DE3006899A1 - Biologische analyse - Google Patents
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Description
TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y., VStA
Biologische Analyse
Die Erfindung betrifft die Analyse von Flüssigkeiten, insbesondere, jedoch nicht ausschließlich von biologischen
Flüssigkeiten, wie Serum, hinsichtlich immunchemischer Substanzen, wie Antigenen oder Antikörpern. In der vorliegenden
Beschreibung werden die Bezeichnungen "Ag", "Ab" und "Ab:Ag" für ein Antigen bzw. Antigene (worin Haptene
und andere Substanzen eingeschlossen sein sollen, die durch Antikörper oder analoge bindende Proteine gebunden
werden können,) einen Antikörper bzw. Antikörper (,einschließlich ähnlicher bindender Proteine und solcher Proteine,
wie des Rheumafaktors (RF), C1q, des aktiven Bestandteils von Mäuseserum und der Aszites-Flüssigkeit der
Maus) bzw. für Komplexe aus Ag und Ab verwendet.
Bekanntlich reagiert Ag mit einem geeigneten Ab zu Ab:Ag, und die meisten Immunoassay-Verfahren bedienen sich
dieser Umsetzung. Es ist weiter bekannt, teilchenförmige
Materialien, wie beispielsweise solche aus Polystyrol (im allgemeinen als Latex bezeichnet) mit einem Ab oder Ag zu
überziehen und anschließend die überzogenen Teilchen der zu untersuchenden Probenlösung auszusetzen, um zu sehen,
ob und in welchem Ausmaß die Teilchen agglutinierf werden. Die Agglutination zeigt die Anwesenheit eines Ab oder Ag
in der Probe an, das mit zwei oder mehreren überzogenen Latexteilchen reagieren kann, um Agglutination zu verursachen.
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Während das Verfahren der Beobachtung der Agglutination von überzogenen Teilchen in vielfältiger Hinsicht
zufriedenstellend ist, gibt es bei der Bestimmung kleiner Mengen (in besonders niedrigen Konzentrationen) von Ab
oder Ag Schwierigkeiten. Die kleine Menge Ab oder Ag kann nicht ausreichend sein, um eine verläßlich beobachtbare
Agglutination der mit Ab bzw. Ag überzogenen Latexteilchen zu gewährleisten. Somit erfolgt eine bestimmbare Agglutination
zufolge der Größen- und daher Massendifferenzen zwischen Antigenen oder Antikörpern und normalerweise verwendeten
Latexteilchen lediglich dann, wenn zwischen zwei oder mehreren Latexteilchen mehrere Antigen/Antikörper-Brücken
gebildet werden. Wenn jedoch die Anzahl der Antigen- oder Antikörpermoleküle sehr gering ist, ist die statistische
Wahrscheinlichkeit, daß mehrere Antikörperbrücken für jede Agglutination gebildet werden können, sehr gering,
weshalb auch die Agglutination sehr gering' ist. -
Es wurde nun ein Verfahren zur Überwindung dieser Schwierigkeit gefunden, bei dem zwei verschiedene beschichtete
Teilchen verwendet werden.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis und bzw. oder zur Bestimmung eines.spezifischen Antikörpers
oder Antigens in einer Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
a) die Flüssigkeit mit einem ersten mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz, das mit
dem zu bestimmenden Antikörper oder Antigen unter Komplexbildung eine Bindung eingeht, vermischt,
b) das Gemisch aus Stufe a) mit einem zweiten, anderen mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen
Reagenz- versetzt, das mit dem in Stufe a) gebildeten Komplex unter Ausbildung eines Agglutinate , jedoch nicht mit freiem
ersten teilchenförmigen Reagenz eine Bindung eingeht, und
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-Ίο) das nicht agglutinierte erste oder zweite teilchenförmige
Reagenz selektiv bestimmt und dadurch das Vorhandensein und bzw. oder die Menge des zu bestimmenden
Antikörpers oder Antigens bestimmt.
