DE3689618T2

DE3689618T2 - Magnetische polymerteilchen.

Info

Publication number: DE3689618T2
Application number: DE86906210T
Authority: DE
Inventors: Angelo Louis D; Paul Liberti; Charles Owen; John Silvia
Original assignee: Immunicon Inc
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1985-10-04
Filing date: 1986-10-03
Publication date: 1994-05-11
Anticipated expiration: 2006-10-04
Also published as: EP0244444B1; EP0244444A1; EP0244444A4; EP0516198A2; DE3689618D1; DE3650644T2; DE3650644D1; WO1987002063A1; ATE156366T1; EP0516198A3; EP0516198B1; US4795698A; CA1275533C; US5866099A

Description

Die Erfindung betrifft Teilchen mit einem Gehalt an bestimmten Polymeren in Kombination mit magnetischen Metallen, auf Zusammensetzungen unter Einschlup an solchen Teilchen sowie auf Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Teilchen und Zusammensetzungen. Insbesondere betrifft die Erfindung solche Teilchen, bei denen das Polymer eine biochemische Funktion besitzt.
Biologisch aktive Magnetteilchen können in einer Vielfalt präparativer und diagnostischer Techniken ihre Anwendung finden. Zu diesen wird die magnetische Steilgradiententrennung (EGMS) gerechnet, welche das magnetische Feld zum Abscheiden magnetischer Partikel aus einer Suspension ausnutzt. In Fällen, bei denen jene Partikel an interessante biologische Materialien (z. B. Zellen, Arzneistoffe) gebunden sind, ist jenes Material von Interesse auf diese Weise von anderen nicht an Magnetpartikel gebundene Materialien abscheidbar.
Verschiedene Eigenschaften sind von Bedeutung, wenn ein Magnetteilchen in biologischen, therapeutischen und diagnostischen Systemen von Nutzen sein soll. Erstens muß das Teilchen die nötige biologische Wirkung, Affinität bzw. einen reaktionsfähigen Charakter besitzen, mit Hilfe dessen es seine Funktion ausüben kann. Zweitens müssen die Teilchen aus Gründen der Freisetzung in einem biologischen bzw. reaktionsfähigen System in einem wäßrigen Medium suspendierbar sein. Es kann auch noch erstrebenswert sein, daß die Suspension der Teilchen stabil ist (d. h. nicht absetzt oder agglomeriert). Schließlich kann noch eine kleine Teilchengröße wünschenswert sein, um die Suspension der Magnetteilchen mittels herkömmlicher Methoden durch Filter sterilisieren zu können.
Im Stand der Technik sind viele Techniken zur Herstellung magnetischer Teilchen oder organomagnetischer Materialien vorgeschlagen worden. US - A - 4 001 288 (Gable et al.) offenbart die Herstellung magnetischer Organo-Eisenverbindungen, welche sowohl wasserlöslich als auch stark magnetisch sind. Bei der Zubereitung gemäß dieser von Gable et al. vermittelten Lehre wird in Lösung befindliches zweiwertiges Eisen zum Ausfällen einer Eisenoxidverbindung mit Wasserstoffperoxid und dann mit Ammoniumhydroxid behandelt. Anschließend wird diese Verbindung mit Peroxid oxidiert, mit einer Hydroxycarboxylsäure behandelt und mit einer Alkalisubstanz zur Reaktion gebracht, um ein lösliches Produkt zu bilden.
Gable et al. offenbart auch die Einführung von Proteinen oder "Protein-Abbauprodukten" in die Lösung des zweiwertigen Eisens, welche anschließend zur Ausfällung der Eisenoxide zur Reaktion gebracht wird. Das einzige exemplifizierte Material ist das mit Wasserstoffperoxid behandelte Hydrolyseprodukt von Gelatine.
US - A - 4 452 773 (Molday) offenbart Eisenoxidteilchen im "kolloidalen Größenbereich", welche mit einem Polysaccharid überzogen sind (in jenem Patent anhand von Dextran und Dextranderivaten exemplifiziert). Obschon die Teilchen nach Molday in einer im Vergleich zur vorliegenden Erfindung gewissermaßen ähnlichen Art und Weise hergestellt werden, ist anzunehmen, daß sie substanziell von den vorliegenden erfindungsgemäßen Teilchen verschieden sind.
US - A - 4 454 234 (Czerlinski) lehrt die Herstellung von überzogenen Magnetteilchen (im allgemeinen durch Suspensionspolymerisation auf einem Magnetpartikelsubstrat), welche in reversibler Weise in Lösung suspendierbar sind. Die von Czerlinski vermittelten Suspensionsparameter bedingen den Curietemperatureffekt seiner Magnetteilchen, welcher abwechselnd die Teilchen magnetisch oder nichtmagnetisch macht. Sobald die Teilchen magnetisch sind, neigen sie zum Agglomerieren, können aber nach Erhitzen der Teilchen auf eine Temperatur oberhalb der Curietemperatur des darin enthaltenen Magnetits resuspendiert werden.
US - A - 4 230 685 (Senyei et al.) beschreibt die Herstellung von Mikrokügelchen mit einem Gehalt an Magnetit, Albumin und Protein A. Die von Senyei vermittelte Lehre schließt zwar nicht die Ausfällung des Magnetits in Anwesenheit jener anderer Bestandteile ein, läuft aber eher auf ein Überziehen vorgefertigter Magnetteilchen hinaus.
Andere möglicherweise in Erwägung zu ziehende Patente von Interesse umfassen US - A - 4 152 210 (Robinson et al.), US - A - 4 335 094 (Mosbach), 4 018 886 (Giaever) und 4 070 246 (Kennedy et al.). Während alle diese Patente an sich die Herstellung oder Verwendung von magnetisch-biologischen Teilchen offenbaren, kann man doch die Auffassung vertreten, daß keines dieser Partikel den vorliegenden erfindungsgemäßen Teilchen ähnlich ist.
Die in der vorliegenden Schrift benutzten Ausdrücke werden untenstehend erklärt.
Aktives Halogen: Ein mit einem Kohlenstoffatom verknüpftes Halogenatom, welches entweder an oder neben einem Kohlenstoff gebunden ist, welcher mit einer Elektronen entziehenden Gruppe verknüpft ist (zum Beispiel: Jodacetamid, Jodacetat).
Verfügbare Koordinationsstelle: Eine Koordinationsstelle, welche nicht sterisch gehindert (frei zugänglich) und darauf ausgelegt ist, ein Metallatom in Metallverbindungen zu koordinieren (z. B. Fe&sub3;O&sub4;).
Biofunktioneller Ligand: Ein Molekül mit biologischer Wirkung oder einer besonderen Affinität in einem biologischen System, welches mit den erfindungsgemäßen ferromagnetischen Polymerteilchen verknüpfbar ist, so daß jenen Teilchen spezielle biologische Eigenschaften verliehen werden.
Koordinationsstellen: Ein Atom in einer molekularen Struktur, welches ein "freies", zur Bildung einer Koordinationsbindung mit einem Übergangsmetallatom befähigtes Elektronenpaar besitzt.
Denaturierte Proteine: Proteine, welche eine spezielle biologische Aktivität verloren haben (z. B. Enzym-, Antigen- oder Antikörperwirkung etc.) infolge einer chemischen oder strukturellen Veränderung. Im Sinne des Gebrauchs nach Gable et al.: Im Anschlup an die Spaltung einiger Amidbindungen mit einem Molekulargewicht von < 10 000 verbleibende Proteinüberreste.
Extra-partikuläre Bindungen: Verknüpfung einer funktionellen Gruppe einer bifunktionellen Verbindung mit einer Stelle auf einem ferromagnetischen Polymerpartikel, während die andere funktionelle Gruppe mit einer Stelle an einem anderen Molekül oder (bezeichnenderweise mit einem Liganden) verknüpft ist.
Ferromagnetisch: Permanentmagnetische Eisenzusammensetzungen (mit einem reinen magnetischen Moment).
Intra-partikuläre Bindungen: Verknüpfung beider funktionellen Gruppen einer bifunktionellen Verbindung mit unterschiedlichen Stellen auf demselben magnetischen Polymerpartikel.
Niedrige Ionenstärke: Wäßrige Lösung mit nahezu neutralem pH und einer Kationengesamtkonzentration von < 40mM (gewöhnlich vom Puffer aus gesehen).
Protein: Mit Amidbindungen verknüpfte Aminosäurepolymere (Peptidbindungen) mit einem Molekulargewicht von > 10 000.
Resuspendierbar: Material, welches nach einer Agglomeration (z. B. durch Zentrifugieren, EGMS oder Ausflocken) zum Erzielen einer stabilen Suspension resuspendierfähig ist.
Schallbehandlung: Aussetzen einem Ultraschall hoher Intensität.
Stabile Suspension: Eine nicht absetzende oder auf andere Weise agglomerierende Suspension, sofern sie bei Standardtemperatur und -Druck 2 Tage ruhig stehen gelassen wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung magnetischer Polymerteilchen, bei dem man:
(a) eine wäßrige Lösung von Übergangsmetallionen, die in der Lage sind, unter Bildung eines magnetischen Präzipitats zu reagieren und einem Polymer herstellt, das zugängliche Koordinationsstellen aufweist, in Anteilen, die an die Herstellung eines resuspendierbaren Produktes angepaßt sind, mit der Maßgabe, daß das Polymer kein Polysaccharid oder Derivat davon ist;
(b) die Metallionen in Gegenwart des Polymers zur Bildung eines magnetischen Präzipitats, das magnetische Polymerteilchen enthält, umsetzt; und
(c) die magnetischen Polymerteilchen zurückgewinnt.
