DE2905154C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
eines magnetisch anziehbaren, teilchenförmigen Reagenzmaterials
für analytische Zwecke sowie ferner seine Verwendung
für immunologische Bestimmungen (Assays).
Bekanntlich lassen sich Antigene (und Haptene),
Antikörper (und andere bindende Proteine) sowie weitere
Substanzen, wie Arzneimittel, in Flüssigkeiten von beispielsweise
biologischer Herkunft, durch eine kompetitive
Bindungsreaktion unter Verwendung eines markierten Reagenzes
bestimmen, wobei die Bestimmung dadurch
bewirkt wird, daß man entweder die Menge an Markierung
mißt, die in einem Komplex gebunden vorliegt, oder diejenige,
die in Lösung ungebunden geblieben ist. Ein Beispiel
für ein derartiges Verfahren ist der bekannte Radioimmunoassay
(RIA), bei dem eine radioaktive Markierung verwendet
wird. Analoge Techniken sind unter Verwendung anderer
Markierungen, wie beispielsweise von Enzymen und Fluorophoren,
bekannt.
Bei diesen Verfahren ist es im allgemeinen erforderlich,
entweder die gebildeten Komplexe oder das freie,
nicht gebundene, markierte Reagenz von dem Rest des Umsetzungsgemisches
abzutrennen, um die Menge an Markierung
in einem der beiden Teile zu bestimmen. Diese Abtrennung
läßt sich selten leicht durchführen und stellt daher bei
diesen Assays eine Fehlerquelle dar.
Um diese Schwierigkeiten zu vermeiden oder zumindest
zu verringern, bedient sich ein Verfahren gemäß
der BE-PS 8 52 327 magnetisch anziehbarer Teilchen, die
auf ihrer äußeren Oberfläche ein kovalent an diese gebundenes
Reagenz aufweisen. Die Teilchen können zusammen
mit dem Umsetzungsprodukt zwischen dem Reagenz und einer
markierten Komponente aus dem Umsetzungsgemisch sauber
und leicht von dem Rest des Reaktionsgemisches abgetrennt
werden, wonach die Markierung in diesem Rest oder auf den
Teilchen selbst gemessen werden kann.
Ein Nachteil dieses Verfahrens
liegt in der Tatsache,
daß die Herstellung der das Reagenz tragenden magnetischen
Teilchen häufig arbeits- und zeitaufwendig ist.
Die Teilchen bestehen aus magnetisch anziehbarem Material,
das in einer Polymerisatmatrix eingebettet ist, wofür gewöhnlich
Cellulose verwendet wird, und um ein teilchenförmiges
Reagenz daran zu binden, muß man die Cellulose zunächst
aktivieren und anschließend mit dem Reagenz umsetzen,
wobei normalerweise eine bifunktionelle Brückengruppe
verwendet wird. Die als Zwischenprodukt auftretenden aktivierten
Celluloseteilchen können nicht beliebig lange aufbewahrt
werden, so daß die beiden Herstellungsschritte
(Aktivierung und anschließende Umsetzung) jedesmal neu
durchgeführt werden müssen.
Außerdem kann die bekannte Polymerisatmatrix nicht
beliebig fein vermahlen werden, was für die Durchführung
von Immunoassays nach dem Prinzip des kontinuierlichen
Durchflusses von Nachteil ist.
Aus FR-PS 32 13 394 sind magnetisch nicht anziehbare,
nicht teilchenförmige, sondern gelöste Mischpolymerisate
bekannt, die neben freien Aldehydgruppen auch Carboxylgruppen
tragen, damit die Wasserlöslichkeit gewährleistet
wird. Insbesondere für Radioimmunoassays wären gelöste
Polymerisate völlig ungeeignet. Es ist nämlich unabdingbar,
daß magnetisch anziehbare Teilchen in wäßriger Lösung suspendiert
gehalten werden, was nur möglich ist, wenn die
sie einschließende Polymerisatmatrix ihrerseits in Suspension
und nicht gelöst vorliegt.
