DE3836475C2 - Verfahren zur Herstellung magnetisch reagierender Polymerteilchen und ihre Verwendung - Google Patents

Verfahren zur Herstellung magnetisch reagierender Polymerteilchen und ihre Verwendung

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung magnetisch reagierender Polymerteilchen gemäß Oberbegriff des Patentanspruchs 1 und ihre Verwendung in Immunoassays sowie auf biomedizinischen und industriellen Anwendungsgebieten.
Zahlreiche biologische Techniken, wie Immunoassays, Affinitäts­ reinigungsverfahren und dergl., erfordern die Abtrennung von gebundenen Fraktionen aus freien Fraktionen. Magnetische Teilchen werden zur Erleichterung des gewünschten Trennvorgangs verwendet.
Ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff von Patentanspruch 1 ist aus EP 0 234 083 bekannt. Bei diesem 2stufigen Verfahren wird in einem ersten Schritt ein den inneren Kern bildendes Polymerteilchen (u. a. aus Polystyrol) mit einem magnetisch reagierenden Puder (z. B. Fe₃O₄ als ein Mischoxid aus 2- und 3wertigen Metalloxidteilchen) bedeckt. In einem zweiten Schritt wird eine zusätzliche Polymerschicht mit funktionellen Gruppen aufgebracht, um das Abfallen des magnetisch reagierenden Puders zu verhindern und biologisch aktive Komponenten, wie Antigene, Antikörper oder Enzyme, zu binden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, im Gegensatz zur EP 0 234 083 ein einstufiges Verfahren zur Herstellung von magnetisch reagierenden Polymerteilchen mit unterschiedlichen Oberflächenladungen und funktionellen Gruppen aus leicht zugänglichen Polymerteilchen bereitzustellen, die biologisches Material durch passive Adsorption oder kovalente Kopplung binden können, nur mäßig sedimentieren und rasch magnetisch abgetrennt werden können. Des weiteren sollen medizinische, biologische, diagnostische und industrielle Verwendungen für diese magnetisch reagierenden Polymerteilchen bereitgestellt werden.
Diese Aufgabe wird bei dem Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 durch die Merkmale des Kennzeichens von Anspruch 1 gelöst.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der hergestellten magnetisch reagierenden Polymerteilchen als feste Phase in Analyse- oder Reinigungsverfahren.
Die hergestellten magnetischen Teilchen sind von monodisperser Größe mit rauher Oberfläche und weisen einen Gehalt an magnetischem Metalloxid von etwa 5 bis 50% und vorzugsweise von 10 bis 25% auf. Teilchen mit diesen Eigenschaften haben sich als wertvoll für Immunoassays und eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungszwecken erwiesen. Diese magnetischen Teilchen lassen sich für die passive oder kovalente Kopplung von biologischem Material, wie Antigenen, Antikörpern, Enzymen oder DNA/RNA, sowie als feste Phase für verschiedene Typen von Immunoassays, DNA/RNA-Hybridisierungstests, Affinitäts­ reinigungsverfahren, Zelltrennung und andere biomedizinische Anwendungszwecke verwenden. Die magnetischen Teilchen können auch für industrielle Anwendungszwecke eingesetzt werden, beispielsweise zur Behandlung von industriellen Abfallprodukten, insbesondere Abwässern.
Es können unter anderem folgende Vorteile erzielt werden:
Eine Vielzahl von polymeren Kernteilchen mit Größen von etwa 1 bis 100 µm lassen sich leicht in magnetisch reagierende Teilchen umwandeln.
Der Metalloxidgehalt kann je nach dem Anwendungszweck variiert werden.
Die Oberfläche kann zu einer Vielzahl von funktionellen Gruppen für die kovalente Kopplung derivatisiert werden.
Eine Vielzahl von Monomeren kann für die endgültige Beschichtung verwendet werden, um unterschiedliche Oberflächeneigenschaften des gebildeten Polymeren zu erzeugen.
Sowohl vernetzte als auch unvernetzte magnetisch reagierende Polymerteilchen können hergestellt werden.
Es lassen sich monodisperse, magnetisch reagierende Polymerteilchen herstellen.
Die magnetischen Teilchen der Erfindung lassen sich herstellen, indem man zunächst ein Metalloxid mit einer durchschnittlichen Größe von etwa 1 µm oder weniger bildet. Das Metalloxid wird hergestellt, indem man ein Gemisch eines zweiwertigen und dreiwertigen Metallsalzes, vorzugsweise aus Eisen(II)- und Eisen(III)-sulfat oder -chlorid mit einer Natriumhydroxidlösung erwärmt und fällt. Das Molverhältnis des zweiwertigen Metallsalzes zum dreiwertigen Metallsalz kann von 0,5 bis 2,0 und vorzugsweise von 0,5 bis 1,0 variieren, um die gewünschte Größe und die gewünschten magnetischen Eigenschaften des Metalloxids zu erzielen. Es läßt sich feststellen, daß das Molverhältnis von zweiwertigem Metallsalz zu dreiwertigem Metallsalz die Größe des Metalloxids beeinflußt; je größer das Mol­ verhältnis des zweiwertigen Metallsalzes zum dreiwertigen ist, desto geringer ist die Größe des Metalloxids. Das Molverhältnis von zweiwertigem zu dreiwertigem Metallsalz beeinflußt auch die Farbe der gebildeten magnetischen Teilchen: je geringer das Molverhältnis ist, desto heller ist die braunstichige Färbung der gebildeten magnetischen Teilchen. Vorzugsweise ist das Metalloxid entweder superparamagnetisch oder paramagnetisch, obgleich auch ferromagnetisches Metalloxid verwendet werden kann, vorausgesetzt, daß eine Zentrifugation anstelle einer magnetischen Trennung während der Reinigung verwendet wird.
Weitere zweiwertige Metallsalze, wie Mangan-, Magnesium-, Kobalt-, Nickel-, Zink- und Kupfersalze, können anstelle des Eisen(II)-salzes verwendet werden.
Nachdem das Metalloxid ausgefällt ist, wird es mehrmals durch Zentrifugation bei 250 × g gewaschen, bis der Überstand einen neutralen pH-Wert aufweist. Das Metalloxid wird sodann in entionisiertem Wasser resuspendiert und mechanisch bei hoher Geschwindigkeit gerührt, um Aggregate von Metalloxidkristallen aufzubrechen. Eine weitere Zentrifugation bei 250 × g ergibt keinerlei Pelletisierung des Metalloxids. Der Überstand, der Metalloxidkristalle von geringerer Teilchengröße enthält, wird gewonnen, und das Pellet wird in entionisiertem Wasser resuspendiert. Dieses Verfahren wird mindestens dreimal oder solange wiederholt, bis der Großteil des Metalloxids bei 250 × g nicht mehr pelletisiert werden kann. Das auf diese Weise erhaltene Metalloxid weist üblicherweise eine Größe von weniger als 2,0 µm auf. Eine Zentrifugation von geringer Geschwindigkeit bei 100 × g zur Entfernung von größeren Kristallen vermindert die Teilchengröße auf weniger als 0,8 µm.