Die Erfindung befaßt sich auch mit resuspendierbaren magnetischen Polymerteilchen enthaltend das Reaktionsprodukt aus einer wasserlöslichen Form von Eisen und einem wasserlöslichem Polymer, welches zugängliche Koordinationsstellen aufweist, mit der Maßgabe, daß das wasserlösliche Polymer kein Polysaccharid oder Derivat davon ist.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von ferromagnetischen Polymerteilchen, bei dem man:
(a) eine wäßrige Lösung von Eisen, das in der Lage ist, zur Bildung eines magnetischen Präzipitats zu reagieren und einem Polymer, das zugängliche Koordinationsstellen aufweist, herstellt, mit der Maßgabe, daß das Polymer kein Polysaccharid oder Derivat davon ist;
(b) einen stöchiometrischen Überschuß einer starken Base zugibt;
(c) die Lösung rührt;
(d) die magnetischen Teilchen präzipitieren läßt; und
(e) die magnetischen Polymerteilchen zurückgewinnt.
Außerdem erstreckt sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung einer vorgegebenen Spezies, bei dem man:
(a) eine wäßrige Lösung von Übergangsmetallionen, die in der Lage sind, zur Bildung eines magnetischen Präzipitats zu reagieren und einem Polymer herstellt, das zugängliche Koordinationsstellen aufweist, in Anteilen, die an die Herstellung eines resuspendierbaren Produktes angepaßt sind, mit der Maßgabe, daß das Polymer kein Polysaccharid oder Derivat davon ist;
(b) die Metallionen in Gegenwart des Polymers zur Bildung eines magnetischen Präzipitats enthält, das magnetische Polymerteilchen umsetzt; und
(c) die magnetischen Polymerteilchen zurückgewinnt;
(d) die magnetischen Polymerteilchen in einer wäßrigen Lösung resuspendiert;
(e) die magnetischen Polymerteilchen sowohl mit einer bifunktionellen Verbindung, die zur Bindung von überwiegend extrapartikulären Bindungen geeignet ist, als auch mit einem biofunktionellen Liganden umsetzt, wobei der biofunktionelle Ligand in seiner Bindungseigenschaft spezifisch für die vorbestimmte Spezies ist;
(f) eine Mischung, die eine unbekannte Menge der vorbestimmten Spezies enthält, mit einer Suspension aus den magnetischen Polymerteilchen, die den biofunktionellen Liganden enthalten, in Kontakt bringt und dadurch bewirkt, daß sich der biofunktionelle Ligand an die vorbestimmte Spezies bindet;
(g) die Mischung durch ein magnetisches Filter mit einem magnetischen Feld schickt, wobei das Filter so ausgelegt ist, daß es die magnetischen Polymerteilchen zurückhält;
(h) das magnetische Feld vom Filter nimmt und die zurückgehaltenen magnetischen Polymerteilchen eluiert; und
(i) die eluierten magnetischen Polymerteilchen mit einer vorgewählten analytischen Methode analysiert, welche so ausgelegt ist, daß sie die gewünschten Daten relativ zur vorbestimmten Spezies ergibt.
Die Erfindung betrifft auch noch ein Verfahren zur Herstellung von magnetischen Polymerteilchen, bei dem man:
(a) eine erste wäßrige Lösung, die mindestens zwei Spezies von Übergangsmetallionen enthält, die in der Lage sind, miteinander zur Bildung eines magnetischen Präzipitats zu reagieren und ein Polymer, das eine biofunktionelle Wirksamkeit sowie zugängliche Koordinationsstellen aufweist, miteinander in Anteilen kombiniert, die auf die Bildung eines resuspendierbaren Präzipitatprodukts mit biofunktioneller Aktivität ausgerichtet sind, mit der Maßgabe, daß das Polymer kein Polysaccharid oder ein Derivat davon ist;
(b) die Übergangsmetallionen in Gegenwart des Polymers zur Bildung eines magnetischen Präzipitats umsetzt, das einen Komplex dieser Metalle und des biofunktionellen Polymers enthält;
(c) das magnetische Präzipitat aus der ersten Lösung zurückgewinnt.
Die Erfindung betrifft auch resuspendierbare magnetische Polymerteilchen zur Verwendung auf den Gebieten der Analyse, Biologie, medizinischen Diagnose und den ihren Einsatz als Kontrastmittel in der NMR-Bildgebung.
Insbesondere umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von suspendierbaren und resuspendierbaren magnetischen Polymerteilchen sowie von solchermaßen hergestellten Partikeln. Solche Teilchen weisen brauchbare Eigenschaften auf, insbesondere in immunologischen Testverfahren, bei denen die Teilchen mit einem speziellen biofunktionellen Liganden hergestellt und anschließend mittels magnetischer Steilgradientenverfahren abgeschieden werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren schließt sowohl die Kopräzipitation von Metallionen (z. B. FE(II) + Fe(III) oder [Fe(II) + Cr(III)] in ihrer Funktion als magnetische Verbindungen in Anwesenheit eines Polymers mit zugänglichen Koordinationsstellen, als auch die Umsetzung des Polymers mit dem Metall zur Bildung eines Präzipitats sowie die Rückgewinnung der magnetischen Polymerpartikel ein. Darüber hinaus können den Teilchen verschiedenartige biofunktionelle Gruppen zur Gewinnung eines wirksamen biofunktionellen Reagenzes einverleibt werden, welches in immunologischen Testverfahren, bei der Zellerkennung und reaktiven Mitteln für die Enzymimmobilisation, bei der NMR-Bildgebung sowie anderen diagnostischen, analytischen und therapeutischen Techniken einsetzbar ist.
Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung wird eine Lösung mit einem Gehalt an Fe(II) und Fe(III) (in charakteristischer Weise FeCl&sub2; und FeCl&sub3;) und ein Polymer unter Ausschluß eines Polysaccharids oder eines Derivats davon (z. B. ein Protein) mit zugänglichen Koordinationsstellen (mittels Titrieren oder sonstwie) mit einer starken Base wie zum Beispiel Ammoniumhydroxid (NH&sub4;OH) behandelt, um magnetische Eisenoxide wie beispielsweise Magnetit (Fe&sub3;O&sub4;) in einer Form auszufällen, welche in inniger Weise mit dem Polymer kombiniert ist. Die Präzipitation wird in charakteristischer Weise zur Gewinnung von resuspendierbaren magnetischen Polymerteilchen unter schnellem Rühren sowie eventuellem Schütteln mittels Ultraschallbehandlung ausgeführt.
Vorzugsweise wird das Polymer aus der Gruppe bestehend aus synthetischen oder natürlichen Proteinen, Polyaminosäuren, Carboxypolyalkyl-, Alkoxypolyalkyl-, Aminopolyalkyl-, Hydroxypolyalkyl-, Sulfoxypolyalkylverbindungen, Carboxypolyalkylenen, Alkoxypolyalkylenen, Aminopolyalkylenen, Hydroxypolyalkylenen, Sulfoxypolyalkylenen, Polysilanen, Polyphosphinen und deren Copolymeren ausgewählt. In noch bevorzugterer Weise enthält das Polymer oxysäure-funktionelle Gruppen mit zugänglichen Koordinationsstellen, wobei in höchst bevorzugter Weise dieses Polymer ein Protein ist.
Nach der Ausfällung werden die Teilchen gewaschen und anschließend in einer Pufferlösung bei annähernd neutralem pH resuspendiert. Wahlweise kann die Suspension durch Filter mit einer Porenweite von höchstens 0,44 um Durchmesser gefiltert werden.
Weitere Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung schließen den Einsatz von anderen Metallen als Eisen in der Kopräzipitationsreaktion ein. Insbesondere kann man das Fe(III) durch irgendeines aus dem weitgesteckten Bereich der Übergangsmetallionen ersetzen.
Vorzugsweise werden weitere Übergangsmetallionen aus einer Gruppe ausgewählt, die aus solchen Metallionen besteht, welche Kopräzipitate mit mindestens einem ungepaarten Elektron und einer Spinell- bzw. inversen Spinellstruktur bilden. In Einzelfällen ist das Eisen durch geeignet ausgewählte Übergangsmetallionen vollständig verdrängbar. Vielfach verursacht der Einsatz von Nichteisenmetallen gefärbte Teilchen, deren Farbe von weiß zu dunkelbraun reicht.
Die erfindungsgemäß hergestellten magnetischen Polymerteilchen zeigen viele nützliche Eigenschaften. Diese Partikel sind aufgrund des Einschlusses einer magnetischen Metallverbindung (z. B. Eisen in ähnlicher Form wie Magnetit oder eine vergleichbare Verbindung). Die Teilchen können so formuliert werden, daß sie nach der Aggregation resuspendierbar sind und so relativ stabile, sogar nach mehreren Tagen ruhigen Stehenlassens nicht absetzende Suspensionen bilden. Ferner können die nach der Erfindung hergestellten Teilchen sehr klein sein (etwa 0,01-0,2 um), weshalb sie filtersterilisierbar sind. Schließlich können die nach der Erfindung hergestellten Teilchen so zugeschnitten werden, daß sie spezifische biofunktionelle Liganden einschließen, welche für verschiedenartige analytische, diagnostische und andere biologisch-medizinische Anwendungen brauchbar sind.
Im Anschlup an die Ausfällung und Resuspendierung der magnetischen Polymerteilchen können diese mit einem bifunktionellen Reagenz zur Quervernetzung reaktiver, am Polymer befindlicher Stellen behandelt werden. Vorzugsweise ist die bifunktionelle Verbindung spezifisch im Hinblick auf das Polymer. Diese Quervernetzung kann entweder hinsichtlich einer intra-partikulären Quervernetzung, in welcher die reaktiven Stellen auf demselben Teilchen gebunden sind, effizient sein, oder sie läuft als Umsetzung eines extra-partikulären Liganden ab, welcher dann mit dem Polymer auf einem vorgegebenen Teilchen quervernetzt wird.