Aus Clinica Chimica Acta 63
(1975), S. 69 bis 72, ist die Verwendung magnetisch
anziehbaren Teilchen in Radioimmunoassays bekannt. Diese
Art der Verwendung stellt lediglich einen Sonderfall der
bereits aus BE-PS 8 52 327 bekannten allgemeinen Verwendbarkeit
in Immunoassays dar.
Es wurde nun ein lagerungsstabiles, reaktionsfähiges,
magnetisches Material gefunden, an das bestimmte
Reagenzien in einem im wesentlichen einstufigen Verfahren
zu einem Reagenzmaterial gebunden werden können und das
sich nahezu beliebig fein vermahlen läßt.
Der Gegenstand der Erfindung ist in den Ansprüchen
gekennzeichnet.
Im einzelnen wird Acrolein in Gegenwart von magnetisch
anziehbarem festem Material derart polymerisiert,
daß unmittelbar ein festes Polymerisat erzeugt wird, das
nach geeigneter Abtrennung von dem Umsetzungsgemisch
und notwendigem Auswaschen fein zerkleinert werden kann.
Eine derartige Polymerisation kann normalerweise in Abwesenheit
eines Lösungsmittels (d. h. als Substanzpolymerisation)
unter Verwendung eines Katalysators
durchgeführt werden. Beispielsweise wird das
monomere Acrolein mit N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin
vermischt, und es tritt rasch eine Polymerisation
unter Ausbildung eines festen Produktes ein.
Es ist auch möglich, die Polyacroleinmatrix durch
Radikalpolymerisation von Acrolein in Gegenwart von N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin
herzustellen. Wenn auf diese Weise
Acrolein in Gegenwart von Fe₃O₄ polymerisiert wird, bildet
sich leicht eine homogene Masse aus Substanzpolymerisat
und Fe₃O₄. Diese Masse kann leicht zu kleinen Teilchen vermahlen
werden.
An die Polyacroleinmatrix wird ein Reagenz gekuppelt,
das freie Amino- oder Sulfhydrylgruppen enthält. Reagenzien,
die freie Aminogruppen enthalten, sind beispielsweise
Proteine, wie Antikörper und Enzyme,
sowie bestimmte Antigene, Haptene, Arzneimittel und Antibiotika.
Beispiele für derartige Substanzen sind die
Thyroidhormone T₄ und T₃ (Thyroxin und Triiodthyronin),
die tricyclischen Antidepressiva (Nortriptylin, Desipramin
und Protriptylin), die Aminoglycosid-Antibiotika
(Gentamicin, Sisomycin, Netilmicin, Amikacin, Neomycin,
Streptomycin, Kanamycin und Tobramycin), Absorbentien mit
verschiedener Affinität für die Isolierung oder die Bestimmung
von Antikörpern und anderen bindenden Proteinen
sowie Zwischenprodukte bei der Herstellung von ersten
Antikörpern in fester Phase, die zur Bestimmung des paarweise
verbundenen Haptens verwendet
werden sollen.
Ein großer Vorteil der Erfindung besteht
darin, daß das Reagenz an die Polyacroleinteilchen durch
ein im wesentlichen einstufiges Verfahren gebunden werden
kann. So kann das Reagenz beispielsweise einfach in einem
Medium von geeignetem pH-Wert mit den Polyacroleinteilchen
in Berührung gebracht werden. Polymerisatmatrices,
die freie Aldehydgruppen enthalten, sind gegenüber freien
Aminogruppen selbstreagierend, und das Reagenz wird
somit mit der Matrix umgesetzt und unmittelbar an diese
gebunden. Das auf diese Weise gebildete Reagenzmaterial
gemäß der Erfindung ist anschließend gebrauchsfertig.
Die Selbstreaktivität der Polyacroleinteilchen ist ein
sehr großer Vorteil, da sich durch sie die Notwendigkeit
der Verwendung von Brückengruppen (wie beim Stand der Technik)
erübrigt; sie ist außerdem insgesamt ein einfacherer,
schnellerer und wirksamerer Vorgang.