Erfindungsgemäß wird also das zu bestimmende Antigen oder der zu bestimmende Antikörper mit einem ersten teilchenförmigen
Reagenz vermischt, das mit Ab oder Ag eine Bindung ausbildet. Die Bindungsreaktion
Ab + Teilchen [Ab · Teilchen] (1)
ist reversibel. Das geringe Ausmaß an Agglutination, das stattfindet, ist unzureichend, um eine genaue und zuverlässige
Messung zu gestatten. Das Gemisch wird deshalb anschließend mit einem Überschuß eines zweiten teilchenförmigen
Reagenzes versetzt. Dieses zweite Reagenz bindet sich an den Komplex (Ab · Teilchen) unter Ausbildung eines Agglütinats,
wodurch der Komplex aus dem Gleichgewicht wirksam entfernt wird, das dadurch gemäß Gleichung (1) nach rechts
verschoben wird. So kann die Gesamtmenge an zu bestimmendem Ab oder Ag in Komplexe überführt und agglutiniert werden.
Durch Messen der Menge an erstem oder zweitem Reagenz, die nicht agglutiniert in dem Gemisch zurückgeblieben ist, kann
die Anwesenheit und bzw. oder Menge an Ab oder Ag bestimmt werden.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zum Nachweis und bzw. oder zur Bestimmung des Rheumafaktors
(RF) in einer Flüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
a) die Flüssigkeit mit einem ersten mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz , das mit
dem Rheumafaktor eine Bindung eingehe, vermischt,
b) das Gemisch aus Stufe a) mit einem zweiten, anderen mikroskopischen oder submikroskopischen , teilchenförmigen
Reagenz versetzt, das mit den ersten Reagenzteilchen , die an den Rheumafaktor gebunden sind, unter Ausbildung eines
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Agglutinate, jedoch nicht mit den Teilchen des ersten Reagenzes, die nicht an den Rheumafaktor gebunden sind,
eine Bindung ausbildet, und
c) das nicht agglutinierte erste oder zweite teilchenförmige
Reagenz selektiv bestimmt und dadurch die Anwesenheit und bzw. oder die Menge an Rheumafaktor bestimmt.
Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten teilchenförmigen Reagenzien besitzen mikroskopische oder
submikroskopische Größe, d.h. sie sind im allgemeinen kleiner als 15/U und gewöhnlich nur einige Mikron oder unter
einem Mikron groß. Latexteilchen derartiger Größe sind im Handel erhältlich. Es ist bekannt, Ab oder Ag an mikroskopisches
teilchenförmiges Material, wie Latex, zu binden. Dies erfolgt normalerweise durch Herstellung einer reaktionsfähigen
Beschichtung auf dem Teilchen und anschließende chemische Bindung oder Adsorption von Ab oder Ag daran. In
bestimmten Fällen ist es auch möglich, Ab oder Ag unmittelbar an das Teilchen (ohne dazwischengeschobene Beschichtung)
zu binden. Da die Art der Herstellung der teilchenförmigen Reagenzien nicht zur vorliegenden Erfindung gehört
und wohlbekannt ist, wird sie hier nicht näher beschrieben.