Das Metalloxid mit einer durchschnittlichen Größe von 1,0 µm oder weniger wird mit Monomeren vermischt und auf die polymeren Kernteilchen, vorzugsweise Polystyrolteilchen, mit einer Größe von 1 bis 100 µm in Gegenwart von Initiator schichtförmig aufgebracht. Eine Zugabe einer geringen Menge an Emulgiermittel trägt dazu bei, eine Agglomeration der Teilchen zu verhindern. Anschließend werden die magnetischen Teilchen mit einer Schutzschicht aus Polymeren, vorzugsweise Polystyrol, beschichtet, um eine Beeinträchtigung des Metalloxids zu verhindern. Ist die Bildung von funktionalisierten magnetischen Teilchen erwünscht, so können die magnetischen Teilchen mit einer weiteren Schicht an funktionalisiertem Polymeren überzogen werden, um funktionelle Gruppe, wie Carboxyl-, Amino- oder Hydroxylgruppen, für eine kovalente Kupplung von biologischem Material bereitzustellen.
Die erfindungsgemäß hergestellten magnetischen Teilchen lassen sich durch Fig. 1 darstellen, worin A das Kernteilchen, B den Metalloxid-Polymer-Überzug, C den Polymer-Schutzüberzug und D den funktionalisierten Polymer-Überzug darstellen. Fig. 2 zeigt die Transmissionelektronenmikrographie einer 0,08 bis 0,1-µm-Scheibe eines erfindungsgemäß hergestellten magnetischen Teilchens. Fig. 3 zeigt eine Rasterelektronenmikrographie von erfindungsgemäß hergestellten magnetischen Teilchen von 6,8 µm. Fig. 3a stellt eine 1000fache und Fig. 3b eine 5000fache Vergrößerung dar.
Bei den erfindungsgemäß geeigneten polymeren Kernteilchen kann es sich um beliebige Polymere handeln, die in Form einer Dispersion von kleinen Teilchen erhalten werden und die ein Monomer absorbieren und dabei bewirken, daß die Oberfläche der Kernteilchen mit einem Überzug aus dem Gemisch von Metalloxid und Monomer überzogen wird. Die Kernteilchen können von beliebiger Größe und Form sein. Vorzugsweise weisen sie eine Größe von 1-100 µm auf und besitzen eine kugelförmige Gestalt. Bei Verwendung von monodispersen Kernteilchen sind auch die gebildeten magnetischen Teilchen von monodisperser Größe. Die Kernteilchen lassen sich durch Emulsionspolymerisation, Suspensionspolymerisation oder andere Polymerisationsarten mit oder ohne Vernetzungsmittel, wie Divinylbenzol oder dgl., erhalten. Zu den Monomeren, die zur Herstellung der Kernteilchen verwendet werden können, gehören Styrol, Methylmethacrylat, Vinyltoluol und dgl. Es kann auch ein Gemisch von Monomeren verwendet werden. Das zur Beschichtung des magnetischen Metalloxids oder zur Bildung des Schutzüberzugs verwendete Monomer kann vom gleichen Typ wie die Kernteilchen sein oder nicht. Das Gewichtsverhältnis von Monomeren für die Metalloxid­ beschichtung zu den Kernteilchen kann 0,1 bis 12 und vorzugsweise 0,2 bis 6 betragen, je nachdem, welche Dicke der Metalloxid/ Polymerschicht erwünscht ist. Wenn ein Metalloxid, das aus einem Gemisch von Eisen(II)- und Eisen(III)-salzen hergestellt worden ist, für die Beschichtung verwendet wird, beträgt vorzugsweise das Gewichtsverhältnis von Monomeren zu Kernteilchen etwa 0,1 bis 0,5. Wird jedoch ein aus einem Gemisch aus Mangan(II)- und Eisen(III)-salzen hergestelltes Metalloxid für die Beschichtung verwendet, so kann das Gewichtsverhältnis von Monomeren zu Kernteilchen 0,1 bis 12 betragen. Wenn vernetzte magnetische Teilchen, die gegenüber herkömmlichen organischen Lösungsmitteln inert sind, erwünscht sind, ist es infolgedessen bevorzugt, ein Metalloxid zu verwenden, das aus einem Gemisch von Mangan(II)- und Eisen(III)-salzen mit Monomeren mit einem Gehalt an 2 bis 10 Gew.-% und vorzugsweise 8 bis 10 Gew.-% an Vernetzungsmittel besteht, wobei das Gewichtsverhältnis von Monomeren zu Kernteilchen 3 bis 12 und vorzugsweise 4 bis 6 beträgt. Bei einem geringeren Gewichtsverhältnis von Monomeren zu Kernteilchen (d. h. 0,1 bis 0,5) während der Herstellung des Metalloxid/Polymer-Überzugs ist es bevorzugt, die erhaltenen magnetischen Teilchen mit einer Schutzschicht eines Polymer-Überzugs zu überziehen, um eine weitere Haftung des Metalloxids an der Oberfläche der magnetischen Teilchen zu gewährleisten. Wird jedoch ein höheres Verhältnis von Monomerem zu Kernteilchen (d. h. 3 bis 12) angewandt, so ist kein schützender Polymer-Überzug erforderlich. Die Polymerisations­ temperatur kann von 50 bis 90°C und vorzugsweise von 55 bis 65°C betragen. Der Polymerisationsinitiator kann entweder wasserlöslich, wie Kaliumpersulfat oder dergl., oder wasser­ unlöslich sein, wie Benzoylperoxid und dgl. Es können auch andere Mittel zur Polymerisationsinitiation verwendet werden, wie Bestrahlung, Ionisierung oder dgl. Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß sich magnetische Teilchen ohne Verwendung eines Emulgiermittels herstellen lassen, wenn ein Metalloxid für die Beschichtung verwendet wird, das aus einem Gemisch aus Mangan(II)- und Eisen(III)-salzen hergestellt worden ist. Jedoch hat sich eine geringe Menge an Emulgiermittel, wie Natriumdodecylsulfat, Aerosol 22, Tween 20 oder Nonidet P-40 (NP 40), als wertvoll erwiesen, um zu verhindern, daß die Teilchen während der Herstellung des Metalloxid-Polymer- Überzugs einer ausgedehnten Aggregation unterliegen, wenn ein Metalloxid, das aus einem Gemisch aus Eisen(II)- und Eisen(III)- salzen hergestellt worden ist, für die Beschichtung verwendet wird. Es können auch andere Emulgiermittel mit der gleichen Fähigkeit verwendet werden. Der Gehalt an magnetischem Metalloxid kann von 5 bis 50% und vorzugsweise von 10 bis 25% variieren, indem man während der Herstellung des Metalloxid- Polymer-Überzugs unterschiedliche Mengen an Metalloxid einsetzt. Es können auch mehrfache Metalloxid/Polymer-Überzüge eingesetzt werden, um den Metalloxidgehalt zu erhöhen. Weitere üblicherweise bei der Polymerisation verwendete Bestandteile können zugesetzt werden, solange sich magnetische Teilchen mit den erwünschten Eigenschaften erzielen lassen. Die Bestandteile zur Herstellung des Metalloxid/Polymer-Überzugs können alle auf einmal zu Beginn der Herstellung dieses Überzugs oder aber stufenweise zugesetzt werden. Wird ein aus einem Gemisch aus Eisen(II)- und Eisen(III)-salzen hergestelltes Metalloxid verwendet, ist es bevorzugt, die Bestandteile stufenweise zuzusetzen. Die Bestandteile können durch mechanisches Rühren, Trommelbehandlung oder andere Bewegungsverfahren unter Vakuum oder Inertgas, wie Argon, vermischt werden. Die funktionellen Gruppen können der Oberfläche der magnetischen Teilchen einverleibt werden, indem man entweder ein Gemisch aus Monomeren und funktionalisiertem Monomerem während der Herstellung des Metalloxid/Polymer-Überzugs verwendet oder die magnetischen Teilchen zum Schluß mit einem weiteren Überzug aus einer dünnen Schicht an funktionalisiertem Monomeren beschichtet. Beim funktionalisiertem Monomeren kann es sich um einen Bestandteil oder ein Gemisch aus folgender Gruppe handeln: 2-Hydroxyethylmethacrylat, 2-Aminoethylmethacrylat, Trimethylammoniummethyl-methacrylat-methosulfat, Dimethylamino­ ethylmethacrylat, Methacrylsäure, Undecylensäure, Methylpropen­ sulfonsäure, Undecylinylalkohol, Oleylamin, Glycidylmethacrylat, Acrolein, Glutaraldehyd und dgl. Die magnetischen Teilchen können auch mit einem Überzug eines anderen Polymeren als er für den Metalloxid-Polymer-Überzug oder den Schutzüberzug verwendet worden ist, beschichtet werden, um sich der Oberflächen­ eigenschaften dieses Polymeren zu bedienen.