Die Polyacroleinteilchen und das aus ihnen hergestellte
Reagenzmaterial gemäß der Erfindung sind 1 bis 20 µm groß
und besitzen ein spezifisches Gewicht von 1,4 bis 3,2, um
ein übermäßiges Aufschwimmen oder Absetzen der Teilchen in
strömendem flüssigem Reaktionsgemisch zu vermeiden.
Die Polyacroleinteilchen können in dem Zustand, bevor
das Reagenz an sie gebunden ist, aufbewahrt werden.
Die Polyacroleinteilchen müssen
während der Aufbewahrungsdauer von Substanzen ferngehalten
werden, mit denen sie reagieren könnten. Alternativ kann
die feste Masse aus unzerkleinerter selbstreagierender
Polyacroleinmatrix, die die magnetischen Teilchen enthält,
aufbewahrt werden, und wenn Teilchen benötigt werden,
können Teile der Masse zerkleinert werden, damit sie mit
einem Reagenz umgesetzt werden können. So kann das Reagenzmaterial
gemäß der Erfindung einfach und frisch unmittelbar
vor seiner Verwendung hergestellt werden.
Das Reagenzmaterial gemäß der Erfindung ist besonders
in Bestimmungen eines interessierenden Bestandteils von
Flüssigkeiten von Nutzen. Es kann auf diese Weise bei
manuellen oder automatischen Bestimmungen mit kontinuierlichem
Durchfluß verwendet werden, wie sie beispielsweise
in der US-PS 27 97 149 beschrieben sind. Es kann dort
verwendet werden, wie beispielsweise in der BE-PS 8 52 327
beschrieben.
Die genaue Art und Weise, auf die das Reagenzmaterial
gemäß der Erfindung bei biologischen Bestimmungen, wie Immunoassays,
wirkt, hängt von der Art des Reagenzes ab.
Beispielsweise kann in einem Immunoassay
auf ein Antigen unter Verwendung eines markierten Antigens
und eines Antikörpers oder anderen bindenden Proteins
der Antikörper das Reagenz auf dem Reagenzmaterial
sein. Unter diesen Umständen bildet das Reagenz sowohl mit
markiertem als auch mit unmarkiertem Antigen Komplexe und
kann nach Entfernung aus dem Reaktionsgemisch aufgrund der
Markierung bestimmt werden, oder das zurückbleibende Umsetzungsgemisch
kann auf die Markierung hin bestimmt werden.
In einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens enthält das Umsetzungsgemisch
(als zweites Reagenz) eine bestimmte Menge einer markierten
Substanz, die mit der zu bestimmenden Komponente unter
Ausbildung eines Komplexes mit ihr reagiert, und das Reagenz
auf dem Reagenzmaterial gemäß der Erfindung bindet
sich an den Überschuß aus dem zweiten Reagenz, wonach in
dem abgetrennten Gemisch die zu bestimmende
Komponente in der Probe
analysiert wird.
Bei diesem Verfahren
wird die Analyse entweder auf den Komplex oder auf den
nicht umgesetzten Überschuß des zweiten Reagenzes durchgeführt.
2 g Acrolein und 2 g magnetisierbares Eisen(II,III)-Oxid
(Fe₃O₄) wurden bei Raumtemperatur kräftig miteinander
vermischt und das Gemisch mit 100 µl N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin
versetzt und das Rühren etwa 6 bis 7 min
fortgeführt, wonach Polymerisation eintrat und ein homogenes
festes Produkt erhalten wurde. Dieses Produkt wurde in einer
elektrischen Mühle zu feinem Granulat vermahlen.
Weiteres Vermahlen in einer Feinstmahlvorrichtung
während 30 min ergab ein stabiles selbstreagierendes
Produkt mit geeigneter Teilchengröße.