In Stufe c) des Verfahrens wird das nicht agglutinierte erste oder zweite teilchenförmige Reagenz selektiv
ermittelt und dadurch die Anwesenheit und bzw. oder Menge an zu ermittelndem Ab oder Ag festgestellt. Gemäß einer
bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die selektive Bestimmung durch Auszählen des freien ersten oder zweiten teilchenförmigen Reagenzes in
Anwesenheit des Agglutinats, d.h. ohne weiteren Trennungsschritt, durchgeführt. Dies kann dadurch erzielt werden,
daß man erste und zweite teilchenförmige Reagenzien mit unterschiedlicher Größe verwendet, so daß mindestens eines
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der beiden teilchenförmigen Reagenzien selektiv in dem
Umsetzungsgemisch ausgezählt werden kann. Zähleinrichtungen, die für diesen Zweck eingesetzt werden können, sind
bekannt. Sie können so programmiert werden, daß sämtliche Teilchen außerhalb eines gewissen Größenbereiches unberücksichtigt
bleiben, so daß durch Auswahl geeigneter Größen für die beiden Reagenzien ein selektives Auszählen
des einen in Anwesenheit des anderen sowie in Gegenwart von Agglutinat erreicht werden kann. Im allgemeinen beträgt
die Mindestteilchengröße, die zuverlässig ausgezählt werden kann, etwa 0,6/U, so daß mindestens eines der beiden teilchenförmigen
Reagenzien mindestens diese Größe aufweist. Das andere Reagenz kann kleinere oder größere Teilchengrößen
aufweisen. Es wird bevorzugt, daß das andere Reagenz kleiner ist und vorzugsweise eine Größe von unter
0,6/U aufweist, so daß keine signifikante Möglichkeit besteht,
daß es bei der Auszählung des ersten Reagenzes stört. Wenn das zweite Reagenz kleiner als das erste -ist, wird
außerdem seine Umsetzung mit dem Komplex , der gemäß Gleichgewicht (1) gebildet wird, wirkungsvoller. Vorzugsweise
besitzen die Teilchen des ersten Reagenzes mindestens die zweifache Größe der Teilchen des zweiten Reagenzes.
Vorzugsweise ist die Teilchengröße jedes teilchenförmigen Reagenzes praktisch gleichförmig.
Zwar ist es ein bevorzugtes Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens, eines der freien, teilchenförmigen Reagenzien
durch selektives Auszählen ohne vorherige Abtrennungsstufe zu bestimmen, jedoch ist es auch möglich, eines
der freien, teilchenförmigen Reagenzien (oder beide) von dem Agglutinat abzutrennen und anschließend die selektive
Bestimmung gemäß Stufe c). durchzuführen. Die Abtrennungsstufe kann auf vielfältige Weise durchgeführt werden, beispielsweise
durch Abzentrifugieren. Vorzugsweise besteht ein Größenunterschied zwischen den beiden teilchenförmigen
Reagenzien, so daß nach dem Zentrifugieren das Agglutinat
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und das größere der "beiden teilchenförmigen Reagenzien
sedimentiert sind, während das andere freie teilchenförmige
Reagenz für die Bestimmung in Suspension bleibt. Die
Bestimmung kann durch Auszählen oder in anderer beliebiger Form durchgeführt werden. Beispielsweise kann das
verbleibende freie teilchenförmige Reagenz eine es identifizierende Markierung, wie beispielsweise ein radioaktives
Atom, einen Fluorophor oder ein Enzym, tragen, und die Bestimmung kann mit Hilfe der Markierung auf bekannte
Weise durchgeführt werden.
Eine andere Methode, bei der die Abtrennung sehr bequem und leicht erzielt werden kann, besteht darin, daß
man in eines der teilchenförmigen Reagenzien magnetisch anziehbares Material einbringt, so daß dieses Reagenz
(sowohl in freier Form als auch im Agglutinat) nach Anlegen eines magnetischen Feldes sedimentiert oder auf andere
Weise an einen bestimmten Ort verbracht werden kann, während das andere (nichtmagnetische) freie.Reagenz in Suspension
bleibt. Wiederum kann das freie Reagenz auf beliebige zweckmäßige Weise , wie beispielsweise durch Auszählen
oder Verwendung einer Markierung, wie oben beschrieben, bestimmt v/erden. Magnetisch anziehbare Teilchen sind
bekannt.
