird 1/10 Volumen von 1Obigem menschlichen Serum Albumin (HSA) in dem gleichen Puffer wie der Latex zugesetzt, um eine Proteinsättigung sicherzustellen. Nach weiteren 20 bis 30 min Bebrüten wird der Latex zweimal mit dem ursprünglichen Puffer gewaschen, bevor er in dem ursprünglichen Volumen 0,10m Glycin/0,17m NaCl-Puffer vom pH 9,1 mit einem Gehalt von 1% HSA erneut suspendiert wird, wobei man eine Latexsuspension von 0,5%iger Konzentration erhält, die somit auf das 20-fache im Verhältnis zur ursprünglichen Konzentration verdünnt ist.

Antiserum

.In Kaninchen wurde ein Antiserum gegenüber IgE erzeugt, wobei das Freund-^lsche vollständige Adjuvans verwendet wurde, und es wurde auf das 10-fache im Cyclinpuffer verdünnt, der drei Tropfen "Tween 20" je Liter enthielt, und durch ein Milipore (GWSP 06700)-Filter von 0,22 ,u filtriert, bevor es verwendet wurde.

Automatisierter Assay

Patientenserum wurde in einer Geschwindigkeit von 0,1 ml/ min in ein kontinuierliches Durchflußsystem angesaugt, das aus einer peristaltischen Pumpe, einem verzweigten Leitungssystem, einem Teilchenzähler und einem Registriergerät bestand. Das Serum wurde mit 1,0 ml von mit Glycin gepufferten Latexteilchen vermischt und das Ganze 10 min lang

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durch eine Bebrütungsschlange geleitet. Die Lösung wurde danach in einen Zellenzähler geleitet, wo die nicht agglutinierten Teilchen gezählt und die agglutinierten Teilchen elektronisch ausgesondert wurden. Die Konzentration an IgE im Serum war direkt proportional der Abnahme an Teilchen im Bereich von 6 Ms 100 internationalen Einheiten von IgE. Eroben von dreizehn Patienten, die wiederholt analysiert wurden, ergaben einen Variationskoeffizienten von 2% im mittleren Bereich (at mid-range) sowie einen Korrelationskoeffizienten von 0,95, verglichen mit einen Radioimmunoassay-Test.

Beispiel 2 -

Herstellung von F(ab¹)2» kovalent an Latex gebunden

12 mg N- C -Chloracetyllysin-N-carboxyanhydrid (NCA) in 100/Ul Dioxan gelöst, wurden zu 50 mg mit eisengesättigtem Lactoferrin in 1 ml mit Phosphat gepufferter Salzlösung vom pH 7,2 (PBS) hinzugegeben. Nach 24-stündiger Bebrütung im Dunklen bei 4 ⁰C wurde das Präparat zum Aufbewahren lyophilisiert. Danach wurden Polystyrollatexteilchen (0,8/U Durchmesser, 10%ige Suspension) überzogen, indem man 500/Ug NCA-Lactoferrin mit 0,4 ml PBS und 50/Ul des 10bigen Latex vermischte. Nach 45 minütigem Bebrüten bei Raumtemperatur wurden die Teilchen zweimal mit 1 ml 0,2m Carbonatpuffer vom pH 9,6 gewaschen. Um Hydrolyse der Chloracetylgruppen bei alkalischem pH-Wert zu vermeiden, mußte der reduzierte IgG-Antikörper sofort zugesetzt werden. Das IgG wurde aus Antipferdemilzferritin vom Kaninchen (rabbit anti-horse spleen ferritin) durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat und nachfolgendem Chromatograph! er en an DEAE-Cellulose hergestellt. Das IgG wurde mit einer Endkonzentration von 8 mg/ml in 0,1m Phosphatlösung vom pH 8,5 1 h lang bei 37 °C mit 1,1 mM Di thiothreit (DTT) reduziert. Gemische mit einem Gehalt von 1 ml der 0,5%igen Suspension aus frisch hergestelltem NCA-Lactoferrin-Latex und verschie-

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denen Volumina (15 bis 125/Ul j Lösung aus reduziertem IgG-Antikörper wurden durch Hindurchblasen von Stickstoff während einiger Sekunden von Sauerstoff befreit; danach wurde das Rohr unter Vakuum verschlossen. Nach 24 h Stehen bei Raumtemperatur im Dunklen wurde der Latex zweimal mit 0,4m Carbonatpuffer vom pH 9,6 mit einem Gehalt von Λ% BSA (Rinderserumalbumin) und 0,1% Tween-20 gewaschen und erneut in GBS (mit Glycin gepufferte Salzlösung)/BSA suspendiert. Nicht kovalent gebundenes IgG wurde mit Tween-20 entfernt. Um den Antikörper (IgG), der an die Proteingrenzfläche gekuppelt ist, zu digerieren, wurden die Teilchen in 0,1m Acetatpuffer vom pH 3,2 suspendiert und 1 h bei 37 ⁰C mit Pepsin bei einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1 : 10 (Gewicht/Gewicht) bebrütet. Nach Zentrifugieren und zweimaligem Waschen der Teilchen mit 0,1m Glycin/HCl-Puffer vom pH 9,2 mit einem Gehalt von 0,17m NaCl (GBS) und Ί% Rinderserumalbumin (BSA) (GBS/BSA), wurde die Anwesenheit von nicht angegriffenem IgG auf den Teilchen durch Messung der Agglutinierung mit Rheumatoidsera überprüft, und Latexpräparate, die mit Rheumatoidsera reagierten, wurden erneut mit Pepsin digeriert, bis keine weitere derartige Agglutinierung beobachtet wurde. Latexagglutinierungstests auf Ferritin im Serum wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt, wobei das obengenannte Reagenz verwendet wurde, und es wurden sehr zufriedenstellende Ergebnisse erhalten.