Eine Übersicht über den Einsatz einer Vielzahl von magnetischen Teilchen als feste Phase für verschiedene Anwendungszwecke, wie Fluoreszenzimmunoassays, Radioimmunoassays, Enzymimmunoassays, Zelltrennungen, Enzymimmubilisierungen und Affinitäts­ reinigungsverfahren findet sich beispielsweise in folgenden Arbeiten: Hirschbein et al., Chemical Technology, März 1982, S. 172-179; Pourfarzaneh, The Ligand Quarterly, Bd. 5 (1) (1982), S. 41-47; Halling and Dunnill, Enzyme Microbe Technology, Bd. 2 (1980), S. 2-10; Mosbach und Anderson, Nature, Bd. 270 (1977), S. 259-261; Guesdon et al., J. Allergy Clinical Immunology, Bd. 61 (1) (1978), S. 23-27. Einige Einsatzgebiete sind auch in den US-PSen 41 52 210 und 43 43 901 für Enzymimmobilisierungen, in den US-PSen 39 70 518, 42 30 685 und 42 67 234 für Zelltrennungen und in den US-PSen 45 54 088, 46 28 037 und 39 33 997 für Immunoassays beschrieben.
Bestimmte magnetische Teilchen können sich für einen Anwendungs­ zweck eignen, während sie für einen anderen Zweck ungeeignet sind. Beispielsweise sind die in der US-PS 45 54 088 und 46 28 037 beschriebenen magnetischen Teilchen, die einen superparamagnetischen Metalloxidkern enthalten, der allgemein mit einem Überzug aus einem polymeren Silan versehen ist, aufgrund der großen Oberfläche und der langsamen Absetzungs­ geschwindigkeit für Immunoassays und Affinitätsreinigungsverfahren geeignet, während sie für Zelltrennzwecke, wie die Reinigung von Knochenmark, ungeeignet sind. Aufgrund der geringen Größe der in diesen beiden Patenten offenbarten magnetischen Teilchen ist es sehr schwierig, sämtliche magnetischen Teilchen wirksam aus der Zellsuspension abzutrennen. Außerdem ist die nicht-spezifische Bindung von kleineren magnetischen Teilchen an normale Zellen wesentlich höher. Bei der Verwendung von magnetischen Teilchen für die Knochenmarkreinigung werden die magnetischen Teilchen mit Antikörper, z. B. Schaf-anti-Maus-IgG beschichtet, und das Knochenmark wird mit einem Gemisch aus mehreren monoklonalen Antikörpern gegen die Krebszellen- Oberflächenantigene behandelt. Die magnetischen Teilchen binden sich nur an die Krebszellen und bewirken, daß diese von normalen Zellen abgetrennt werden, wenn sie durch ein starkes magnetisches Feld geleitet werden. Die gereinigten Zellen werden sodann dem Patienten zurückgegeben.
Bei Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich die magnetischen Teilchen in bezug auf Größe, Oberfläche, Metalloxidgehalt und Oberflächeneigenschaften für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungszwecken optimieren. Die erfindungsgemäß hergestellten magnetischen Teilchen lassen sich als feste Phase für Enzymimmunoassays, Fluoreszenzimmunoassays, Radio­ immunoassays, DNA/RNA-Hybridisierungsassays und andere diagnostische Anwendungszwecke einsetzen. Immunoassays lassen sich unter Anwendung verschiedener Konfigurationen einsetzen, wie Sandwich-Assays und Assays unter kompetitiver Bindung und dgl., die dem Fachmann geläufig sind. Die DNA/RNA-Hybridisierung kann auch unter Einsatz verschiedener Konfigurationen durch­ geführt werden, z. B. Festphasenhybridisierung oder Flüssigphasen­ hybridisierung. Bei der Festphasenhybridisierung wird eine DNA- oder RNA-Sonde (Fängersonde) zuerst auf den magnetischen Teilchen immobilisiert. Die immobilisierte Fängersonde wird sodann zur Hybridisierung mit einem komplementären Strang der DNA aus der Probe (Proben-DNA) verwendet. Schließlich wird eine weitere Sonde (Signalsonde), die mit einem fluoreszierenden, radioaktiven oder enzymatischen Tracer markiert ist, und zur Hybridisierung mit einem weiteren Teil der Proben-DNA fähig ist, für die Signalerzeugung verwendet. Bei der Flüssigphasen­ hybridisierung läßt man die Fängersonde und die Signalsonde mit der Proben-DNA zuerst in der flüssigen Phase hybridisieren und immobilisiert sie dann an den magnetischen Teilchen.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Signalsonde mit einer oder mehreren Biotingruppen zu markieren. Das Signal wird dadurch nachgewiesen, daß die Biotingruppen eine Bindung mit avidinmarkiertem fluoreszierendem radioaktivem oder enzymatischem Tracer zur Verstärkung der Empfindlichkeit des Tests eingehen.
Die Immunoassays und DNA/RNA-Hybridisierungsassays können auch zur Messung einer Vielzahl von Verbindungen in biologischen Proben eingesetzt werden, z. B. von Arzneistoffen, Hormonen, Antikörpern, Peptiden, DNA, RNA, Nucleotiden, viralen Antigenen und Kohlenhydraten.
Die erfindungsgemäß hergestellten magnetischen Teilchen können auch für die Affinitätsreinigung, Zelltrennung, Enzymimmobilisierung und andere biomedizinische Anwendungszwecke eingesetzt werden. Bei der Zelltrennung werden die magnetischen Teilchen entweder zur Entfernung von unerwünschten Zellen (negative Auswahl) oder zur Anreicherung von gewünschten Zellen (positive Auswahl) durch immunologische oder nicht-immunologische Reaktionen eingesetzt. Dieses Prinzip kann zur Entfernung von Krebszellen aus Knochenmark (Knochenmarkreinigung), Reinigung von Zellpopulationen durch positive oder negative Auswahl für Gewebekulturen oder zur Durchführung von verschiedenen zellulären Immunoassays und dgl. eingesetzt werden. Bei der Affinitäts­ reinigung werden die magnetischen Teilchen anstelle einer herkömmlichen festen Phase, wie Polyacrylamidgel, Sepharosegel und andere Celluloseperlen, eingesetzt, um eine Vielzahl von biologischen Materialien, wie Antikörper, Antigene, Enzyme, Inhibitoren, Kofaktoren, einzelsträngige DNA, bindende Proteine, Haptene und Kohlenhydrate und dgl., zu reinigen. Bei einem anderen Anwendungszweck, der der Affinitätsreinigung ähnlich ist, lassen sich die magnetischen Teilchen zur Kreuzadsorption und Entfernung von unerwünschten Proteinbestandteilen aus Antiseren oder klinischen Proben verwenden. Bei der Enzym­ immobilisierung wird das Enzym an den magnetischen Teilchen durch verschiedene Kupplungsmittel immobilisiert, um die Enzym­ aktivität zu erhalten und die Wiederverwendung des immobilisierten Enzyms zu gestatten. Die magnetischen Teilchen mit dem immobilisierten Enzym können anstelle von anderen festen Phasen, wie Glasperlen, Glas von kontrollierter Porosität, Kieselgel und Celluloseperlen und dgl., deren man sich üblicher­ weise in immobilisierten Enzymsystemen bedient, eingesetzt werden, um eine Vielzahl von Materialien, wie Kohlenhydrate, Aminosäuren, Proteine und dgl., herzustellen.