Bei der Ausführung des Verfahrens gemäß der Erfindung zum Nachweis eines bestimmten Ab oder Ag ist es
lediglich erforderlich, festzustellen, ob eine Agglutination
überhaupt stattgefunden hat. D.h., es ist lediglich erforderlich, festzustellen, ob überhaupt das erste oder
das zweite teilchenförmige Reagenz unter Agglutinatbildung aufgenommen worden ist. So kann beispielsweise durch
Auszählen der Teilchen des ersten Reagenzes, die im Umsetzungsgemisch frei zurückgeblieben sind, und Vergleichen
des Ergebnisses mit der Zahl dieser Teilchen, die man in Stufe a) zugesetzt hat, bestimmt werden, ob überhaupt
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Teilchen des ersten Reagenzes an den Antikörper oder das Antigen, die nachgewiesen werden sollen, gebunden und auf
diese Weise in das Agglutinat aufgenommen worden sind.
Für quantitative Bestimmungen bedient man sich normalerweise Standardergebnissen, d.h. Ergebnissen, die unter
Verwendung bestimmter Mengen von Reagenzien zur Bestimmung bekannter Mengen von bestimmtem Ab oder Ag erhalten worden
sind. Dann ist es möglich, eine unbekannte Menge von demselben Ab oder Ag lediglich durch Vergleichen des Bestimmungsergebnisses
von Stufe c) mit den Standardergebnissen festzustellen. Die Verwendung von Standardergebnissen,
beispielsweise Standardkurven, in dieser allgemeinen Weise ist bekannt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Nachweis und zur Bestimmung der verschiedenartigsten Antikörper verwendet
werden, die vom Körper gegen Virus- oder bakterielle Infektionen erzeugt werden, wie beispielsweise zum Nachweis
und zur Bestimmung von Antikörpern gegen DNS, den Masernvirus, Nahrungsmittelantigene, Bruceila sowie andere
Substanzen, wie Ferritin. Das erfindungsgemäße Verfahren
eignet sich besonders zur Bestimmung geringer Mengen von Antikörpern im menschlichen Serum. Beispielsweise ist es
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, geringe Mengen an IgE-Antikörpern gegenüber einem bestimmten Allergen
in Gegenwart von IgE und IgE-Antikörpern gegenüber anderen Antigenen quantitativ zu bestimmen«,
Die Bestimmung und Titrierung von IgE-Antikörpern gegenüber bestimmten Allergenen wird gewöhnlich dazu eingesetzt,
um die Substanzen zu identifizieren, gegenüber denen Patienten allergisch sind. Bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren werden die Teilchen des ersten Reagenzes mit dem Allergen überzogen, beispielsweise Extrakten von Hausstaub,
Katzenfell oder Graspollen, indem man beispielsweise eine
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Adsorption oder eine kovalente Bindung eintreten läßt. Dieser Latex wird anschließend im Serum eines Patienten
inkubiert. Wenn dieses Serum IgE-Antikörper gegen das auf den Teilchen vorhandene Allergen enthält, werden diese
Teilchen die Antikörper aufnehmen. Durch Verwendung der Teilchen des zweiten Reagenzes, die beispielsweise Kaninchen-
oder Ziegenantikörper gegen menschliche IgE-Antikörper tragen, wird es ermöglicht, die mit dem Allergen
beschichteten Teilchen zu agglutinieren, sofern IgE-Antikörper
an sie gebunden sind. Das Ausmaß der Agglutination hängt von der Menge an gebundenen IgE-Antikörpern ab.
Unter Verwendung von Teilchen des zweiten Reagenzes, die mit Anti-IgG- oder Anti-IgA-Antikörpern überzogen sind,
ist es möglich, die Antikörper anderer Klassen zu bestimmen. Um eine Störung durch Immunglobuline zu vermeiden,
die sich mit dem auf den Teilchen vorhandenen Allergen nicht umgesetzt haben, kann der Latex zentrifugiert und
gewaschen werden. Die beiden Stufen des Verfahrens können wie folgt schematisch dargestellt werden:
(1) Lx- Graspollen + IgE Anti-Graspollen + IgE-Anti-(andere
Allergene) —> Lx - Graspollen - IgE-Anti-Graspollen
+ IgE-Anti-(andere Allergene)
(2) Lx- Graspollen - IgE-Anti-Graspollen + Lx-Anti-IgE-Antikörper
—^ Agglutination.
