EP0991943A1 - Magnetische partikel mit biologisch aktiven rezeptoren - Google Patents

Magnetische partikel mit biologisch aktiven rezeptoren

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EP0991943A1
EP0991943A1 EP97929133A EP97929133A EP0991943A1 EP 0991943 A1 EP0991943 A1 EP 0991943A1 EP 97929133 A EP97929133 A EP 97929133A EP 97929133 A EP97929133 A EP 97929133A EP 0991943 A1 EP0991943 A1 EP 0991943A1
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EP
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particles according
protein
magnetic
color pigments
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Definitions

  • the invention relates to magnetic particles for separating biological mixtures, a process for their production and use of the magnetic particles.
  • US 4,795,698 discloses a method for producing suspendable magnetic particles coated with a biological material.
  • the coprecipitate is resuspended, washed and then processed into a magnetic polymer material.
  • the method has the disadvantage that iron ions are released ⁇ .
  • the object of the present invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • simple and inexpensive to produce magnetic particles for separating biological mixtures are to be provided.
  • magnetic particles are provided for separating biological mixtures, which have pearlescent color pigments with magnetic properties and a co-polymer coating.
  • Pearlescent color pigments are oily raw materials that are produced in particle form for the coating industry on a large scale. These are mica sheets that can be coated with various metal oxides, such as hamatite or titanium oxide.
  • black pigment In the case of magnetic pearlescent color pigments, a core made of mica is first coated with titanium oxide and then with magnetite. This so-called black pigment has ferromagnetic properties. It is available in m particle size distributions of usually 10-60 ⁇ m, preferably in m particle sizes of 1-30 ⁇ m.
  • the black pigment usually has the following composition:
  • the black pigment can surprisingly be coated directly with biological polymers. In this form it is suitable for separating biological mixtures.
  • magnétique pearlescent color pigments Another surprising property of the magnetic pearlescent color pigments is their resistance to acids, such as glacial acetic acid, alkalis, such as sodium hydroxide, and to inorganic and organic solvents, such as dimethyl sulfoxide / water mixtures, acetone, alcohols, nitro thinners, methylene chloride u. the like
  • acids such as glacial acetic acid, alkalis, such as sodium hydroxide
  • inorganic and organic solvents such as dimethyl sulfoxide / water mixtures, acetone, alcohols, nitro thinners, methylene chloride u. the like
  • the magnetic behavior of the particles according to the invention is not influenced by the aforementioned substances.
  • the particles according to the invention are preferably used in combinatorial chemistry and in high throughput screening. They can be used in particular as solid phase carriers for organic reactions.
  • the biological polymer coating is not resistant to reactions requiring extreme solvents. It has surprisingly been found that black pigments can be used as solid phase carriers in combinatorial chemistry or in high throughput screening. They can also be used as a catalyst.
  • R-IgG For the production of biotmylated Rmder immunoglobulin, 0.5 ml of an R-IgG solution, the 2 mg of R-IgG (Boeh ⁇ nger Mannneim) is dissolved, and 1 ml of phosphate-buffered saline solution, pH 7.25 (2.76 g / 1 NaH PO HO ; 3.56 g / 1 Na HPO 2H 0; 8 g / 1
  • the particles are then washed 3 times with 100 ml of Milli-Q water, the solid and liquid phase being separated between the washing steps by sedimentation or centrifugation.
  • the particles are then taken up again in 40 ml of phosphate-buffered sodium chloride solution, pH 7.25.

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Abstract

Die Erfindung betrifft magnetische Partikel zum Auftrennen von biologischen Gemischen, die Perlglanzfarbpigmente mit magnetischen Eigenschaften und einen biologischen Polymerüberzug aufweisen.