Die erfindungsgemäß hergestellten magnetischen Teilchen können für industrielle Anwendungszwecke verwendet werden, z. B. zur Behandlung von industriellen Abfallprodukten zur Entfernung von schädlichen Chemikalien, z. B. organischen oder anorganischen Lösungsmitteln aus industriellen Abwässern.
Alle diese Anwendungszwecke werden durch die Leichtigkeit der Trennung, rasche Reaktionsgeschwindigkeit und große Oberfläche, die bei den meisten magnetischen Teilchen gegeben sind, begünstigt.
Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.
Allgemeines Verfahren zur Herstellung von Metalloxiden Beispiel 1
In einem Dreihals-Rundkolben, der mit einem mechanischen Rührer, einem Kühler, einem Thermometer, einem Tropftrichter und einem Heizmantel ausgerüstet ist, wird ein Gemisch mit einem Gehalt an 0,361 Mol Eisen(II)-sulfat und 0,369 Mol Eisen(III)- sulfat (Fe++/Fe+++-Verhältnis = 1) in 400 ml entionisiertem Wasser vorgelegt. Das Gemisch wird unter Rühren auf 85 bis 90°C erwärmt und innerhalb von 90 Minuten tropfenweise mit 850 ml einer 6 n Natriumhydroxidlösung versetzt. Das Gemisch wird eine weitere Stunde bei 85 bis 90°C gerührt und sodann auf Raum­ temperatur gekühlt. Der Metalloxidniederschlag wird 10 Minuten bei 250 × g zentrifugiert. Der klare Überstand wird dekantiert, und das Pellet wird in 900 ml entionisiertem Wasser unter Einsatz eines mechanischen Rührers resuspendiert. Dieses Reinigungs­ verfahren wird 6mal oder so lange wiederholt, bis der Überstand einen fast neutralen pH-Wert aufweist. Der Überstand wird dekantiert und in 200 ml entionisiertem Wasser resuspendiert. Eine weitere Zentrifugation bei 250 × g ergibt keinerlei Pelletisierung der Metalloxidniederschläge. Der Überstand, der Metalloxidkristalle von geringerer Größe enthält, wird gewonnen, und das Pellet wird in 200 ml entionisiertem Wasser resuspendiert. Dieses Verfahren wird mindestens 3mal oder solange wiederholt, bis der Großteil des Metalloxids bei 250 × g nicht mehr pelletisiert werden kann. Das auf diese Weise erhaltene Metalloxid weist üblicherweise eine Größe von weniger als 2,0 µm auf. Die vereinigte Metalloxidsuspension wird 10 Minuten bei 100 × g zentrifugiert. Der Überstand wird gewonnen. Man erhält 800 ml einer 8,6gew.-%igen (Gew.-Vol.) magnetischen Metalloxidsuspension mit einer Größe von weniger als 0,8 µm.
Beispiel 2
Man verfährt wie in Beispiel 1, mit der Abänderung, daß 0,235 Mol Eisen(II)-sulfat, 0,297 Mol Eisen(III)-sulfat (Fe++/Fe+++-Verhältnis = 0,79) in 400 ml entionisiertem Wasser und 480 ml 6 n Natriumhydroxidlösung verwendet werden. Man erhält 2000 ml einer 2,86%igen (Gew./Vol.)-Suspension von magnetischem Metalloxid.
Beispiel 3
Man verfährt wie in Beispiel 1, mit der Abänderung, daß 0,178 Mol Eisen(II)-sulfat, 0,298 Mol Eisen(III)-sulfat (Fe++/Fe+++-Verhältnis = 0,59) in 400 ml entionisiertem Wasser und 520 ml 6 n Natriumhydroxidlösung verwendet werden. Man erhält 1500 ml einer 2,98%igen (Gew./Vol.) Suspension von magnetischem Metalloxid.
Beispiel 4
Man verfährt wie in Beispiel 1, mit der Abänderung, daß 0,15 Mol Eisen(II)-sulfat, 0,276 Mol Eisen(III)-sulfat (Fe++/ Fe+++-Verhältnis = 0,54) in 400 ml entionisiertem Wasser und 520 ml 6 n Natriumhydroxidlösung verwendet werden. Man erhält 700 ml einer 6,88%igen (Gew./Vol.) Suspension von magnetischem Metalloxid.
Beispiel 5
Man verfährt wie in Beispiel 1, mit der Abänderung, daß 0,116 Mol Mangansulfat, 0,146 Mol Eisen(III)-sulfat (Mn++/ Fe+++-Verhältnis = 0,79) in 225 ml entionisiertem Wasser und 240 ml 6 n Natriumhydroxidlösung verwendet werden. Man erhält 1700 ml einer 1,8%igen (Gew./Vol.) Suspension von magnetischem Metalloxid.
Herstellung von magnetischen Teilchen Beispiel 6
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 600 ml entionisiertem Wasser, 6 ml Styrol und 80 ml von 8,6%igem (Gew./Vol.) magnetischem Metalloxid gemäß Beispiel 1 wird in ein verschlossenes Gefäß gegeben. Das Gefäß wird evakuiert und 1 Stunde mit etwa 60 U/min in einem Trockenschrank bei 55°C rotiert. Sodann wird das Gemisch mit 12 g Kaliumpersulfat und 850 ml von 5%igem (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 4,0 µm versetzt. Das Gefäß wird erneut verschlossen, evakuiert und 1 Stunde rotiert, und sodann mit 50 ml 2% Natriumdodecylsulfat versetzt. Nach fünf weiteren Stunden wird das Gemisch mit 6 ml Styrol und 10 g Kaliumpersulfat versetzt. Das Gemisch wird weitere 15 Stunden rotiert, durch 2 Schichten eines für die Käseherstellung verwendeten Tuchs filtriert, magnetisch abgetrennt und mehrmals mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar ist. Die erhaltenen magnetischen Teilchen werden in 1,6 Liter entionisiertem Wasser resuspendiert. Man erhält eine 2,5%ige (Gew./Vol.) Suspension mit einem Gehalt an etwa 11% magnetischem Metalloxid und einer durchschnittlichen Größe von 4,3 µm.
Beispiel 7
Die gemäß Beispiel 6 hergestellten magnetischen Teilchen (1,6 Liter einer 2,5%igen (Gew./Vol.) Suspension) werden durch Zugabe von 1 g Natriumdodecylsulfat, 10 g Kaliumpersulfat und einer Lösung mit einem Gehalt an 0,98 ml Undecylensäure und 0,02 ml Divinylbenzol in 4 ml Methanol carboxyliert. Das Gemisch wird in ein verschlossenes Gefäß gegeben, evakuiert und 5 Stunden mit 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C rotiert. Die erhaltenen carboxylierten magnetischen Teilchen werden magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die carboxylierten magnetischen Teilchen werden in 680 ml entionisiertem Wasser resuspendiert. Man erhält eine 5,8%ige (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von etwa 11% und einer durchschnittlichen Größe von 4,3 µm.