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Claims

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Patentansprüche

1 J Verfahren zur Durchführung von Immunoassays, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antigen in einer Flüssigkeit mit den F (ab ¹Jp"" Untergruppen eines Immunglobulins, das für dieses Antigen spezifisch ist, umsetzt, wobei die Umsetzung praktisch in Abwesenheit von Gesamtimmunglobulin und F(c)-Untergruppen davon durchgeführt wird.
2. Verfahren zur Durchführung eines Assays einer Flüssigkeit zum Nachweis und bzw. oder zur Bestimmung eines Antigens darin,

dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) die Flüssigkeitsprobe mit den F(ab'^-Untergruppen eines Immunglobulins, das für das Antigen spezifisch ist, unter Ausbildung eines Reaktionsgemisches, das von Gesamtimmunglobulin und den F(c)-Untergruppen davon praktisch frei ist, vermischt;

(b) das Gemisch zur Ermöglichung der Umsetzung zwischen den ' F (ab · )p-Untergruppen und dem vorhandenen Antigen bebrütet und

(c) ggf. das Ausmaß, bis zu dem die Umsetzung in dem Gemisch erfolgt ist, bestimmt und dadurch die Anwesenheit und bzw. oder die Menge des Antigens in der Flüssigkeitsprobe bestimmt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die F(ab')^-Untergruppen in Lösung verwendet.

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4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil der F(ab·)^-Untergruppen eine sie identifizierende Markierung aufweisen und das Ausmaß der Umsetzung zwischen Antigen und den Untergruppen durch Verwendung dieser Markierung bestimmt wird.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die antigenhaltige Flüssigkeit mit sowohl markierten als auch unmarkierten F(ab¹ ^-Untergruppen vermischt, wobei eine kompetitive Bindungsreaktion zwischen den Untergruppen und dem Antigen erfolgt, und die Menge an markierten Untergruppen, die entweder mit dem Antigen reagiert haben oder die in dem Gemisch nicht umgesetzt zurückgeblieben sind, analysiert und dadurch die Anwesenheit und bzw. oder die Menge an Antigen in der Flüssigkeit bestimmt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als F(ab¹ )₂-Untergruppen solche verwendet, die an ein wasserunlösliches Substrat gebunden sind.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat ein solches in Folienform oder in Form eines hohlen Rohres verwendet.
8. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man Untergruppen verwendet, die an wasserunlösliches teilchenförmiges Material gebunden sind.

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9. Verfahren gemäß Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet, daß man Untergruppen verwendet, die an Latexteilchen ge- ■ bunden sind.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe der zu untersuchenden Flüssigkeit mit Latexteilchen, an die die F(ab^f)p-Untergruppen gebunden sind, zu einem Umsetzungsgemisch vermischt, wobei die Umsetzung zynischen dem Antigen und den F(ab' )p-Untergruppen eine Agglutinierung des Latex hervorruft, und das Gemisch ggf. zur Bestimmung des Ausmaßes der Agglutinierung untersucht und dadurch die Anwesenheit und bzw. oder Menge des Antigens in der Flüssigkeitsprobe bestimmt.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet, daß man das Ausmaß der Agglutinierung durch selektives Auszählen der nicht agglutinierten Latexteilchen bestimmt.
12. Verfahren gemäß Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Untergruppen solche verwendet, die an_ wasserunlösliches teilchenförmiges Material, das magnetisch anziehbar ist, gebunden sind und daß man das teilchenförmige Material nach der Umsetzung zwischen Antigen und unter Anwendung eines Magnetfeldes abtrennt.
13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als zu untersuchende Flüssigkeit eine solche verwendet, die den Rheumatoidfaktor und die Komponente C1q zusätzlich zu dem Antigen enthält.

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14. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als zu untersuchende Flüssigkeit menschliches Serum verwendet.
15. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Methode des kontinuierlichen Durchflusses anwendet.
16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch geke η η zeichnet, daß man es auf bestimmte manuelle Weise durchführt.
17. Reagenz zur Verwendung bei Immunoassays, enthaltend eine Suspension aus feinverteiltem teilchenförmigen! Material, an das die F(ab¹)₂-Untergruppen eines Immuriglobulins gebunden sind, wobei die Suspension praktisch frei von dem Immunglobulin und den F(c)-Untergruppen davon ist.
18. Reagenz gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das teilchenförmige Material magnetisch anziehbares Material enthält.
19. Reagenz gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form einer Latexsuspension vorliegt.

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