Im ersteren Fall besitzt die bifunktionelle Verbindung terminale Gruppen, welche aus der Gruppe bestehend aus Arylnitrenen, Imidoestern, N-Hydroxysuccinimidestern, 2-Diazo-3,3,3-trifluorpropionat, Maleimiden, Pyridyldisulfiden, Halogennitrobenzolen, Isothiocyanaten, Halogensulfonaten, aktiven Halogenen und aktiven Aldehyden ausgewählt sind.
Im zweiten Fall ist ein bifunktionelles Reagenz erwünscht, welches einen verhältnismäßig kurzen Abstand zwischen seinen beiden funktionellen Gruppierungen aufweist, um die Verknüpfung zwischen dem Teilchenpolymer und der extra-partikulären Spezies zu fördern. In diesem Fall besitzt die bifunktionelle Verbindung terminale Gruppen, die aus der Gruppe bestehend aus Arylnitrenen, Imidoestern, N-Hydroxysuccinimidestern, 2 - Diazo - 3,3,3 - trifluorpropionat, Maleimiden, Pyridyldisulfiden, Halogennitrobenzolen, Isothiocyanaten, Halogensulfonaten, aktiven Halogenen und aktiven Aldehyden ausgewählt sind sowie einen biofunktionellen Liganden, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Lektinen, Avidin, Biotin, Staphylococcus-Protein A (SPA), Enzymen, Serumproteinen, C1q, Komplementproteinen und Rheumafaktor.
Umgekehrt wird die intra-partikuläre Quervernetzung durch den Einsatz eines bifunktionellen, langgestreckten, in seiner Bindung sterisch nicht gehinderten Reagenzes gefördert, so daß zwei reaktive Stellen auf einem Partikel durch ein einziges bifunktionelles Teilchen verknüpfbar sind.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausgestaltung schließt das obenstehend beschriebene Verfahren als weiteren Schritt den folgenden ein:
daß man die magnetischen Polymerteilchen sowohl mit einer bifunktionellen Verbindung, die an die Bildung von überwiegend extra-partikulären Bindungen angepaßt ist, umsetzt, wobei die bifunktionelle Verbindung terminale Gruppen aufweist, die aus der Gruppe bestehend aus Arylnitrenen, Imidoestern, N-Hydroxysuccinimidestern, 2-Diazo-3,3,3-trifluorpropionat, Maleimiden, Pyridyldisulfiden, Haiogennitrobenzolen, Isothiocyanaten, Halogensulfonaten, aktiven Halogenen und aktiven Aldehyden ausgewählt sind als auch mit einem biofunktionellen Liganden umsetzt, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Lektinen, Avidin, Biotin, Staphylococcus-Protein A (SPA), Enzymen, Serumproteinen, C1q, Komplementproteinen und Rheumafaktor.
Nach einer anderen bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung schließt das obenstehend beschriebene Verfahren als weiteren Schritt den folgenden ein:
daß man die magnetischen Polymerteilchen sowohl mit einem aktivierenden Mittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus wasserlöslichen Carbodiimiden, Glutaraldehyd, Cyanhalogeniden, Perjodaten und Tanninsäure als auch mit einem biofunktionellen Liganden, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Lektinen, Avidin, Biotin, Staphylococcus- Protein A (SPA), Enzymen, Serumproteinen, C1q, Komplementproteinen und Rheumafaktor zur Reaktion bringt.
Alternativ zur Ultraschallbehandlung während der oben dargelegten Ausfällungs- oder Resuspensionsschritte kann auch eine andere Art von Durchrütteln (wie zum Beispiel mechanisches Rühren) zum Einsatz gelangen.
Die Resuspendierung der erfindungsgemäßen magnetischen Polymerteilchen wird in charakteristischer Weise in einem Puffersystem mit niedriger Ionenstärke (z. B. 40mM Phosphat) durchgeführt. Das Puffersystem ermöglicht die Resuspendierung der Teilchen, welche in nichtionischen Lösungen nicht resuspendierbar sind. Zusätzlich zu den Phosphatpuffern sind auch sowie Borat- und Sulfatsysteme einsetzbar.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung schließt das obenstehend beschriebene Verfahren als weiteren Schritt den folgenden ein:
daß man die magnetischen Polymerteilchen sowohl mit einem aktivierenden Mittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus wasserlöslichen Carbodiimiden, Glutaraldehyd, Cyanhalogeniden, Perjodaten und Tanninsäure als auch mit einem biofunktionellen Liganden, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Lektinen, Avidin, Biotin, Staphylococcus- Protein A (SPA), Enzymen, Serumproteinen, C1q, Komplementproteinen und Rheumafaktor zur Reaktion bringt.
Es ist zu vermuten, daß die erfindungsgemäße innige Vereinigung von Polymer und dem Metall aus der Koordination des Metalls während der Kopräzipitation infolge der Koordinationsstellen auf dem Polymer resultiert. Auch wird die These vertreten, daß bestimmte Koordinationsstellen "zugänglicher" sind als andere aufgrund der Tatsache, daß sowohl die Stärke der Koordinationsbindung, welche-durch das spezielle Atom herstellbar ist, als auch die durch die in der Umgebung befindlichen Atome bedingten räumlichen Behinderungen eine Rolle spielen. Beispielsweise ist es bekannt, daß Sauerstoffatome, die ein "freies" Eisenkomplex-Elektronenpaar besitzen, eine stärkere Wirkung aufweisen als Stickstoffatome im Amin und sogar in einem noch größeren Ausmaß ein Hydroxylsauerstoffatom. Somit sollte ein Polymer mit oxysäure-funktionellen Gruppen bessere Produktteilchen ergeben als ein aminsubstituiertes Polymer. In ähnlicher Weise sollten Koordinationsstellen, welche auf kurze Abstände frei zugänglich sein können, ein verbessertes Ergebnis erbringen als solche Stellen, welche entweder im Hinblick auf den Zugangsweg oder in Bezug auf die Entfernung vom Zugang behindert sind.
Die vorstehend beschriebenen Tendenzen sind qualitativ in verschiedenen von den Erfindern ausgeführten Experimenten zu beobachten. Die Anwesenheit von "verfügbaren Koordinationsstellen" erscheint im Hinblick auf die Herstellung von erfindungsgemäßen resuspendierbaren magnetischen Polymerteilchen notwendig. So konnte zum Beispiel aufgezeigt werden, daß sich mit diversen Polymeren wie natürlichen oder synthetischen Proteinen, Polyaminosäuren, Carboxypolyalkyl-, Alkoxypolyalkyl-, Aminopolyalkyl-, Hydroxypolyalkylverbindungen und verschiedenen Copolymeren davon die vorliegenden erfindungsgemäßen Teilchen produzieren lassen. Darüber hinaus lassen sich auch mit anderen Polymeren wie zum Beispiel Sulfoxypolyalkylverbindungen, Polyacrylaminen, Polyacrylsäure und substituierten Polyalkenverbindungen die erfindungsgemäßen Teilchen herstellen.
Bei der Auswahl der bei der Kopräzipitationsreaktion anzuwendenden Übergangsmetalle scheinen verschiedene Kriterien von Bedeutung zu sein. Erstens muß das Endprodukt eines oder mehrere unpaarige Elektronen in seiner Struktur aufweisen. Zweitens muß eines dieser Metalle eine für die Polymerbindung verfügbare Stelle besitzen. Drittens muß eines der Metalle in der Lage sein, über eine kubisch oder hexagonal dicht gepackte kristalline Struktur zu verfügen (z. B. was kubisch anbelangt Spinell- oder inverse Spinellstruktur). Man geht davon aus, daß jenes letztgenannte Erfordernis aus der Notwendigkeit für eine äußerst enge Packungsdichte herrührt, damit eine Verbindung magnetisch ist.
Schließlich können Polymere, welche für die Herstellung der erfindungsgemäßen Teilchen brauchbar sind, "> muß-geschneider" sein und zwar in der Weise, daß sie Monomere mit einschließen, welche eine spezielle biofunktionelle Aktivität zeigen. Die Verwendung eines derartigen Polymers gestattet die unmittelbare Ausfällung eines biofunktionellen magnetischen Polymerteilchens, das entweder wenig gar keine Nachbehandlung für den sinnvollen Einsatz in Bestimmungsverfahren benötigt, welche auf der besonderen biofunktionellen Aktivität des Polymeren beruhen.
Bei gewissen Anwendungen sind größere, weniger stabile Teilchen nützlich. Die erfindungsgemäßen Teilchen sind so herstellbar, daß sie agglomerieren und dabei gleichzeitig sowohl ihre biofunktionelle als auch ihre magnetischen Charakteristika beibehalten. Die Teilchenagglomeration kann von der Behandlung der Suspension mit einer vorbestimmten Menge an beispielsweise einer Bariumchloridlösung begleitet sein. Diese Behandlung kann dazu bestimmt sein, die Partikel zu veranlassen, sich aus der Suspension während einer vorgegebenen Zeitspanne abzuscheiden, um die Durchführung weiterer Verfahrensmaßnahmen zu ermöglichen, oder die größeren Teilchen dazu befähigen, leicht von relativ schwachen Magneten angezogen zu werden.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung verschiedener Parameter bei der Herstellung und Verwendung der magnetischen Polymerteilchen:

Beispiel 1

Allgemein präparatives Vorgehen:
Die wäßrigen Ausgangslösungen für eine typische (Mikro)-Präparation sind wie folgt:
1 mg/ml Lösung eines vorgegebenen Proteins
500 mg/ml FeCl&sub3;
200 mg/ml FeCl&sub2;
20 mM Phosphatpuffer (abnähernd pH&sub7;)
7,5% oder 15% Ammoniumhydroxidlösung (NH&sub4;OH)
Die Herstellung beginnt mit dem Verdünnen von 2,5 ml Proteinlösung mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 20 ml. 175 ul FeCl&sub3;- und 140 ul FeCl&sub3;-Lösung werden hinzugefügt. Am Schlup kommen ca. 200 ul Ammoniumhydroxidlösung hinzu.
Es sei nicht versäumt, darauf hinzuweisen, daß die hinzuzufügende Basenmenge gewöhnlich vorherberechnet wird, um die Gesamtmenge an Protein oder Polymer im Reaktionsgemisch und die Pufferfähigkeit jenes speziellen Proteins oder Polymers einzukalkulieren. Die Absicht besteht darin, den pH-Wert in ausreichendem Maße anzuheben, um einerseits die Ausfällung der Eisenoxide zu ermöglichen, andererseits die ausschlaggebende Aktivität des Proteins oder Polymers beizubehalten mit der Maßgabe, den pH-Wert, bei welchem dieses Material denaturiert, nicht zu überschreiten.
Alle diese Substanzen werden unter beständigem Rühren in ein Reaktionsgefäß gegeben, um so eine homogene Reaktionsmischung herbeizuführen. Unmittelbar nach Zusatz der Base (NH&sub4;OH) werden schwarze Teilchen ausgefällt. Das Reaktionsgemisch wird abfiltriert, und zwar 15 Min. lang in typischer Weise bei 3000 UpM und danach der Überstand abgetrennt. Den zusammengeballten Rückstand bricht man auf und wäscht das Material in 20 ml Phosphatpuffer, charakteristischerweise in 3 Waschzyklen unter Zentrifugieren. Nach dem letzten Waschen wird der zusammengeballte Rückstand nochmals aufgebrochen und das Material unter Ultraschallbehandlung im Puffer resuspendiert. Die endgültige Lösung ist bernsteinfarben oder braun und liegt in Form einer stabilen Suspension von ferromagnetischen Polymerteilchen. Während der ganzen Prozedur wurden keinerlei Eisenaggregate festgestellt.
Die nachfolgende Behandlung der Teilchen kann unter Einsatz von weiter unten im einzelnen erläuterten verfahrensmaßnahmen einschließlich der intra-partikulären oder extra-partikulären Quervernetzung mit biofunktionellen Reaktionspartnern erfolgen.

Beispiel 1A

Verwendung von Nichteisen-Metallen:
Wie obenstehend erläutert, können auch Nichteisen-Metalle in die magnetischen Polymerteilchen der vorliegenden Erfindung eingebaut werden. Untenstehend wird eine (nicht erschöpfende) Tabelle solcher Ionen präsentiert, welche bei der Herstellung von magnetischen Polymerteilchen zum Einsatz gelangen können:
Co(II) + Ga(III)
Ga(III) + Er(III)
Co(II) + Ru(III)
Ga(III) + Ru(III)
Co(II) + Mn(II)
Ga(III) + Mn(II)
Ga(III) + V(III)
Co(II) + V(III)
Ga(III) + Mo(V)
Ga(III) + Fe(III)
V(III) + Fe(III)
Mn(II) + Ru(III)
V(III) + Mn(II)
Co(II) + Mo(V)
Cr(III) + Ga(III)
Cr(III) + Mn(II)
Er(III) + Ru(III)
Er(III) + Co(II)
Mn(II) + Er(III)
Cr(III) + Fe(II)
In Ergänzung zur obenstehenden Liste kann das Fe(II) auch in Kombination mit einem ausgewählten Übergangsmetallion, dessen elektromotorisches Potential für die Oxidation von Fe(II) zu Fe(III) nicht ausreicht, zum Einsatz gelangen. Unter den vorstehend aufgelisteten Metalls ist einzig das V(III) in der Lage, das Fe(II) zu oxidieren und ist dafür ungeeignet.