Beispiel 8
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 600 ml entionisiertem Wasser, 6 ml Styrol und 80 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten, 8,6%igen (Gew./Vol.) Suspension von magnetischem Metalloxid wird in ein verschlossenes Gefäß gegeben. Das Gefäß wird 1 Stunde bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C evakuiert. Sodann wird das Gemisch mit 12 g Kaliumpersulfat und 850 ml von 4,78% (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 6,1 µm versetzt. Das Gefäß wird erneut verschlossen, evakuiert, 5 Stunden rotiert und sodann mit 6 ml Styrol und 10 g Kaliumpersulfat versetzt. Das Gemisch wird weitere 15 Stunden rotiert, durch zwei Schichten von für die Käseherstellung verwendetem Tuch filtriert, magnetisch getrennt und mehrmals mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die erhaltenen magnetischen Teilchen werden in 1,5 Liter entionisiertem Wasser resuspendiert und durch Zugabe von 1 g Natriumdodecylsulfat, 10 g Kaliumpersulfat und einer Lösung mit einem Gehalt an 0,98 ml Undecylensäure und 0,02 ml Divinylbenzol in 4 ml Methanol carboxyliert. Das Gemisch wird sodann in ein ver­ schlossenes Gefäß gegeben, evakuiert und 5 Stunden bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C rotiert. Die erhaltenen carboxylierten magnetischen Teilchen werden magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die carboxylierten magnetischen Teilchen werden sodann in 800 ml entionisiertem Wasser re­ suspendiert. Man erhält eine 4,3%igen Suspension mit einem Metall­ oxidgehalt von etwa 11,6% und einer durchschnittlichen Größe von 6,8 µm.
Beispiel 9
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 600 ml entionisiertem Wasser, 6 ml Styrol und 60 ml 8,6%igem (Gew./Vol.) magnetischem Metall­ oxid gemäß Beispiel 1 wird in einem Dreihals-Rundkolben gegeben und 1 Stunde unter Argon bei 67°C gerührt. Sodann wird das Gemisch mit 12 g Kaliumpersulfat und 470 ml 5% (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 2,7 µm versetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 67°C gerührt und mit 30 ml 2% Natriumdodecylsulfat versetzt. Nach weiterem 5stündigem Rühren bei 67°C unter Argon wird das Gemisch mit 6 ml Styrol und 6 g Kaliumpersulfat versetzt. Anschließend wird das Gemisch 15 Stunden unter Argon bei 67°C gerührt, durch zwei Schichten von für die Käseherstellung verwendetem Tuch filtriert, magnetisch getrennt und mehrmals mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die erhaltenen magnetischen Teilchen werden in 900 ml entionisiertem Wasser resuspendiert und durch Zugabe von 0,6 g Natriumdodecylsulfat, 10 g Kaliumpersulfat und einer Lösung mit einem Gehalt an 0,598 ml Undecylensäure und 0,012 ml Divinylbenzol in 2,4 ml Methanol carboxyliert. Sodann wird das Gemisch in ein verschlossenes Gefäß gegeben, evakuiert und 5 Stunden bei 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C rotiert. Die erhaltenen carboxylierten magnetischen Teilchen werden magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die carboxylierten magnetischen Teilchen werden zu 500 ml resuspendiert. Man erhält eine 6,5%ige (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von etwa 14% und einer durchschnittlichen Größe von 4,0 µm.
Beispiel 10
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 600 ml entionisiertem Wasser, 6 ml Styrol und 60 ml gemäß Beispiel 1 hergestelltem 8,6%igem (Gew./Vol.) magnetischem Metalloxid wird in ein verschlossenes Gefäß gegeben. Das Gefäß wird evakuiert und 1 Stunde bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C evakuiert. Sodann wird das Gemisch mit 12 g Kaliumpersulfat und 470 ml 5% (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 2,7 µm versetzt. Das Gefäß wird erneut verschlossen, evakuiert und 1 Stunde rotiert. Sodann werden 30 ml 2% Natriumdodecylsulfat zugesetzt. Nach 5 weiteren Stunden wird das Gemisch mit 6 ml Styrol und 10 g Kalium­ persulfat versetzt. Anschließend wird das Gemisch weitere 15 Stunden rotiert, durch zwei Schichten von für die Käse­ herstellung verwendetem Tuch filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Über­ stand klar wird. Die erhaltenen magnetischen Teilchen werden in 500 ml entionisiertem Wasser resuspendiert. Man erhält ein 6,8gew.-%ige (Gew./Vol.) Suspension mit einem Gehalt an etwa 14% magnetischem Metalloxid von 4,0 µm durchschnittlicher Größe.
Beispiel 11
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 180 ml entionisiertem Wasser, 2 ml Styrol und 20 ml gemäß Beispiel 1 hergestelltem 8,6%igem (Gew./Vol.) magnetischem Metalloxid werden in ein verschlossenes Gefäß gegeben. Das Gefäß wird evakuiert und 1 Stunde bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C rotiert. Sodann wird das Gemisch mit 4 g Kaliumpersulfat und 160 ml gemäß Beispiel 10 hergestelltem 6,8% (Gew./Vol.) magnetischen Teilchen (3,0 µm, Metalloxidgehalt 14%) versetzt. Das Gefäß wird erneut verschlossen, evakuiert und 1 Stunde rotiert und sodann mit 10 ml 2% Natriumdodecylsulfat versetzt. Nach 5 weiteren Stunden werden 2 ml Styrol und 2 g Kaliumpersulfat zum Gemisch gegeben. Das Gemisch wird weitere 15 Stunden rotiert, durch 2 Schichten von für die Käseherstellung verwendetem Tuch filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die erhaltenen magnetischen Teilchen werden in 160 ml entionisiertem Wasser resuspendiert. Man erhält eine 7,78%ige (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von etwa 19% von 4,2 µm durchschnittlicher Größe.
Beispiel 12
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 90 ml entionisiertem Wasser, 1 ml Styrol und 10 ml 8,6% (Gew./Vol.) gemäß Beispiel 1 herge­ stelltem magnetischem Metalloxid wird in ein verschlossenes Gefäß gegeben. Das Gefäß wird evakuiert und 1 Stunde bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C rotiert. Sodann wird das Gemisch mit 1 g Kaliumpersulfat und 80 ml gemäß Beispiel 11 hergestellten 7,78% (Gew./Vol.) magnetischen Teilchen (3,2 µm, Metalloxidgehalt 19%) versetzt. Das Gefäß wird erneut ver­ schlossen, evakuiert und 1 Stunde rotiert und sodann mit 5 ml 2% Natriumdodecylsulfat versetzt. Nach 5 weiteren Stunden wird das Gemisch mit 1 ml Styrol und 1 g Kaliumpersulfat versetzt. Sodann wird das Gemisch weitere 15 Stunden rotiert, durch 2 Schichten von für die Käseherstellung verwendetem Tuch filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die erhaltenen magnetischen Teilchen werden in 160 ml entionisiertem Wasser resuspendiert. Man erhält eine 4,5%ige (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von etwa 23% und einer durch­ schnittlichen Größe von 4,5 µm.