1 g der Polyacrolein/Fe₃O₄-Teilchen gemäß Beispiel 1
wurde viermal mit je 20 ml Wasser und anschließend zweimal
mit 0,1 m Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer vom pH-Wert 9,0
gewaschen. Eine Suspension der Teilchen in dem Puffer wurde
auf ein Volumen von 14 ml gebracht. Die Kupplung wurde
durchgeführt, indem man 1 ml Anti-T₄-Serum (γ-Globulinfraktion)
der Teilchensuspension zusetzte und das Ganze
24 Stunden bei 4°C leicht vermischte. Die Teilchen wurden anschließend
auf einem mehrpoligen Ferritmagneten absetzen
gelassen und die überstehende Flüssigkeit entfernt. Das auf
diese Weise hergestellte teilchenförmige Reagenzmaterial wurde
dreimal mit dem Bicarbonat/Carbonat-Puffer und anschließend
zweimal mit 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,4 gewaschen.
Schließlich wurde das Volumen der Suspension mit
Phosphatpuffer auf 20 ml gebracht.
Es wurde das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben,
durchgeführt mit der Abweichung, daß anstelle von
Anti-T₄-Serum 1 ml Antidigoxin-Serum (γ-Globulinfraktion)
verwendet wurde.
Es wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, gearbeitet mit der
Abweichung, daß anstelle des Anti-T₄-Serums 1 ml Anti-HPL-Serum
(γ-Globulinfraktion) verwendet wurde.
Antikörperverdünnungskurven: Das Verdünnungsmittel für sämtliche
Assays war 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,4. Es wurde
eine Verdünnungsreihe aus der Suspension des teilchenförmigen
Reagenzmaterials hergestellt: 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,312,
0,156 g Matrix je 100 ml Suspension. Danach wurde eine
T₄-¹²⁵J-Indikatorlösung hergestellt, so daß 500 Impulse/s
in 50 µl erzielt wurden. Der Indikatorlösung wurde in
einem Verhältnis von 8 µg/ml Serumprobe 8-Anilin-1-naphthalinsulphonsäure
zugesetzt. Die Verdünnungskurven
wurden durch Vermischen der Reagenzien in der folgenden
Reihenfolge und in den folgenden Mengen aufgestellt.
Kurve für die maximale Bindung | |
(I) Serum T₄ frei|50 µl | |
(II) T₄-¹²⁵J-Indikatorlösung (im Verdünnungsmittel für den Assay) | 50 µl |
(III) Anti-T₄-Reagenzmaterialsuspension (Beispiel 2) bei den oben aufgeführten Verdünnungen | 50 µl |
Kurve für die obere Standardbindung | |
(I) Oberer Standard im T₄-freien Serum (400 nMol/l)|50 µl | |
(II) T₄-¹²⁵J-Indikatorlösung | 50 µl |
(III) Anti-T₄-Reagenzmaterialsuspension (Beispiel 2) | 50 µl |
Kurve für die unspezifische Bindung | |
(I) 20fache Konzentration des oberen Standards (8 µMol/l) in T₄-freiem Serum|50 µl | |
(II) T₄-¹²⁵J-Indikatorlösung | 50 µl |
(III) Anti-T₄-Reagenzmaterialsuspension (Beispiel 2) | 50 µl |
Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur über Nacht bebrütet.
Die Teilchen aus fester Phase wurden auf einem
Ferritmagneten absitzen gelassen und die überstehende
Lösung verworfen. Die Teilchen wurden dreimal mit dem
für den Assay bestimmten Verdünnungsmittel gewaschen und
schließlich mit einer Wilj-Apparatur (Gammazähler)
gezählt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.
Antikörperverdünnungskurven: Eine Verdünnungsreihe wurde
aus der Suspension des teilchenförmigen Antikörper-Reagenzmaterials
wie folgt hergestellt: 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,312,
0,156, 0,078 g Teilchen je 100 ml Suspension. Ferner wurde
eine Digoxin-¹²⁵J-Indikatorlösung hergestellt, so daß in
50 µl 500 Impulse/s erzielt wurden. Die Verdünnungskurven
wurden hergestellt, indem man die Reagenzien in der folgenden
Reihenfolge und in den folgenden Mengen miteinander
vermischte.