Mit Antigen beschichteter Latex kann durch mit Antigen beschichtete magnetisierte Teilchen ersetzt werden.
In diesem Falle wird eine magnetische Trennung anstelle der Zentrifugentrennung angewandt, und eine weitere magnetische
Trennung kann durchgeführt werden, nachdem die Teilchen des zweiten Reagenzes zugesetzt worden sind, so
daß lediglich die freien Teilchen des zweiten Reagenzes in der Suspension zum Auszählen zurückbleiben.
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Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auch zur Bestimmung des Rheumafaktors (RF) und anderer ähnlicher
bindender Proteine oder Agglutinatoren anwenden (beispielsweise C1q, die aktive Fraktion von Mäuseserum US-PS
4 162 895 - und die aktive Fraktion von Aszitesflüssigkeit von Mäusen - europäische Patentanmeldung
79302342.5). RF ist ein Autoantikörper, der gegen IgG
wirkt. Er kann selbst ein Immunglobulin der Klasse IgG, IgM oder IgA sein. Die Identifizierung der Klasse des
Rheumafaktors kann für die Diagnose und die Beurteilung der Schwere bestimmter Krankheiten von Bedeutung sein,
und diese Identifizierung kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielt werden. Bei dem Verfahren wird RF zunächst
aus dem Serum aufgenommen, beispielsweise durch Vermischen des Serums mit mit Kaninchen-IgG überzogenen
magnetisierten Celluloseteilchen. Die Teilchen, die RF
tragen, werden abgetrennt und gewaschen und anschließend mit Teilchen des zweiten Reagenzes vermischt, die beispielsweise
mit Ziegen-IgG-Anti-Human-IgG (oder -Anti-Human-IgA
oder -Anti-Human-IgM, wie erforderlich) überzogen sind. Nach einer magnetischen Trennung werden die
freien Teilchen des zweiten Reagenzes ausgewzählt.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur Bestimmung von Ag. Bei diesem Verfahren wird das das
Antigen enthaltende Serum zunächst mit Latexteilchen vermischt, die dasselbe Antigen tragen, sowie einer beschränkten
Menge Ab gegen das Ag. Das freie und das an Latex gebundene Ag konkurrieren um den Ab, und die Menge an Ab,
die an das Latex-Ag unter Bildung eines Immunkomplexes auf dem Latex gebunden wird, hängt von der Menge an freiem
Ag in der Serumprobe ab. Nun wird das zweite teilchenförmige Reagenz zugesetzt, das als Reagenz. Ab gegen den in
der ersten Stufe verwendeten Ab enthält. Das zweite Reagenz verursacht somit eine Agglutination derjenigen Teilchen des
ersten Reagenzes, die einen Immunkomplex tragen. Durch Mes-
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sen der ersten oder zweiten nicht agglutinierten Reagenzteilchen kann das Ag im Serum nachgewiesen und bzw. oder
bestimmt werden.
Diese Bestimmung kann beispielsweise für Progesteron verwendet werden, wobei als erstes teilchenförmiges Reagenz
ein 0,8-/U-Latex verwendet wird, der durch physikalische Adsorption mit einem Konjugat aus Ferritin und
Progesteron überzogen ist, während man als zweites teilchenförmiges Reagenz 0,2/u große Teilchen verwendet, die
durch Adsorption mit Ziegen-IgG-Anti-Kaninchen-IgG überzogen
sind. Das verwendete Antiserum ist Kaninchen-Antiprogesteron-Antiserum.