Beispiel 13
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 400 ml entionisiertem Wasser, 1,92 ml Styrol, 0,08 ml Divinylbenzol, 4 g Kaliumpersulfat, 20 g 200-400 mesh 4% divinylbenzol-vernetzten Polystyrol­ kügelchen und 10 ml 8,6% (Gew./Vol.) gemäß Beispiel 1 herge­ stelltem magnetischem Metalloxid wird in ein verschlossenes Gefäß gegeben. Das Gefäß wird evakuiert und 15 Minuten bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C rotiert. Man läßt das Gemisch absetzen. Der Überstand wird dekantiert. Die er­ haltenen magnetischen Kügelchen werden in 200 ml entionisiertem Wasser resuspendiert und erneut zum Absetzen gebracht. Dieses Verfahren wird mehrfach wiederholt, bis der Überstand klar wird. Die erhaltenen magnetischen Kügelchen werden in 200 ml entionisiertem Wasser resuspendiert und mit 0,1 g Natriumdodecylsulfat, 2,0 g Kaliumpersulfat, 0,48 ml Styrol und 0,02 ml Divinylbenzol versetzt. Das Gefäß wird verschlossen, evakuiert, und 1 Stunde bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C rotiert. Sodann wird eine Lösung mit einem Gehalt an 0,098 ml Undecylensäure und 0,002 mlDivinylbenzol in 0,4 ml Methanol zugesetzt. Das Gemisch wird weitere 4 Stunden rotiert und auf die vorstehend beschriebene Weise durch Gravitations­ sedimentation gereinigt. Das Wasser wird durch Filtration entfernt. Die carboxylierten magnetischen Kügelchen werden getrocknet. Man erhält 20 g 200-400 mesh carboxylierte magnetische Kügelchen.
Beispiel 14
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 100 ml entionisiertem Wasser, 0,5 ml Styrol, 2 g Kaliumpersulfat, 75 ml 5% (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 4,0 µm und 10 ml gemäß Beispiel 4 hergestelltem 6,88% (Gew./Vol.) magnetischem Metalloxid wird in ein verschlossenes Gefäß gegeben. Das Gefäß wird evakuiert und 15 Stunden bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C rotiert. Das Gemisch wird durch zwei Schichten von für die Käseherstellung verwendetem Tuch filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die erhaltenen magnetischen Teilchen werden in 150 ml entionisiertem Wasser resuspendiert. Man erhält eine 2,5% (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von etwa 14% und einer durchschnittlichen Größe von 4,3 µm.
Beispiel 15
Man verfährt wie in Beispiel 14, mit der Abänderung, daß 20 ml von gemäß Beispiel 4 hergestelltem 6,88% (Gew./Vol.) magnetischem Metalloxid verwendet werden. Man erhält 160 ml einer 2,5% (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von etwa 18% und einer durchschnittlichen Größe von 4,3 µm.
Beispiel 16
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 2000 ml entionisiertem Wasser, 13 ml Styrol und 550 ml (2,98% Gew./Vol.) gemäß Beispiel 3 hergestelltem magnetischen Metalloxid wird in ein verschlossenes Gefäß gegeben. Das Gefäß wird evakuiert und 1 Stunde bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C evakuiert. Das Gemisch wird sodann mit 20 g Kaliumpersulfat und 950 ml 10% (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 3,0 µm versetzt. Das Gefäß wird erneut verschlossen, evakuiert und 1 Stunde rotiert. Sodann werden 60 ml 2% Natriumdodecylsulfat zugegeben. Nach 5 weiteren Stunden wird das Gemisch mit 8 ml Styrol und 10 g Kaliumpersulfat versetzt. Anschließend wird das Gemisch weitere 15 Stunden rotiert, durch zwei Schichten von für die Käse­ herstellung verwendetem Tuch filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die erhaltenen magnetischen Teilchen werden den in 3000 ml entionisiertem Wasser resuspendiert. Man erhält eine 3,38% (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von etwa 12% und einer durchschnittlichen Größe von 3,2 µm.
Beispiel 17
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 150 ml gemäß Beispiel 16 hergestellten magnetischen Teilchen (3,2 µm, 3,38% (Gew./Vol.) mit einem Metalloxidgehalt von 12%), 2 ml 1% NP 40, 0,5 ml Methylmethacrylat oder Styrol, 1 g Kaliumpersulfat und 2 ml an funktionalisiertem Monomeren, Trimethylammoniummethyl- methacrylat-methosulfat (40% wäßrige Lösung) wird in ein ver­ schlossenes Gefäß gegeben. Das Gefäß wird 4 Stunden bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C rotiert. Sodann wird das Gemisch durch zwei Schichten von für die Käseherstellung verwendetem Tuch filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die erhaltenen magnetischen Teilchen werden in 200 ml entionisiertem Wasser resuspendiert. Man erhält eine 2,5% (Gew./Vol.) Suspension von magnetischen Teilchen mit funktionellen Trimethylammoniumgruppen an der Oberfläche.
Beispiel 18
Man verfährt wie in Beispiel 17, mit der Abänderung, daß 1 ml des funktionalisierten Monomeren 2-Aminoethylmethacrylat verwendet werden. Man erhält 200 ml einer 2,5% (Gew./Vol.) Suspension von magnetischen Teilchen mit Aminogruppen an der Oberfläche.
Beispiel 19
Man verfährt wie in Beispiel 17, mit der Abänderung, daß 1 ml des funktionalisierten Monomeren 2-Hydroxyethylmethacrylat verwendet werden. Man erhält 200 ml einer 2,5% (Gew./Vol.) Suspension von magnetischen Teilchen mit Hydroxylgruppen an der Oberfläche.
Beispiel 20
Man verfährt wie in Beispiel 17, mit der Abänderung, daß 1 ml des Monomeren 1-Vinyl-2-pyrrolidinon verwendet werden. Man erhält 200 ml einer 2,5% (Gew./Vol.) Suspension von magnetischen Teilchen mit Polyvinylpyrrolidon an der Oberfläche.
Beispiel 21
Man verfährt wie in Beispiel 17, mit der Abänderung, daß 1 g des funktionalisierten Monomeren Methylpropensulfonsäure verwendet werden. Man erhält 200 ml einer 2,5% (Gew./Vol.) Suspension von magnetischen Teilchen mit Sulfonsäuregruppen an der Oberfläche.
Beispiel 22
Man verfährt wie in Beispiel 17, mit der Abänderung, daß 1 ml des funktionalisierten Monomeren Dimethylaminoethylmethacrylat verwendet werden. Man erhält 200 ml einer 2,5% (Gew./Vol.) Suspension von magnetischen Teilchen mit Dimethylaminogruppen an der Oberfläche.
Beispiel 23
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 20 ml von 7,0% (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 2,11 µm, 100 ml gemäß Beispiel 5 her­ gestelltem 1,8%igem (Gew./Vol.) Metalloxid, 50 ml entionisiertem Wasser und einer Lösung mit einem Gehalt an 0,15 g Benzoylperoxid in 7,5 ml Styrol wird in ein verschlossenes Gefäß gegeben. Das Gefäß wird evakuiert und 15 Stunden bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C rotiert. Sodann wird das Gemisch durch zwei Lagen eines für die Käseherstellung verwendeten Tuchs filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die erhaltenen magnetischen Teilchen werden mit entionisiertem Wasser auf 200 ml resuspendiert. Man erhält eine 5,0% (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von etwa 16,8% und einer durchschnittlichen Größe von 3,6 µm.