Kurve der maximalen Bindung | |
(I) Plasma|200 µl | |
(II) Digoxin-¹²⁵J-Indikatorlösung | 50 µl |
(III) Antidigoxin-Reagenzmaterialsuspension (Beispiel 3) | 50 µl |
Kurve der oberen Standardbindung | |
(I) Oberer Standard 8 nMol/l in Plasma|200 µl | |
(II) Digoxin-¹²⁵J-Indikatorlösung | 50 µl |
(III) Antidigoxin-Reagenzmaterialsuspension (Beispiel 3) | 50 µl |
Kurve der nichtspezifischen Bindung | |
(I) 20fache obere Standardkonzentration (160 nMol/l) in Plasma|200 µl | |
(II) Digoxin-¹²⁵J-Indikatorlösung | 50 µl |
(III) Antidigoxin-Reagenzmaterialsuspension (Beispiel 5) | 50 µl |
Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur über Nacht bebrütet.
Die Festphasenteilchen wurden auf einem Ferritmagneten
absitzen gelassen und die überstehende Flüssigkeit
verworfen. Die Teilchen wurden dreimal mit dem für
den Assay verwendeten Verdünnungsmittel gewaschen und
schließlich mit Hilfe eines Wilj-Apparates (Gammazähler)
gezählt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt.
Antikörperverdünnungskurven: Eine Verdünnungsreihe wurde aus
der Suspension des teilchenförmigen Antikörper-Reagenzmaterials
wie folgt hergestellt: 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,313 g
Teilchen je 100 ml Suspension. HPL-¹²⁵J-Indikatorlösung
wurde hergestellt, so daß 500 Impulse/s in 50 µl erzielt
wurden. Die Verdünnungskurven wurden aufgestellt, indem
man die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge und in den
folgenden Mengen miteinander vermischte:
Kurve der maximalen Bindung | |
(I) Männer-Serum|50 µl | |
(II) HPL-¹²⁵J-Indikatorlösung | 50 µl |
(III) Anti-HPL-Reagenzmaterialsuspension bei den oben angegebenen Verdünnungen | 50 µl |
Kurve der oberen Standardbindung | |
(I) Oberer Standard (12 µg/ml)|50 µl | |
(II) HPL-¹²⁵J-Indikatorlösung | 50 µl |
(III) Anti-HPL-Reagenzmaterialsuspension | 50 µl |
Kurve der unspezifischen Bindung | |
(I) 20fache obere Standardkonzentration (240 µg/ml)|50 µl | |
(II) HPL-¹²⁵J-Lösung | 50 µl |
(III) Anti-HPL-Reagenzmaterialsuspension | 50 µl |
Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur über Nacht bebrütet.
Die Festphasenteilchen wurden auf einem Ferritmagneten absitzen
gelassen und die überstehende Lösung verworfen. Die
Teilchen wurden dreimal mit dem für den Assay verwendeten
Verdünnungsmittel gewaschen und schließlich mit einem Wilj-Gerät
(Gammazähler) gezählt. Die Ergebnisse sind in
Fig. 3 dargestellt.
Die Antikörperverdünnungskurven der
Fig. 1 bis 3 zeigen, daß die Antiseren gegenüber T₄, HPL
und Digoxin ihre Immunreaktivität beibehalten, wenn sie
kovalent an das Polyacrolein gebunden worden sind.
Die in Beispiel 7 angegebenen Reagenzien wurden in einem
automatischen Gerät mit kontinuierlichem Durchfluß
(BE-PS 8 52 327) verwendet, wobei eine on-line-Bebrütung
des strömenden diskreten Assaygemisches während 10 min und
anschließend eine magnetische Abtrennung des Reagenzmaterials
von dem Gemisch angewandt wurden. Die abgetrennten
Teilchen, die nunmehr die an die Antikörper gebundene Fraktion
des lactogenen Hormons der menschlichen Placenta trugen,
wurden anschließend durch einen Gammazähler strömen
gelassen, wonach die Zählungen aufgezeichnet wurden. Diese
Daten wurden dazu verwendet, um eine Standardkurve herzustellen,
aus der die unbekannten Konzentrationen an HPL in
den zu untersuchenden Proben durch Interpolation gefunden
wurden.