Beispiel 2

An Antikörper gekoppelte Teilchen:
Zwei Lösungen (jeweils 40 ml) werden rasch zum beschleunigten Mischen in einem Ultraschallbad vereinigt. Beide enthielten jeweils 1,5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA). Eine davon enthielt Ammoniumhydroxid (8 ml 30%ig, Endkonzentration = 74 mM). Die andere enthielt 140 mg Fe(II)-Chlorid und 280 mg Fe(III)-Chlorid (Gesamteisenkonzentration 1 mg/ml nach Vermischen). Es bildete sich unmittelbar darauf ein schwarzes Präzipitat. Das Gemisch wurde durch Zusatz von 6 ml Eisessig unter Rühren neutralisiert. Die Probe wurde in 4 Röhrchen verteilt und das Präzipitat mittels Zentrifugieren gewaschen (3000 UpM, 15 Minuten lang); die im goldfarbenen und leicht trüben Überstand verbliebene kleine Menge Eisen wurde abgeschieden. Der zusammengeballte Rückstand wurde in 20 ml 20 mM Phosphatpuffer bei neutralem pH resuspendiert. Alle 4 Röhrchen mit ihrem Inhalt von 5 ml Teilchen wurden für 5 Minuten im Branson Ultraschallgerät mit einem Schalenhornanschlup beschallt.
Die zugänglichen Aminogruppen auf den Teilchen wurden mit Succinidylpropionodithiopyridin (SPDP) umgesetzt, um einen Teil davon für die spätere Kopplung mit den Antikörpern vorzubereiten. Diese Umsetzung (20 ml Teilchen + 5 mg SPDP) wurde 1 Stunde lang in der Kälte und unter Rühren vorgenommen. Anschließend wurden 25 mg des aminoreaktiven quervernetzenden Reagenzes Ethylenglykoldisuccinimidester (EGS) zur weiteren Stabilisierung der Teilchen hinzugefügt. Das Gemisch wurde eine weitere Stunde lang unter Rühren reagieren gelassen. Das EGS bewirkte die Quervernetzung etwaiger verbliebener Aminoreste, welche in ausreichend enger Nachbarschaft für die Kopplung vorhanden waren. Andernfalls wären verbliebene Aminogruppen durch eines der Enden des EGS-Moleküls gebunden worden, während die anderen möglicherweise zu einer Carboxylgruppe hydrolysiert wären. Diese Maßnahme läuft auf eine glatte Umkehrung von positiv geladenen zu negativ geladenen Gruppen auf der Teilchenoberfläche hinaus, ein Vorgang, von dem man annimmt, daß er die Stabilität der kolloidalen Suspension fördert.
Gegen Ende der Reaktionsdauer wurde die Zubereitung in ein 50- ml-Röhrchen verbracht und danach wurden 10 ml 3-molare NaCl- Lösung in Wasser hinzugegeben, um die Teilchen "auszusalzen". Nachdem sie für das Aggregieren bei Raumtemperatur 10 Min. Zeit hatten, wurden sie 10 Min. bei 1500 UpM zentrifugiert. Der klare farblose Überstand wurde abgetrennt. Der zusammengeballte Rückstand wurde resuspendiert und noch zweimal abzentrifugiert, bevor die endgültige Suspension in 20 ml Phosphatpuffer mit einer Konzentration von 20 mM erhalten wurde (in diesem Stadium war für gewöhnlich keine Ultraschallbehandlung notwendig).
Die Teilchen wurden mit meerrettichspezifischem Ziegenantiserum in Form eines herkömmlichen Antigens für Testverfahren gekoppelt. Dann wurde das Antiserum durch Reaktion mit dem SPDP aktiviert. Es wurden 0,128 ml Antiserum mit einem Gesamtgehalt von 1,28 mg Protein bei Raumtemperatur 30 Minuten lang mit 12,8 Mikrogramm in 0,512 ml Phosphatpuffer verdünntem SPDP umgesetzt. Nach 30 Minuten wurden 3,1 mg Dithiothreitol (DTT)) hinzugefügt, um das SPDP in seine freie Sulfhydrylform zu überführen. Die umgesetzten Antikörper wurden über eine kleine Gelfiltrationssäule abgetrennt (entsalzt).
Thioliertes Antiserum und SPDP-aktivierte Teilchen wurden miteinander durch Zugabe einer die Antikörper enthaltenden Menge von 6,4 ml, welche (0,64 mg Antiserumprotein bei 100%iger Wiedergewinnung) zu Teilchen mit einem Gehalt an 14 mg Eisen umgesetzt. Die Konzentration an Antiserumprotein und Partikeleisen im Reaktionsgemisch betrug 1,0 mg/ml bzw. 2,2 mg/ml in einem Gesamtvolumen von 6,4 ml. Nach einer Stunde bei einer Temperatur von 4ºC wurden die Teilchen ausgesalzt und gewaschen. Der zusammengeballte Rückstand wurde in 3,2 ml Phosphatpuffer unter 1-minütiger Ultraschallbehandlung resuspendiert.
Die Antigenbindungsaktivität der magnetgebundenen Antiperoxidase wurde durch Inkubation einer aliguoten Menge von Partikeln mit freier Meerrettichperoxidase (HRP) bestimmt, wobei die Teilchen ausgesalzt, gewaschen und in resuspendierter Form im Hinblick auf die Enzymaktivität in einem farbgebenden Assay untersucht wurden. Die antikörpergekoppelten Teilchen nahmen mehr als zehnmal so viel Enzym auf wie die Kontrollteilchenpräparation, welche mit einem ähnlichen, für ein irrelevantes Antigen spezifischen Antikörper gekoppelt war.

Beispiel 3

Jod-Radioisotop enthaltende Teilchen:
Gemäß der in Beispiel 2 beschriebenen Methode wurden Teilchen hergestellt, jedoch mit dem Unterschied, daß eine kleine Menge radiojodiertes (¹²&sup5;J) BSA bei der Reaktion als Indikator für die Proteinkomponente hinzugegeben wurde und daß vier Präparationen hergestellt wurden, bei denen die Mengen an Eisen und BSA in der Fällungsreaktion wie folgt variierten:
A. 1,25 Fe/ml und 1,5 mg BSA/ml (übliche Konzentrationen
B. 3,75 mg Fe/ml u. 1,5 mg BSA/ml (höhere Eisenkonzentration)
C. 1,25 mg Fe/ml u. 5,0 mg BSA/ml (höhere BSA-Konzentration)
D. 3,75 mg Fe/ml u. 5,0 mg BSA/ml (höhere Eisen- und BSA- Konzentration)
Unmittelbar nach der Ausfällung, aber vor jeglichem Waschvorgang, wurde eine Probe zur quantitativen Bestimmung der radioaktiven Markierung im Gemisch durchgemessen. Anschließend wurden die Teilchen zentrifugiert, gewaschen, resuspendiert und gezählt. Die Ergebnisse zeigten den vollständigen Verbrauch des BSA (Einschlup in den zusammengeballten Magnetitrückstand) für die Gemische A und 3, einen nur 60%igen Einschluß in die hochprozentige BSA-Probe (C) sowie eine Rückkehr zum vollständigen Einschlup, wenn der Eisenanteil erhöht wurde und zwar unter Rückkehr zum annähernd ursprünglichen Verhältnis Eisen zu Protein (Probe D). Unter der Annahme, daß das Eisen vollständig zu Magnetit (Fe&sub3;O&sub4;) umgewandelt wurde, waren die Zusammensetzungen der 4 Präparationen die folgenden:
A. 46% Protein, 54% Magnetit
B. 22% Protein, 78% Magnetit
C. 63% Protein, 37% Magnetit
D. 49% Protein, 51% Magnetit
Es wurde die Stabilität der Protein-Magnetit-Teilchen gegenüber dem Verlust an BSA während der Sedimentation und Resuspension mittels Ultraschall geprüft. Nach der Resuspendierung wurden die Teilchen wiederum "ausgesalzt", und das radioaktive BSA, welches im Überstand verblieben war, durchgezählt. Ein Durchschnitt von 40% der Zählrate (st.dev.=11%), welche in die Teilchen inkorporiert worden war, ging verloren. Bei Wiederholung der Prozedur waren die Verluste im nächsten Waschgang niedriger (14%, st.dev.=4%).

Beispiel 5

Demonstration des magnetischen Immunoassays unter Einsatz von an Antigen gekoppelten Teilchen:
Teilchen wurden ausgefällt und zur Bildung eines magnetischen Antigens, wie unter obigem Beispiel 2 beschrieben, mittels SDPD an Human-IgM gekoppelt. Das magnetische IgM-Teilchenantigen hatte einen handelsüblichen Antikörper gegen Human-IgM gebunden, woran das alkalische Phosphatase-Enzym (Ab-AP) gekoppelt war. Eine 1 : 500 Verdünnung von Ab-AP wurde mit annähernd 250 Mikrogramm IgM-Magnetit in 100 Mikroliter Phosphat mit einem Gehalt an 1% BSA inkubiert. Die Ab-Ap-Menge, welche an das IgM- Magnetit gebunden war, wurde mittels Passage des Inkubationsgemisches durch ein kleines Magnetfilter ausgemessen. Das Filterbett wurde anschließend mit einem Überschuß an Puffer gewaschen und mit das Enzymsubstrat enthaltendem Puffer beladen. Nach 15- minütiger Inkubation wurde der Puffer eluiert und die durch das Enzym entstandene Menge an Reaktionsprodukt, welche im Filterbett aufgefangen wurde, durch Messen der optischen Dichte bestimmt.
Das obenstehende Vorgehen bildete die Basis eines kommpetitiven Immunassays für Human-IgM. Im Falle eines Zusatzes von freiem IgM zur Inkubationsmischung wurde die Aufnahme des Enzyms durch das Antigen-Magnetit in spezifischer Weise inhibiert. Die Abnahme der Enzymaktivität auf dem Filter als Funktion des IgM im Inkubationsgemisch wurde zum Aufstellen einer Kalibrierkurve graphisch aufgetragen, womit eine Möglichkeit geschaffen ist, das Verfahren als kommpetitiven Immunassay zur Messung unbekannter Mengen an IgM einzusetzen. Die Empfindlichkeit betrug annäherungsweise 0,15 mg/ml (die Konzentration an IgM, welche als 50%ige Verminderung der spezifisch aufgefangenen Menge an Enzymaktivität im Filter resultierte).