Beispiel 24
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 20 ml von 7,0% (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 2,11 µm, 100 ml gemäß Beispiel 5 herge­ stelltem 1,8% (Gew./Vol.) Metalloxid, 50 ml entionisiertem Wasser und einer Lösung mit einem Gehalt an 0,15 g Benzoylperoxid und 0,75 ml Divinylbenzol in 6,75 ml Styrol wird in ein verschlossenes Gefäß gegeben. Das Gefäß wird evakuiert und 15 Stunden bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C rotiert. Sodann wird das Gemisch durch zwei Lagen von für die Käseherstellung verwendetem Tuch filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die erhaltenen vernetzten magnetischen Teilchen werden mit entionisiertem Wasser auf 200 ml resuspendiert. Man erhält eine 5,0% (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von etwa 16,8% und einer durchschnittlichen Größe von 3,6 µm. Die auf diese Weise hergestellten vernetzten magnetischen Teilchen zeigen eine gleichmäßige Größe und erweisen sich gegenüber herkömmlichen organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Acetonitril und Dimethylformamid, als inert.
Beispiel 25
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 20 ml 7,0% (Gew./Vol.) Poly­ styrolteilchen von 2,11 µm, 150 ml gemäß Beispiel 5 hergestelltem 1,8% (Gew./Vol.) Metalloxid und einer Lösung mit einem Gehalt an 0,15 g Benzoylperoxid und 0,75 ml Divinylbenzol in 6,75 ml Styrol wird in ein verschlossenes Gefäß gegeben. Das Gefäß wird evakuiert und 15 Stunden bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C rotiert. Das Gemisch wird durch zwei Lagen von für die Käseherstellung verwendetem Tuch filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die erhaltenen vernetzten magnetischen Teilchen werden mit entionisiertem Wasser auf 200 ml resuspendiert. Man erhält eine 5,4% (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von etwa 23% und einer durchschnittlichen Größe von 4,0 µm. Die auf diese Weise hergestellten vernetzten magnetischen Teilchen weisen eine gleich­ mäßige Größe auf und erweisen sich gegenüber herkömmlichen organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Acetonitril und Dimethylformamid als inert.
Beispiel 26
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 15 ml von 9,16% (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 3,2 µm, 100 ml von gemäß Beispiel 5 hergestelltem 1,8% (Gew./Vol.) Metalloxid, 55 ml entionisiertem Wasser und einer Lösung mit einem Gehalt an 0,15 g Benzoylperoxid und 0,75 ml Divinylbenzol in 6,75 ml Styrol wird in ein verschlossenes Gefäß gegeben. Das Gefäß wird evakuiert und 15 Stunden bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C evakuiert. Das Gemisch wird durch zwei Lagen von für die Käseherstellung verwendetem Tuch filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die erhaltenen vernetzten magnetischen Teilchen werden mit entionisiertem Wasser auf 200 ml resuspendiert. Man erhält eine 4,7% (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxidgehalt von etwa 16,8% und einer durchschnittlichen Größe von 5,5 µm. Die auf diese Weise hergestellten vernetzten magnetischen Teilen weisen eine gleich­ mäßige Größe auf und erweisen sich gegenüber üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Acetonitril und Dimethylformamid, als inert.
Beispiel 27
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 30 ml von 4,5% (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 4,1 µm, 100 ml von gemäß Beispiel 5 hergestelltem 1,8% (Gew./Vol.) Metalloxid, 40 ml entionisiertem Wasser und einer Lösung mit einem Gehalt an 0,15 g Benzoyl­ peroxid und 0,75 ml Divinylbenzol in 6,75 ml Styrol wird in ein verschlossenes Gefäß gegeben. Das Gefäß wird evakuiert und 15 Stunden bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C rotiert. Das Gemisch wird durch zwei Lagen von für die Käse­ herstellung verwendetem Tuch filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die erhaltenen vernetzten magnetischen Teilchen werden mit entionisiertem Wasser auf 200 ml resuspendiert. Man erhält eine 4,5% (Gew./Vol.) Suspension mit einem Metalloxid­ gehalt von etwa 16,9% und einer durchschnittlichen Größe von 6,7 µm. Die auf diese Weise hergestellten vernetzten magnetischen Teilchen zeigen eine gleichmäßige Größe und erweisen sich gegenüber üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Acetonitril und Dimethylformamid, als inert.
Beispiel 28
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 20 ml von 7,0% (Gew./Vol.) Polystyrolteilchen von 2,11 µm, 100 ml von gemäß Beispiel 5 hergestelltem 1,8% (Gew./Vol.) Metalloxid, 50 ml entionisiertem Wasser und einer Lösung mit einem Gehalt an 0,15 g Benzoylperoxid, 0,75 ml Undecylenylalkohol und 0,75 ml Divinylbenzol in 6 ml Styrol wird in ein verschlossenes Gefäß gegeben. Das Gefäß wird evakuiert und 15 Stunden bei etwa 60 U/min in einem Trockenschrank von 55°C evakuiert. Sodann wird das Gemisch durch zwei Lagen von für die Käseherstellung verwendetem Tuch filtriert, magnetisch getrennt und mehrfach mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der Überstand klar wird. Die erhaltenen vernetzten hydroxylgruppenhaltigen magnetischen Teilchen werden filtriert und getrocknet. Man erhält 9 g Pulver mit einem Metalloxidgehalt von etwa 16,8% und einer durchschnittlichen Größe von 3,9 µm. Die auf diese Weise hergestellten vernetzten hydroxylgruppenhaltigen magnetischen Teilchen zeigen eine gleichmäßige Größe und erweisen sich gegenüber üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Acetonitril und Dimethylformamid als inert.
Kopplung von biologischen Materialien an magnetische Teilchen Beispiel 29
In einem 80 ml fassenden Gefäß werden 30 ml von gemäß Beispiel 7 hergestellten 5,0% (Gew./Vol.) carboxylierten magnetischen Teilchen von 4,3 µm vorgelegt. Die Teilchen werden magnetisch getrennt und in 50 ml Phosphatpuffer (0,1 m vom pH-Wert 5,5) resuspendiert. Die Teilchensuspension wird mit 20 mg Rinderserumalbumin und 100 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid (EDC) versetzt. Das Gemisch wird insgesamt 2 Stunden bei Raumtemperatur rotiert und magnetisch getrennt.
Die Teilchen werden einmal mit 80 ml Phosphatpuffer gewaschen und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,1 m vom pH-Wert 7,0) auf ein Volumen von 75 ml resuspendiert. Man erhält eine 2,0% (Gew./Vol.) Suspension.
Zur Kopplung von Rinderserumalbumin an magnetische Teilchen durch passive Adsorption bedient man sich der gleichen Verfahrens­ weise, mit der Abänderung, daß kein EDC verwendet wird.
Beispiel 30
In ein 4 ml fassendes Fläschchen wird 1 ml von gemäß Beispiel 7 hergestellten 5,0% (Gew./Vol.) carboxylierten magnetischen Teilchen von 4,3 µm gegeben. Die Teilchen werden magnetisch getrennt und einmal mit 2 ml Phosphatpuffer (0,1 m vom pH-Wert 5,5) gewaschen und mit 2 ml des gleichen Puffers resuspendiert. Die Teilchensuspension wird mit 140 ml 1,4 mg/ml Ziegen-anti-Maus-IgG und 10 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid versetzt. Das Fläschchen wird insgesamt 2 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Die Teilchen werden magnetisch abgetrennt, einmal mit 2 ml Phosphatpuffer gewaschen und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,1 m vom pH-Wert 7,0) auf 2 ml resuspendiert. Man erhält 2,5% (Gew./Vol.) magnetische Teilchen, die mit Ziegen-anti-Maus-IgG beschichtet sind. Weitere Arten von Antikörpern und zwar entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper lassen sich unter Anwendung der gleichen Verfahren an carboxylierte magnetische Teilchen koppeln.