Bei dem Verfahren zur Bestimmung von Ag, wie oben beschrieben, wird die Bestimmung tatsächlich bezüglich der
Menge von Ab durchgeführt, die zur Verfügung steht, um sich an das erste teilchenförmige Reagenz zu binden, und diese
Menge ist ihrerseits von der Menge Ag abhängig, die im Serum vorhanden ist.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist das erste teilchenförmige Reagenz gegenüber der zu bestimmenden Substanz
selektiv, und die Teilchen des ersten Reagenzes sind vorzugsweise größer als diejenigen des zweiten Reagenzes.
Von den Teilchen des zweiten Reagenzes wird ein großer Überschuß verwendet, um für den Prozoneneffekt Vorsorge
zu tragen (to provide for the prozone effect).
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
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Beispiel 1
Bestimmung von IgE-Antikörpern in menschlichem Serum
Bestimmung von IgE-Antikörpern in menschlichem Serum
IgE-Antikörper gegen ein Allergen (beispielsweise Kreuzkrautpollen
(ragweed pollen)) werden wie folgt bestimmt:
Latexteilchen von verhältnismäßig großem Durchmesser (beispielsweise 0,79/u) werden mit dem Allergen überzogen,
beispielsweise durch einfache Adsorption oder durch kovalente Bindung mit Bromcyan- oder hydroxyliertem Latex.
Eine Menge von beispielsweise 50 /ul Serum wird mit einer
Menge von beispielsweise 50/ul einer Suspension dieser
Teilchen in einer Pufferlösung (beispielsweise 10 Teilchen/ ml) vermischt. Das Gemisch wird etwa 10 min bei 25 0C bebrütet.
Anschließend wird eine Menge von beispielsweise 50/Ul Latexteilchen mit einem verhältnismäßig geringen
Durchmesser von beispielsweise 0,08/U zugesetzt. Diese Teilchen sind mit Kaninchen-Anti-IgE-Antikörpern durch
Adsorption überzogen worden. Die Teilchen werden dem Gemisch in Form einer Suspension von etwa 10' Teilchen/ml
in einem Puffer zugesetzt.
Das erhaltene Gemisch wird etwa 10 min bei 25 0C
bebrütet und anschließend mit etwa 60 ml GBS-Puffer (O,1M
Glycin, 0,17M NaCl, pH 9) verdünnt und schließlich durch
einen Teilchenzähler gesaugt, der so eingerichtet ist, daß er sowohl große Agglutinate als auch die Latex-Ab-Teilchen
unberücksichtigt läßt. Die Anzahl an nicht agglutinierten
großen Latexteilchen ist umgekehrt proportional der Menge an IgE, die an das Allergen auf den großen Teilchen gebunden
ist, und demzufolge zur Menge an IgE im Serum.
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3ÖÖ&899
Beispiel 2
Bestimmung des Rheumafaktors
Bestimmung des Rheumafaktors
Reagenzien: Kaninchen-IgG wurde an magnetisierte Celluloseteilchen
gekuppelt, deren Teilchengröße einer Gauss'sehen
Verteilung folgt, wobei 95% zwischen 0,5 und 3,0/U liegen.
Polystyrolteilchen von 0,8/U Dicke wurden durch physikalische
Adsorption entweder mit Ziegen-IgG-Anti-Human-IgG, Ziegen-IgG-Anti-Human-IgA oder Ziegen-IgG-Anti-Human-IgM
überzogen. Zuvor waren die Ziegen-Antiseren durch Kaninchen-IgG absorbiert worden, um eine Kreuzreaktion mit dem
Material zu verhindern, das die Celluloseteilchen überzieht. Das Reaktionsmedium bestand aus einer 0,1M Glycin-Natronlauge-Pufferlösung
vom pH-Wert 9,2 mit einem Gehalt von 0,17M NaCl.