Beispiel 6

Direkte Herstellung von Antikörper enthaltenden Teilchen, welche ihre Aktivität während der ganzen Präparation beibehalten:
Sieben Fällungsschritte wurden unter Einsatz von Gemischen aus BSA und Ziegen-Antikörpern (IgG-Fraktion von Ziegen-Anti-Rabbit-Immunglobulinen). Die Antikörpergesamtmenge betrug jeweils entweder 0,75 oder 0,375 mg/ml. Dazu wurde entweder Null BSA hinzugefügt, oder ausreichend BSA, um das Gesamtprotein auf einen Wert von 0,375, 0,75, 1,5 bzw. 3,0 mg/ml zu bringen. Zu jeder 2-ml-Probe wurden 3,5 mg FeCl&sub2; und 7,0 mg FeCl&sub2; hinzugegeben. Die Teilchen wurden durch Zusatz von 20 Mikrolitern 30 %igem NH&sub4;OH unter Einstellung auf einen pH von 9,4 ausgefällt. Anschließend wurden die Präparationen mit Essigsäure neutralisiert, in einer Zentrifuge abgeschleudert und gewaschen. Die pelletierten Teilchen wurden jeweils unter 2-minütiger Ultraschallbehandlung resuspendiert. Die Hälfte jeder Präparation wurde mit dem bifunktionellen Reagenz EGS (0,31 mg/ml) mehrere Stunden lang behandelt. Nach der EGS - Behandlung wurden die Teilchen mit 1,5 M NaCl ausgesalzt, gewaschen und jeweils unter 1 minütiger Ultraschallbehandlung resuspendiert.
Die mit IgG hergestellten Partikel (ohne BSA) sowie die nicht mit BSA behandelten Teilchen, setzten sich spontan innerhalb von 24 Stunden aus der Suspension ab. Dies traf sowohl für die 0,75 mg/ml- als auch für die 0,375 mg/ml-Präparationen zu. Jedoch war in beiden Fällen die Hälfte der Präparationen, welche der EGS-Behandlung unterzogen worden waren, in Suspension stabil und einsatzfähig.
Zwölf Proben wurden im Hinblick auf die Ziegen-Antirabbit-Ig- Aktivität mittels Hämagglutination überprüft. Eine Reihe von runden Mikrotitervertiefungen mit einem Gehalt an Schafserythrozyten (SRBC) und einer sub-agglutinierenden Konzentration an Kaninchen-Antikörpern gegen SRBC wurde aufgestellt. Bei jeder Reihe wurden Teilchen in fallender Konzentration hinzugegeben, die zwölffach in Bezug auf alle aufeinanderfolgenden Vertiefungen in Reihe abgestuft war. Nach mehreren Stunden wurde die runde Vertiefung mit dem Maximum an sichtbarer Agglutination für jede Reihe abgelesen. Aktivere Teilchen agglutinierten bei niedrigeren Konzentrationen (somit größere Anzahl an Vertiefungen). Eine Tabelle der Ergebnisse aus 12 getesteten Präparationen wird untenstehend gezeigt. Tabelle I Hämagglutinationsergebnisse Ziegen-Antirrabbit-Teilchen Gesamtproetin bei Fällung
< S> = abgesetzt und deshalb nicht getestet bei der Hämagglutination.
Anm.: Bruchteile von runden Vertiefungen beziehen sich auf ein Muster, bei dem die letzte runde Vertiefung nicht in eindeutiger Weise eine Agglutination zeigte (z. B. 9,5 = 9 Vertiefungen mit Agglutinationen und die zehnte Vertiefung mit teilweiser Agglutination).
Nach 2-wöchiger Lagerung bei 4ºC wurde die Hämagglutination mit den Proben wiederholt, welche mit 1,5 mg/ml Gesamtprotein hergestellt waren. Die Aktivität war im wesentlichen unverändert. Die Bindungsspezifität wurde anhand der Tatsache demonstriert, daß keine Hämagglutination in der Kontrollreihe von Vertiefungen zu beobachten war, in welcher der Anti-SRBC-Antikörper ausgelassen war.

Schlußfolgerungen

(i) Die Antigenbindungsaktivität wurde durch EGS kaum beeinflußt. Bei Teilchen, welche mit dem gleichen Gesamtproteingehalt hergestellt waren, wurde in Präparationen mit einem höheren Gehalt an Ab auch eine höhere Aktivität festgestellt.
(ii) An Teilchen mit einem Gehalt an einer von beiden Mengen an Ab, aber ansteigenden Mengen an BSA, wurden Verbesserungen bis zu einem Gesamtprotein von 1,5 mg/ml beobachtet sowie ein leichter Abfall in der Aktivität oberhalb von jenem Punkt.

Beispiel 7

Experimente wurden an magnetischen Teilchen mit einem Gehalt an ¹²&sup5;J-markiertem Protein (HSA) zur Bestimmung der Teilchenstabilität im Hinblick auf die Proteinzusammensetzung durchgeführt. Material und Methodik:
Teilchen wurden unter Einsatz von ¹²&sup5;J-markiertem HSA hergestellt, welches unter Verwendung von JCl jodiert worden war. Es wurden drei Präparationen mit einer Gesamtproteinkonzentration von 0,05, 0,5 und 1,0 mg HSA zubereitet. Jede dieser Proben wurde unter Verwendung der gleichen Fe-Menge produziert. Das relative Verhältnis von "heißen" zu "kaltem" Protein wurde so eingestellt, daß in jedem Fall die spezifische Aktivität (4000 c.p.m./pg) die gleiche war.

Ergebnisse

In jedem Falle wurde die im Überstand vorhandene Menge an Radiomarkierung unmittelbar nach der Teilchenbildung bestimmt. Der Verlust an Radiomarkierung im nachfolgenden Waschvorgang wurde ebenfalls bestimmt. Die endgültige ultraschallbehandelte Suspension wurde im Hinblick auf die Radiomarkierung und den Eisengehalt ausgetestet und so das Protein/Eisenverhältnis bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.
Unter den angewendeten Bedingungen betrug der endgültige Eisengehalt annähernd 1 - 1,56 mg/ml. Beinahe die gesamte Menge markierten Proteins wurde in das anfängliche Präzipitat eingebaut und zwar bei den Präparationen, welche eine Proteinkonzentration von 0,05 und 5,0 mg/ml aufwiesen. Allerdings blieb im Falle des Einsatzes von Protein in einer Konzentration von 1 mg/ml ein wesentlicher Anteil (annähernd 30%) des radioaktiv markierten Materials im Überstand zurück. Dies war ein Indiz dafür, daß unter diesen Bedingungen die Bildung der Teilchen in Bezug auf den Proteineinbau bis herauf zu Proteinkonzentrationen von 0,5 mg/ml effizient war. Höhere Proteinkonzentrationen schienen auf einen Sättigungseffekt hinauszulaufen, wobei ein Überschuß an Protein im Überstand verblieb. Diese Schlupfolgerung wurde weiterhin durch die Tatsache gestützt, daß das Protein/Eisenverhältnis mit dem Heraufgehen des Proteingehalts von 0,05 bis 0,5 mg/ml wesentlich angehoben wurde, aber kein weiteres Anwachsen bei einer Konzentration von 1,0 mg/ml zu beobachten war.
Die Teilchen erschienen im Hinblick auf den Proteingehalt während des ganzen Waschvorgangs relativ stabil. (In bezeichnender Weise verloren die bei hoher HSA-Konzentration gebildeten Partikel während des nachfolgenden Waschvorgangs der Teilchen mehr radioaktiv markiertes Material). Es sei auch nicht versäumt darauf hinzuweisen, daß ein Teil des Verlusts an ¹²&sup5;J-Markierung auf den Verlust von kleinen, aber intakten Protein/Magnetit- Teilchen zurückführbar ist.
Es wurden auch Experimente durchgeführt, bei denen die Anwesenheit freien Proteins in diesen Teilchenpräparationen durch Gelfiltration bestimmt wurde. Vorangegangene Versuche ergaben einen Hinweis darauf, daß eine nur sehr geringe Menge Protein "frei von Teilchen" nach der Ultraschallbehandlung zu werden schien. Darüber hinaus erschien auch kein weiteres Protein beim "Auslaugen", d. h. wenn die Zubereitungen 7 Tage lang aufbewahrt wurden. Ferner schien eine zweite Ultraschallbehandlung den Anteil an freiem Protein nicht zu erhöhen. Tabelle II Ursprüngl. Protein-Konzentration Ursprüngl. ¹²&sup5;J-HSA erster Überstand Ausgefällte Teilchen erste Waschg. zweite Waschg. dritte Waschg. Ultraschallbeh. Teilchen-Suspension Eisengehalt Protein: Eisen-Verhältnis * Erhalten durch Differenzbildung
Mittels obiger Technik ist ein Polymer mit reaktiven Gruppen zur Bildung eines photoaktivierbaren Teilchens anwendbar, welches anschließend an spezifische biofunktionelle Verbindungen gekoppelt werden kann.