Description

Magnetische Partikel mit biologisch aktiven Rezeptoren
Die Erfindung betrifft magnetische Partikel zum Trennen von biologischen Gemischen, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie eine Verwendung der magnetischen Partikel.
Aus der US 3,970,518 ist es bekannt, magnetische Partikel mit verschiedenartigen magnetischen Eigenschaften als Festphase zum Trennen von oiologischen Gemischen zu verwenden. Die Par- tikel sind mit einem biologiscnen Material überzogen. Sie eignen sich bsp. zum Abtrennen bestimmter Zellpopulationen aus einem Gemisch verschiedenartiger Zellpopulationen.
Die US 4,795,698 offenbart ein Verfahren zur Herstellung suspendierbarer, mit einem biologischen Material überzogener magnetischer Partikel. Dabei wird eine Koprazipitation aus einer Fe (III) -Ionen und ein Polymer, bsp. ein Protein, enthaltenden Losung durch Zugabe bei einer starken Base, wie NH_OH, durchgeführt. Das Koprazipitat wird resuspendiert, gewaschen und dann zu einem magnetischen Polymermaterial weiterverarbeitet. Das Verfahren hat den Nachteil, daß Eisenionen frei¬ gesetzt werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile des Stands der Technik zu beseitigen. Insbesondere sollen einfach und kostengünstig herstellbare magnetische Partikel zum Trennen biologischer Gemische bereitgestellt werden.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 11 bis 18 gelost. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 10. Nach Maßgabe der Erfindung sind magnetische Partikel zum Trennen von biologischen Gemischen vorgesehen, die Perlglanzfarbpigmente mit magnetischen Eigenschaften und einem cαolo- gischen Polymeruberzug aufweisen. Perlglanzfarbpigmente sind oillige Ausgangsrohstoffe, die m Partikelform für die Lack- mdustrie m großem Maßstab hergestellt werden. Dabei handelt es sich um Glimmerblattchen, die mit verschiedenen Metalloxi- den, wie Hamatit oder Titanoxid, belegt sein können.
Bei magnetischen Perlglanzfarbpigmenten ist ein Kern aus Glimmer zunächst mit Titanoxid und dann mit Magnetit umman- tel. Dieses sogenannte Schwarzpigment besitzt ferromagneti- sche Eigenschaften. Es ist m Partikelgroßenverteilungen von üblicherweise 10 - 60 μm, vorzugsweise m Partikelgroßen von 1 - 30 μm, verfugbar. Das Schwarzpigment hat üblicherweise die folgenαe Zusammensetzung:
Glimmer 38 - 48 Gew.M
Titandioxid 5 - 9 Gew. Magnetit 47 - 53 Gew.
Das Schwarzpigment kann überraschenderweise direkt mit biologischen Polymeren überzogen werden. Es eignet sich in dieser Form zum Trennen von biologischen Gemischen.
Eine weitere überraschende Eigenschaft der magnetischen Perlglanzfarbpigmente ist deren Resistenz gegen Sauren, wie Eisessig, Laugen, wie Natriumhydroxid, sowie gegen anorganische und organische Losungsmittel, wie Dι-methyl-sulfoxιd/ Wasser- Gemische, Aceton, Alkohole, Nitro-Verdunnungen, Methylenchlo- rid u. dgl . Das magnetische Verhalten der erfmdungsgemaßen Partikel wird durch die vorgenannten Substanzen nicht beeinflußt. Die erfmdungsgemaßen Partikel finden vorzugsweise m der kombinatorischen Chemie und im High Throughput Screenmg Anwendung. Sie können insbesondere als Festphasentrager für or- ganische Reaktionen eingesetzt werden.
Bei extreme Losungsmittel erfordernden Reaktionen ist der biologische Poly eruberzug nicht resistent. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß Schwarzpigmente als Festphasen- trager m der kombinatorischen Chemie oder im High Throughput Screenmg verwendbar sind. Sie können ferner als Katalysator eingesetzt werden.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines Ausfuhrungsbei- spiels naher erläutert.
1. Herstellung von biotmyliertem Rinder-Immunglobulm G (R- igG)
Zur Herstellung von biotmyliertem Rmder-Immunglobulm werden 0,5 ml einer R-IgG-Losung, die 2 mg R-IgG (Boehπnger Mannneim) gelost m 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlosung, pH 7,25 (2,76 g/1 NaH PO H O; 3,56 g/1 Na HPO 2H 0; 8 g/1
NaCl) enthalt, mit einer 6 μl D-Biotmoyl-ε-ammocapronsaure- N-hy roxysuccmimid-ester-Losung m phospnatgepufferter Kochsalzlosung, pH 7,25, und DMSO (Biotm Labelmg Kit von Beoh- ringer Mannneim) vermischt. Die Mischung wird 2,5 h bei Raumtemperatur mittels eines Magnetruhrers gerührt und anschließend über Nacht stehengelassen. Das molare Verhältnis von Biotin zu R-IgG entspricht 20 : 1. 2. Beschichtung von Magnetpartikeln mit biotiyliertem R-IgG
2 g "4898 Iπodm® Black Mica" (Merck Katalog Nr. 4898.00050) werden einer Losung von 40 ml Beschichtungspuffer (NaHCC , 4,2 g/1, pH 9,6) und 6 μl R-IgG-Biotm-Losung gemäß Ziffer 1 suspendiert und unter Verwendung eines mechanischen Ruhrwerks über Nacht so mkubiert, daß die Suspension durch gelindes Bewegen erhalten bleibt.
Anschließend werden die Partikel 3 x mit je 100 ml Milli-Q- Wasser gewaschen, wobei jeweils zwischen den Waschschritten durch Sedimentation oder Zentπfugation die Trennung von fester und flussiger Phase erfolgt. Anschließend werden die Partikel m 40 ml phosphatgepufferter Kochsalzlosung, pH 7,25, wieder aufgenommen.
3. Beschichtung von Magnetpartikeln mit R-IgG
Zur Kontrolle wird ein Ansatz mit nicht biotmyliertem R-IgG unter identischen Konzentrationsbedingungen wie bei Ziffer 2 durchgeführt .
4. Austesten der Bmdefahigkeit
Zum Austesten der Bmdefahigkeit werden 200 μl der vollständig suspendierten Magnetpartikel gemäß Ziffer 2 mit 200 μl einer Streptavidm-Peroxidase-Konjugatlosung (Boehr ger Mannheim Katalog Nr.: 1089 153) 1 : 20.000 Verdünnung in phosphatgepufferter Kochsalzlosung, pH 7,25, gemischt und un- ter Schuttein 45 mm. mkubiert. Anschließend werden mittels
Magnetseparator (Boehrmger Mannheim Best. Nr. 1 641 794) die
Partikel abgetrennt und der Überstand verworfen. Das wird wiederholt. /Anschließend werden 220 μl ABTS©-Losung
(Boehrmger Mannheim Katalog Nr. 1 204 530 und 1 112 422) zu- gegeben und nach Resuspension 15 mm. mkubiert. Mittels Magnetseparator werden die Partikel abgetrennt. 200 μl_ des Uberstands werden m eine Mikrotitrationsplatte (Innova GmbH) überfuhrt und bei 405 nm rransmissionsphotometrisch gemessen.
Ergebnis
Magnetpartikel mit R-IgG Biotin 850 mE (gemäß Ziffer 2)
Kontrolle mit R-IgG (gemäß Ziffer 3; 210 mE