75/Ul der Suspension der magnetischen Teilchen (5 rag/ml Glycinpuffer) wurden in 3-ml-Glasröhrchen mit
300/Ul verschiedener Verdünnungen von Serum 45 min lang
bei Raumtemperatur auf einem Wirbelmischer bebrütet. Die magnetischen Teilchen wurden anschließend dreimal mit
2 ml Glycinpuffer gewaschen, wobei ein Magnet verwendet wurde, um die Teilchen einzufangen. Nach der letzten Waschung
und einem Zusatz von 75/ul Glycinpuffer wurde die Suspension in drei Glasröhrchen verteilt, von denen je
eines zur Bestimmung einer der Antikörperklassen verwendet wurde. Eine Probe von 100/Ul der Suspension (0,625 g/l)
aus Anti-IgG-Latex wurde in das Röhrchen Nr. 1, von Anti-IgA-Latex
in das Röhrchen Nr. 2 und von Anti-IgM-Latex in das Röhrchen Nr. 3 eingebracht. Latex und Celluloseteilchen
wurden 30 min bei Raumtemperatur auf einem Wirbelmischer bebrütet.
Nach Verdünnung mit 2 ml Glycinpuffer wurden die Röhrchen zweimal umgedreht und die magnetischen Teilchen mit
Hilfe eines Magnetes an der Röhrchenwand zurückgehalten. 250 /Ul der überstehenden Flüssigkeit wurden in 2 ml Glycinpuffer
verdünnt und in eine automatische Analysiervorrich-
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tung (Technicon AutoAaalyser) eingesaugt. Die Teilchen,
die nicht magnetisch zurückgehalten worden waren, wurden dabei gezählt (AutoCounter). Die Anzahl der Teilchen wurde
mit der Verdünnung des untersuchten Serums in Beziehung gesetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann absatzweise oder nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses automatisch
durchgeführt werden. Als Beispiel für ein automatisiertes System kann folgende Verfahrensweise dienen:
50 /Ul einer vorbereiteten Probe werden durch eine peristaltische Pumpe gleichzeitig mit 50/ul Latex-Allergen
angesaugt. Der erhaltene Strom läuft 10 min lang durch eine mit einer Frequenz von 50 Hz schwingende Mischschlange.
Nach dem Auftauchen aus der Schlange verbindet sich der Strom mit einem weiteren Strom, der mit einer
Geschwindigkeit von 0,1 ml/min fließt und Latex-Ab-Konjugat
enthält. Die vereinigten Ströme fließen 5 min lang durch eine zweite Vibrations-Mischschlange. Danach wird
der Strom 400fach verdünnt und anschließend durch eine Zellenzählanlage geschickt, die mit einer doppelten Schwelle
ausgestattet ist, um sowohl agglutinierte Teilchen als auch den kleinen Latex-Ab zu eliminieren.
Selbstverständlich werden das Serum oder die Flüssigkeit, die zu untersuchen sind, in den Fällen, daß sie Substanzen
enthalten, die das erfindungsgemäße Verfahren stören könnten, vorher behandelt, um derartige Substanzen
zu entfernen oder zu inaktivieren.