Beispiel 8

Vergleichsbeispiel

In einem Versuch, die präparativen Maßnahmen nach Molday zu wiederholen und diese mit den vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahrensweisen zu vergleichen, wurden zwei Reihen von Reaktionsgemischen hergerichtet. Die erste Reihe von Mischungen fing mit Dextran- und Eisenkonzentrationen nach Molday an, wobei die Dextrankonzentrationen in Größenordnungen von 10 abnahm, um die Auswirkungen der Dextrankonzentrationen auf die endgültigen Teilchencharakteristika bestimmen zu können. Die zweite Reihe der Reaktionsmischungen wurde mit erfindungsgemäßen Dextran- und Eisenkonzentrationen begonnen, wobei die Dextrankonzentrationen in Größenordnungen von 10 zu nahmen. Die Ergebnisse dieser Präparationen sind in Tabelle 111 zusammengefaßt. Tabelle III Verfahrensweise Ergebnisse Fe(III) Fe(II) Dextran Nach Bas. Zugabe Nach Erhitz. Nach* Sonic Molday nichtmagn. stab. Susp. stab. magn. Suspens. Magn. Przp. keine Veränderung Nicht resus pend. bar bernst. farb. Lsg. Anm.: k.V = kein Versuch = bei der verwendeten Verfahrensweise nicht einsetzbar * = Nach Ultraschallbehandlung
Wie aus den Vergleichswerten ersichtlich ist, sind die Präparationen gemäß den von Molday vermittelten Verfahrensweisen nicht in der Lage, resuspendierbare Teilchen zu liefern. Sobald man die Dextrankonzentrationen auf den Bereich herabsetzt, der erfindungsgemäß zur Anwendung kommt, wird die Produktqualität der Teilchen herabgesetzt und die Suspension dieser Partikel wird instabil. Im Gegensatz dazu ergeben die erfindungsgemäßen Dextran- und Eisenkonzentrationen im Grenzbereich annehmbare, stabile Suspensionen von schwach magnetischen Teilchen. Sobald man jedoch die Dextrankonzentrationen in Richtung der von Molday gelehrten Werte erhöht, mißlingt das Ausfällen und es entstehen keine Teilchen. Diese Divergenz der Bedingungen wie auch gewisse qualitative Verschiedenheiten im Verhältnis der Teilchengröße und Eisen zum Polymer sind ein Indiz für die extremen Unterschiede zwischen dem Verfahren und Produkt nach Molday und jenen gemäß der Erfindung.
Anhand der vorstehenden Beispiele wurden von den Erfindern die folgenden Schlupfolgerungen gezogen:
i) Die Teilchen gemäß vorliegender Erfindung sind
a) magnetisch
b) stabil in wäßriger Suspension
c) resuspendierbar
d) klein (und somit filtersterilisierbar)
e) einfach herstellbar unter Einbindung einer spez. bilog. Aktivität
f) klar in Suspension.
ii) Teilchen können hergestellt und anschließend unter Verwendung herkömmlicher bifunktioneller Reagenzien an spezifische biofunktionelle Liganden gebunden werden.
iii) Spezifische biofunktionelle Liganden können auch als das Polymer während der Kopräzipitation ohne nennenswerten Verlust der biologischen Wirksamkeit fungieren.
iv) Behandlung der Teilchen mit bifunktionellen Reagenzien können die Gesamtstabilität verbessern, sowohl diejenige der Teilchen als auch diejenige der Suspensionen, ohne eine übermäßige Beeinträchtigung der Teilchengröße.
v) Die Teilchen sind im Falle der Ankopplung an spezifische biofunktionelle Liganden in magnetischen Immunassays von interessanten biologischen Substanzen verwendbar.
vi) Die Teilchen setzen die NMR-Relaxationszeit von Nachbarprotonen in Lösungen oder Geweben herab. Diese Verminderung ist am ausgeprägtesten in Bezug auf die T&sub2;- (Spin-Spin)-Relaxation.
Während die Erfindung unter Bezugnahme auf die spezifischen Beispiele beschrieben wurde, ist es ungeachtet dessen für Fachleute selbstverständlich, daß Variationen der Verfahrensbedingungen und -Parameter zum Einsatz gelangen können. Die nun folgenden Ansprüche sollen so ausgelegt werden, daß sie solche Abwandlungen mit einschließen.
Die Erfindung umfaßt neue magnetische Polymerteilchen und Verfahren zu ihrer Herstellung. Diese Teilchen sind auf einer Vielzahl von biologisch-medizinischen Gebieten einschließlich der Zellerkennung, bei der Verwendung als Kontrastmittel für NMR-Darstellung, immobilisierenden Enzymreaktionen, als Immunassay sowie anderen analytischen und diagnostischen Techniken.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von magnetischen Polymerteilchen, bei dem man:

(a) eine wäßrige Lösung von Übergangsmetallionen, die in der Lage sind, zur Bildung eines magnetischen Präzipitats zu reagieren und einem Polymer, das zugängliche Koordinationsstellen aufweist, in Anteilen, die zur Herstellung eines resuspendierbaren Produktes angepaßt sind, herstellt, mit der Maßgabe, daß das Polymer kein Polysaccharid oder Derivat davon ist;

(b) die Metallionen in Gegenwart des Polymers zur Bildung eines magnetischen Präzipitats, das magnetische Polymerteilchen enthält, umsetzt; und

(c) die magnetischen Polymerteilchen zurückgewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die wäßrige Lösung eine niedrige Ionenstärke besitzt, die angepaßt ist, um die Bildung einer stabilen Suspension zu ermöglichen.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, das weiterhin den Schritt

(d) Abfiltrieren der Suspension durch ein Filter mit Poren von höchstens 0,44 um Durchmesser,

einschließt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das weiterhin den Schritt

(e) Umsetzen der magnetischen Polymerteilchen mit einer für das Polymer spezifischen bifunktionellen Verbindung,

einschließt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiterhin enthaltend den Schritt

(e) Umsetzung der magnetischen Polymerteilchen mit einer bifunktionellen Verbindung, die zur Bildung von überwiegend intra-partikulären Bindungen angepaßt ist, wobei die bifunktionelle Verbindung terminale Gruppen aufweist, die aus der Gruppe bestehend aus Arylnitrenen, Imidoester, N-Hydroxysuccinimidester, 2-Diazo-3,3,3-trifluoropropionat, Maleimiden, Pyridyldisulfiden, Halogennitrobenzolen, Isothiocyanaten, Halogensulfonaten, aktiven Halogenen und aktiven Aldehyden ausgewählt ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das weiterhin den Schritt

(f) Umsetzung der magnetischen Polymerteilchen sowohl mit einer bifunktionellen Verbindung, die zur Bildung von überwiegend extra-partikulären Bindungen angepaßt ist, wobei die bifunktionelle Verbindung terminale Gruppen aufweist, die aus der Gruppe bestehend aus Arylnitrenen, Imidoester, N-Hydroxysuccinimidester, 2-Diazo-3,3,3-trifluaropropionat, Maleimiden, Pyridyldisulfiden, Halogennitrobenzolen, Isothiocyanaten, Halogensulfonaten, aktiven Halogenen und aktiven Aldehyden ausgewählt ist, als auch mit einem biofunktionellen Ligand ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörper, Lektinen, Avidin, Biotin, Staphylococcus-Protein A (SPA), Enzymen, Serumproteinen, C1q, Komplementproteinen und Rheumafaktor,

umfaßt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin enthaltend den Schritt