0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,4 mit einem Gehalt an 0,25%
Polyethoxysorbitanlaurat, 0,1% Natriumazid und 0,25%
Rinderserumalbumin.
Normales Männerserum wurde mit reinem lactogenen Hormon
der menschlichen Placenta versetzt, so daß Konzentrationen
von 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 µg/ml erhalten wurden.
Die hergestellte Indikatorvorratslösung wurde mit Pufferlösung
verdünnt, so daß eine Gesamtzählung von 1700 Impulsen/s
je 50 µl erzielt wurde.
Diese Suspension wurde in einer Konzentration von 0,625 mg
je 50 µl Pufferverdünnung verwendet. Die Standardkurve,
die durch Auftragen der Zählungen in Form von C i /C o %
gegen den Logarithmus der Konzentrationen der Standards
erhalten wurde, ist in Fig. 4 dargestellt. Unbekannte
Werte wurden in der üblichen Weise aus der Standardkurve
abgelesen.
Es bedeuten:
C o = Anzahl der Zählungen, wenn keine Bindung eintritt, d. h. die maximal erzielbare Zählung,
C i = Anzahl der Zählungen bei Verwendung des Standards i.
C o = Anzahl der Zählungen, wenn keine Bindung eintritt, d. h. die maximal erzielbare Zählung,
C i = Anzahl der Zählungen bei Verwendung des Standards i.
Claims (7)
1. Verfahren zur Herstellung eines teilchenförmigen, magnetisch
anziehbaren Reagenzmaterials zur Verwendung bei Immunoassays,
dadurch gekennzeichnet,
daß man
- I) Acrolein in Gegenwart magnetisch anziehbarer Feststoffe zu einer Polyacroleinmatrix, in der die Feststoffe gleichmäßig eingebettet sind, polymerisiert,
- II) die Polyacroleinmatrix zu Teilchen einer Größe von 1 bis 20 µm und einem spezifischen Gewicht von 1,4 bis 3,2 zerkleinert und
- III) die Teilchen mit einem Reagenz in Berührung bringt, das freie Amino- oder Sulfhydrylgruppen enthält, um das Reagenz unmittelbar an die Polyacroleinmatrix zu binden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Acrolein in Gegenwart von N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin
in Masse polymerisiert.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man in Schritt III) als Reagenz ein Protein, Antigen, Hapten
oder Enzym verwendet.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß man
- IV) das Reagenzmaterial in einer wäßrigen Flüssigkeit suspendiert.
5. Verwendung eines nach dem Verfahren gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 4 hergestellten Reagenzmaterials zur
Bestimmung eines Bestandteils in einer Flüssigkeit,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die Flüssigkeit mit dem Reagenzmaterial in Berührung
bringt und anschließend das Reagenzmaterial aus der Flüssigkeit
magnetisch abtrennt.
6. Verwendung gemäß Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Umsetzungsgemisch aus einer flüssigen Phase, die
eine Probe der Flüssigkeit enthält, und einer festen Phase,
die das teilchenförmige Reagenzmaterial enthält, eine Leitung
entlangströmen läßt, wobei in dem Gemisch zwischen dem Reagenzmaterial
und einem oder mehreren anderen Bestandteilen
des Gemisches eine Umsetzung stattfindet, durch die
die Bestandteile selektiv an die Teilchen gebunden
werden,
daß man die Teilchen in der Leitung magnetisch einfängt, um
sie gegen die Strömung festzuhalten und auf diese Weise die
feste Phase von der strömenden flüssigen Phase zu trennen,
und
daß man stromabwärts davon den zu bestimmenden Bestandteil
in der Probe durch Analyse der abgetrennten festen oder
flüssigen Phase bestimmt.
7. Verwendung gemäß Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die Bestimmung diskontinuierlich manuell durchführt.
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