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Claims (17)
- Patentanwälte ' - - : 9607Reichel u. ReicHel6 Frankfurl a. M. 1 Λ Λ Λ _ Λ _ ΛParksi:aBel3 3006899TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, N.Y., VStAPatentansprücheVerfahren· zur Analyse einer Flüssigkeit hinsichtlich nes darin enthaltenen Antikörpers oder Antigens,
dadurch gekennzeichnet, daß mana) die Flüssigkeit mit einem ersten mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz, das mit dem zu untersuchenden Antikörper oder Antigen unter Ausbildung eines Komplexes eine Bindung eingeht, vermascht,b) das Gemisch aus Stufe a) mit einem zweiten, anderen mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz versetzt, das mit dem in Stufe a) gebildeten Komplex unter Ausbildung eines Agglutinate, jedoch
nicht mit freiem ersten teilchenförmigen Reagenz eine
Bindung eingeht, undc) die nicht agglutinierten Anteile des ersten oder zweiten teilchenförmigen Reagenzes selektiv bestimmt
und dadurch den zu untersuchenden Antikörper oder das zu untersuchende Antigen nachweist und bzw. oder bestimmt. - 2. Verfahren zur Analyse einer Flüssigkeit hinsichtlich des in ihr enthaltenen Rheumafaktors (RF),
dadurch gekennzeichnet, daß mana) die Flüssigkeit mit einem ersten mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz vermischt, das mit dem zu untersuchenden RF eine Bindung eingeht,b) das Gemisch aus Stufe a) mit einem zweiten, anderen mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz versetzt, das mit denjenigen ersten Reagenzteilchen, die an RF gebunden sind, unter Ausbildung eines Agglutinate, jedoch nicht mit denjenigen ersten Reagenzteilchen, die
nicht an RF gebunden sind, eine Bildung eingeht, und030037/0686c) die nicht agglutinierten Anteile des ersten oder zweiten teilchenförmigen Reagenzes selektiv bestimmt und dadurch den zu untersuchenden RF nachweist und bzw. oder bestimmt. - 3. Verfahren gemäß Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe b) als zweites Reagenz ein IgG, IgM oder IgA verwendet, wobei in Stufe c) die IgG-, IgM- bzw. IgA-Fraktion des RF bestimmt wird. - 4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß man als erste und zweite teilchenförmige Reagenzien solche mit unterschiedlicher Größe verwendet, so daß in Q Stufe c) mindestens entweder die nicht .agglutinierten ersten oder zweiten Reagenzteilchen.im Gemisch mit" ersten und zweiten Reagenzteilchen und Agglutinat ©hne Abtrennung selektiv gezählt werden können und das nicht agglutinierte erste oder zweite teilchenförmige Reagenz durch eine derartige selektive Auszählung nachgewiesen oder bestimmt wird.
- 5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man für eines der teilchenförmigen Reagenzien eine Teilchengröße unter 0,6/U und für das andere eine Teilchengröße von über 0,6/U wählt.
- 6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das zweite teilchenförmige Reagenz kleiner als das erste wählt.030037/0686
- 7. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe c) mindestens eines der freien ersten und zweiten teilchenförmigen Reagenzien von dem Agglutinat vor der selektiven Bestimmung abtrennt.
- 8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung durch Zentrifugieren durchführt.
- 9. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als eines der ersten und zweiten teilchenförmigen Reagenzien ein solches wählt, das magnetisch anziehbares Material enthält, und man die Trennung dadurch durchführt, daß man ein magnetisches Feld zur Trennung von Agglutinat und freien magnetischen Teilchen des einen Reagenzes von den freien Teilchen des anderen Reagenzes anlegt.
- 10. Verfahren gemäß Anspruch 7, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als eines der teilchenförmigen Reagenzien ein solches wählt, das eine Markierung trägt und die freien Teilchen nach der Abtrennung von dem Agglutinat aufgrund der Markierung bestimmt.
- 11. Verfahren gemäß Anspruch 7, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das freie teilchenförmige Reagenz oder eines von ihnen, das von dem Agglutinat abgetrennt worden ist, durch Auszählen bestimmt.030037/06863006B99
- 12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man solche teilchenförmigen Reagenzien wählt, die aus Latexteilchen bestehen, die ein Reagenz tragen.
- 13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzei c h net, daß man jedes teilchenförmige Reagenz mit gleichmäßiger Teilchengröße wählt.
- 14. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Flüssigkeit eine Flüssigkeit des menschlichen Körpers wählt.
- 15. Verfahren gemäß Anspruch 14,
dadurch gekennzeichnet, daß man in Spurenmengen vorhandene Antikörper oder Rheumafaktor bestimmt. - 16. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Menge eines Antikörpers bestimmt, wobei die Menge des Antikörpers von der Menge eines Antigens abhängt, das ebenfalls in der Flüssigkeit vorhanden ist, wodurch aufgrund des Ergebnisses der Bestimmung die Menge= an Antigen bestimmt werden kann. - 17. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Technik des kontinuierlichen Durchflusses anwendet.030037/0686
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