(f) Umsetzung der magnetischen Polymerteilchen mit sowohl einem aktivierenden Mittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus wasserlöslichen Carbodiimiden, Glutaraldehyd, Cyanhalogeniden, Periodaten und Tanninsäure, als auch einem biofunktionellen Ligand ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörper, Lektinen, Avidin, Biotin, Staphylococcus-Protein A (SPA), Enzymen, Serumproteinen, C1q, Komplementproteinen und Rheumafaktor.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das Polymer aus der Gruppe bestehend aus synthetischen Proteinen, natürlichen Proteinen, Polyaminosäuren, Carboxypolyalkylen, Alkoxypolyalkylen, Aminopolyalkylen, Hydroxypolyalkylen, Sulfoxypolyalkylen, Carboxypolyalkylenen, Alkoxypolyalkylenen, Aminopolyalkylenen, Hydroxypolyalkylenen, Sulfoxypolyalkylenen, Polysilanen, Polyphosphinen und Copolymeren davon ausgewählt ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem das Polymer oxysäure-funktionelle Gruppen enthält, die zugängliche Koordinationsstellen besitzen.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem das Polymer ein Protein ist, das zugängliche Koordinationsstellen besitzt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem die Übergangsmetallionen aus der Gruppe bestehend aus jenen ausgewählt sind, die Copräzipitate bilden, welche mindestens ein ungepaartes Elektron und eine Spinel- oder inverse Spinelstruktur besitzen.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem die Obergangsmetallionen ein Paar von Ionen umfassen, ausgewählt aus der Gruppe Co(II) + Ga(III)

Ga(III) + Er(III)

Co(II) + Ru(III)

Ga(III) + Ru(III)

Co(II) + Mn(II)

Ga(III) + Mn(II)

Ga(III) + V(III)

Co(II) + V(III)

Ga(III) + Mo(V)

Ga(III) + Fe(III)

V(III) + Fe(III)

Mn(II) + Ru(III)

V(III) + Mn(II)

Co(II) + Mo(V)

Cr(III) + Ga(III)

Cr(III) + Mn(II)

Er(III) + Ru(III)

Er(III) + Co(II)

Mn(II) + Er(III)

Cr(III) + Fe(II).

13. Resuspendierbare magnetische Polymerteilchen enthaltend das Reaktionsprodukt aus einer wasserlöslichen Form von Eisen und einem wasserlöslichem Polymer, welches zugängliche Koordinationsstellen aufweist, mit der Maßgabe, daß das wasserlösliche Polymer kein Polysaccharid oder Derivat davon ist.

14. Magnetische Polymerteilchen nach Anspruch 13, worin das Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe von synthetischen Proteinen, natürlichen Proteinen, Polyaminosäuren, Carboxypolyalkylen, Alkoxypolyaikylen, Aminopolyalkylen, Hydroxypolyalkylen, Sulfoxypolyalkylen, Carboxypolyalkylenen, Alkoxypolyalkylenen, Aminopolyalkylenen, Hydroxypolyalkylenen, Sulfoxypolyalkylenen, Palysilanen, Poiyphosphinen und Copolymeren davon.

15. Verfahren zur Herstellung von ferromagnetischen Polymerteilchen, bei dem man:

(a) eine wäßrige Lösung von Eisen, das in der Lage ist zur Bildung eines magnetischen Präzipitates zu reagieren und einem Polymer, das verfügbare Koordinationssteilen aufweist, herstellt, mit der Maßgabe, daß das Polymer kein Polysaccharid oder Derivat davon ist;

(b) einen stöchiometrischen Überschuß einer starken Base zugibt;

(c) die Lösung rührt;

(d) die magnetischen Polymerteilchen präzipitieren läßt; und

(e) die magnetischen Polymerteilchen zurückgewinnt.

16. Verfahren zur Bestimmung einer vorgegebenen Spezies, bei dem man:

(a) eine wäßrige Lösung von Übergangsmetallionen, die in der Lage sind, zur Bildung eines magnetischen Präzipitates zu reagieren und einem Polymer, herstellt, das zugänglich Koordinationsstellen aufweist, in Anteilen, die zur Bildung von resuspendierbaren Teilchen angepaßt sind, mit der Maßgabe, daß das Polymer kein Polysaccharid oder Derivat davon ist;

(b) die Metallionen in Gegenwart des Polymers zur Bildung eines magnetischen Präzipitates, das magnetische Polymerteilchen enthält, umsetzt;

(c) die magnetischen Polymerteilchen zurückgewinnt;

(d) die magnetischen Polymerteilchen in einer wäßrigen Lösung resuspendiert;

(e) die magnetischen Polymerteilchen sowohl mit einer bifunktionellen Verbindung, die zur Bindung von überwiegend extra-partikulären Bindungen geeignet ist, als auch mit einem biofunktionellen Ligand umsetzt, wobei der biofunktionelle Ligand in seiner Bindungseigenschaft spezifisch für die vorbestimmte Spezies ist;

(f) eine Mischung, die eine unbekannte Menge der vorbestimmten Spezies enthält, mit einer Suspension aus den magnetischen Polymerteilchen, die den biofunktionellen Liganden enthalten, in Kontakt bringt und dadurch bewirkt, daß sich der biofunktionelle Ligand an die vorbestimmten Spezies bindet;

(g) die Mischung durch ein magnetisches Filter mit einem magnetischen Feld schickt, wobei das Filter angepaßt ist, um die magnetischen Polymerteilchen zurückzuhalten;

(h) das magnetische Feld vom Filter nimmt und die zurückgehaltenen magnetischen Polymerteilchen eluiert; und

(i) die eluierten magnetischen Polymerteilchen durch eine vorgewählte analytische Methode analysiert, die angepaßt ist, die gewünschten Daten relativ- zur vorbestimmten Spezies zu ergeben.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die bifunktionelle Verbindung terminale Gruppen aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arylnitrenen, Imidoester, N-Hydroxysuccinimidester, 2-Diazo-3,3,3-trifluoropropionat, Maleimiden, Pyridyldisulfiden, Halogennitrobenzolen, Isothiocyanaten, Halogensulfonaten, aktiven Halogenen und aktiven Aldehyden.

18. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 16 und 17, in dem der biofunktionelle Ligand aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörper, Lektinen, Avidin, Biotin, Staphylococcus-Protein A (SPA), Enzymen, Serumproteinen, C1q, Komplementproteinen und Rheumafaktor ausgewählt ist.

19. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, in dem der biofunktionelle Ligand ausgewählt ist, um die Hälfte eines Bindungspaares, ausgewählt aus der Gruppe von Antigenen und ihren Antikörpern, Haptenen und ihren Antikörpern, Hormonen und ihren Rezeptoren, Vitaminen und ihren Rezeptoren, Toxinen und ihren Rezeptoren, Drogen und ihren Rezeptoren und Enzymen und ihren Kofaktoren zu ergeben.

20. Verfahren zur Herstellung von magnetischen Polymerteilchen, bei dem man:

(a) eine erste wäßrige Lösung, die mindestens zwei Spezies von Übergangsmetallionen enthält, die in der Lage sind, miteinander zur Bildung eines magnetischen Präzipitates zu reagieren und ein Polymer, das eine biofunktionelle Aktivität aufweist und zugängliche Koordinationsstellen aufweist, in Anteilen, die zur Bildung eines resuspendierbaren Präzipitatproduktes mit biofunktioneller Aktivität angepaßt sind, miteinander kombiniert, mit der Maßgabe, daß das Polymer kein Polysaccharid oder Derivat davon ist;

(b) die Übergangsmetallionen in Gegenwart des Polymers zur Bildung eines magnetischen Präzipitats umsetzt, das einen Komplex dieser Metalle und des biofunktionellen Polymers enthält;

(c) das magnetische Präzipitat aus der ersten Lösung zurückgewinnt.

21. Resuspendierbare magnetische Polymerteilchen nach Anspruch 13 und 14 zur Verwendung in der Analyse und Biologie.

22. Resuspendierbare magnetische Polymerteilchen nach Anspruch 13 und 14 zur Verwendung auf den Gebieten der Medizin und Diagnose.

23. Resuspendierbare magnetische Polymerteilchen nach Anspruch 13 und 14 zur Verwendung als Kontrastmittel in der NMR-Diagnostik.