Claims

Patentansprüche
1. Magnetische Partikel zum Trennen von biologischen Gemischen, die Perlglanzfarbpigmente mit magnetischen Eigenschaf- ten und einen biologischen Polymeruberzug aufweisen.
2. Magnetische Partikel nach Anspruch 1, wobei der Polymeruberzug ein Protein ist.
3. Magnetische Partikel nach Anspruch 2, wobei das Protein ein bmdefahiges Protein ist.
4. Magnetische Partikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein einen bmdefahigen Rezeptor tragt.
5. Magnetische Partikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein ein Rezeptor ist.
6. Magnetische Partikel nach einem der vorhergehenden Anspru- ehe, wobei das bmdefahige Protein ein Antikörper ist.
7. Magnetische Partikel naen einem der vorhergehenden /Ansprüche, wobei das bmdefahige Protein ein Antigen ist.
8. Magnetische Partikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das bmdefahige Protein eine Komponente des Li- gand-Rezeptor-Paares von Streptavid oder Biotm ist.
9. Magnetische Partikel nach einem der vorhergehenden Anspru- ehe, wobei die Perlglanzfarbpigmente einen Kern aus Glimmer aufweisen, der mit mindestens einem Metalloxid umgeben ist, das magnetische Eigenschaften aufweist.
10. Magnetische Partikel nach einem der vorhergehenden An- spruche, wobei die Perlglanzfarbpigmente einer Korngroßen- Verteilung von 0,1 - 500 μm, vorzugsweise von 1 - 100 μm, vorliegen.
11. Verfahren zum Herstellen von magnetischen Partikeln zum Trennen von biologischen Gemischen, wobei die Partikel Perlglanzfarbpigmente mit magnetischen Eigenschaften sind und direkt mit einem Überzug aus biologischem Material bescnichtet werden.
12. Verwendung von magnetischen Partikeln nach einem αer Ansprüche 1 bis 10 zum Abtrennen der Festphase tei Immunoas- says .
13. Verwendung von magnetischen Partikeln nach einem der An- spruche 1 bis 10 als Bestandteil eines analytiscnen Reagenzansatzes .
14. Verwendung von magnetischen Partikeln nach einem der Ansprüche 1 bis 10 als Bestandteil eines Analysesystems, beste- hend aus Reagenz und Partikeln.
15. Verwendung von magnetischen Partikeln nach einem αer Ansprüche 1 bis 10 als Bestandteil eines Analysesystems, bestehenden aus Geraten, Reagenzien und Partikeln.
16. Verwendung der magnetischen Partikel nach einem der Ansprüche 1 bis 10 für die kombinatorische Chemie und/oder das High Throughput Screenmg.
17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei die magnetischen Partikel stark saurem oder basischen Milieu oder m einem organischen Losungsmittel eingesetzt werden.
18. Verwendung von magnetischen Perlglanzfarbpigmenten für die kombinatorische Chemie und/oder das High Throughput Screenmg.
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