Zur Kopplung von Ziegen-anti-Maus-IgG oder anderen Antikörpern an magnetische Teilchen durch passive Adsorption bedient man sich der gleichen Verfahrensweise, mit der Abänderung, daß kein EDC verwendet wird.
Beispiel 31
In ein 4 ml fassendes Fläschchen werden 2,5 ml gemäß Beispiel 29 hergestellte, mit Rinderserumalbumin beschichtete magnetische Teilchen (4,3 µm, 2% (Gew./Vol.)) gegeben. Die Teilchen werden magnetisch abgetrennt und mit Phosphatpuffer (0,1 m vom pH-Wert 5,5) auf ein Volumen von 2 ml resuspendiert. Das Gemisch wird mit 10 µl Mäuse-anti-B-roten Blutkörperchen-Oberflächenantigen (20 mg/ml) und 1 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid versetzt. Das Gemisch wird insgesamt 2 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Die Teilchen werden magnetisch getrennt, einmal mit Phosphatpuffer gewaschen und mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (0,1 m vom pH-Wert 7,0) auf ein Volumen von 2 ml resuspendiert. Man erhält eine 2,5% (Gew./Vol.) Suspension.
Beispiel 32
Man verfährt wie in Beispiel 31, mit der Abänderung, daß man 40 µl Mäuse-anti A-rote Blutkörperchen-Oberflächenantigen (5 mg/ml) verwendet. Man erhält 2 ml einer 2,5% (Gew./Vol.) Suspension.
Blutgruppenbestimmung unter Verwendung von magnetischen Teilchen Beispiel 33
In einem mit A bezeichneten Teströhrchen der Abmessungen 5 mm × 65 mm werden 25 µl von 2,5% (Gew./Vol.) mit Mäuse-anti A beschichtete magnetische Teilchen, die gemäß Beispiel 32 hergestellt worden sind, gegeben. In ein weiteres, mit B bezeichnetes Teströhrchen werden 25 µl von gemäß Beispiel 31 hergestellten 2,5% (Gew./Vol.) Mäuse-anti B beschichteten magnetischen Teilchen gegeben. Beide Teströhrchen werden mit 50 µl von 1% gepackten roten Blutkörperchen, die durch 1- bis 100fache Verdünnung von gepackten roten Blutkörperchen in isoton gepufferter Kochsalzlösung hergestellt worden sind, versetzt. Die Teströhrchen werden durch leichtes Anklopfen mit dem Finger mehrfach geschüttelt und auf die Spitze eines Magneten gestellt. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengestellt:
Das "+"-Zeichen bedeutet eine positive Reaktion, d. h., daß die roten Blutkörperchen durch die mit dem entsprechenden Antikörper beschichteten magnetischen Teilchen agglutiniert werden, so daß der Überstand im Teströhrchen nach der magnetischen Abtrennung klar ist. Dagegen bleibt bei einer negativen Reaktion der Überstand nach der magnetischen Abtrennung trüb, was auf die fehlende Agglutination zwischen den roten Blutkörperchen und den mit Antikörper beschichteten magnetischen Teilchen zurückzuführen ist.
Immunoassays unter Verwendung von magnetischen Teilchen Beispiel 34
In ein 2 ml fassendes Mikrozentrifugenröhrchen werden 1 ml von 6% (Gew./Vol.) carboxylierten magnetischen Teilchen von 3 µm gegeben. Die Teilchen werden 3 Minuten bei 10 000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt, und die Teilchen werden durch heftiges Schütteln mit 1 ml von 5 bis 100 µg/ml rekombinantem HBcAg in Acetatpuffer resuspendiert. Die Röhrchen werden 2 Stunden bei Raumtemperatur rotiert und auf die vorstehend beschriebene Weise zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt, und die Teilchen werden in 1 ml einer Beschichtungslösung mit einem Gehalt an Acetatpuffer und 2 bis 10% normalem Tierserum resuspendiert. Das Röhrchen wird 2 bis 16 Stunden bei Raumtemperatur rotiert und auf die vorstehend beschriebene Weise zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und die Teilchen werden dreimal mit 1 ml isoton gepufferter Kochsalzlösung (IBS) durch Zentrifugieren und Resuspendieren gewaschen. Schließlich werden die Teilchen mit 1 ml IBS resuspendiert und bei 2 bis 8°C gelagert.
Beispiel 35
In die ersten beiden Spalten einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen werden 20 µl von gemäß Beispiel 34 hergestellten 0,25% (Gew./Vol.) Hepatitis B-Kernantigen (HBcAg) beschichteten magnetischen Teilchen gegeben. Die Probenherstellung besteht in der Bereitstellung von verschiedenen Verdünnungen von HBcAb-positivem Serum in einem negativen Plasma, gefolgt von einer 1 : 100-Verdünnung der einzelnen Proben in einem Proben­ verdünnungspuffer (SDB). Der Probenverdünnungspuffer enthält Phosphatpuffer, Proteinstabilisatoren, Detergentien und anti­ mikrobielle Mittel. Die die Teilchen enthaltenden Vertiefungen werden jeweils mit 50 ml der einzelnen endgültigen Proben­ verdünnungen versetzt. Nach 30minütiger Inkubation bei 37°C werden die Teilchen 2 Minuten auf einem Magnetseparator abge­ trennt und 3mal mit 200 µl Waschpuffer mit einem Gehalt an Salzen und Detergens gewaschen. Die die Teilchen enthaltenden Vertiefungen werden jeweils mit 50 µl Ziegen-antihuman-IgG-β- D-Galactosidase-Konjugat (0,5 µg/ml) in einem Verdünnungsmittel mit einem Gehalt an Salzen, Proteinstabilisatoren, Glycerin, Detergens und antimikrobiellen Mitteln versetzt. Nach 15minütiger Inkubation bei 37°C werden die Teilchen abgetrennt und dreimal auf die vorstehend beschriebene Weise gewaschen und in 30 µl IBS resuspendiert. Sodann werden die Teilchen auf die ersten beiden Spalten einer schwarzen Mikrotiterplatte (Dynatech) übertragen. Die die Teilchen enthaltenden Vertiefungen werden jeweils mit 100 µl einer Lösung mit einem Gehalt an 4-Methylumbelliferyl-B-galactopyranosid (MUG, Sigma) versetzt. Die Platte wird bei 37°C inkubiert. Eine Messung der Fluoereszenz­ intensität unter Verwendung eines Fluoreszenzkonzentrations­ analysengeräts (FCA, Pandex), das mit 365-nm-Anregung und 450-nm-Emmisionsfiltern versehen ist, wird in Abständen von 5 Minuten und bei einer 10fachen Verstärkereinstellung durchgeführt. Die Zunahme der Fluoreszenzintensität in einem Abstand von 5 Minuten wird in Form von willkürlichen Fluoreszenzeinheiten (AFU) aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.
Verdünnung der positiven Probe
AFU (5 Min.) (Mittelwert von zwei Vertiefungen)
1 : 100
22 687
1 : 1000 5933
1 : 5000 1516
1 : 8000 835
1 : 10 000 639
1 : 15 000 495
1 : 20 000 427
1 : 25 000 307
Beispiel 36
Die Kopplung von Mäuse-anti-HBsAg an carboxylierte magnetische Teilchen erfolgt ähnlich wie in Beispiel 30.
Die Vertiefungen einer schwarzen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Dynatech) werden mit 20 µl von 0,25% (Gew./Vol.) mit Mäuse-anti-HBsAg beschichteten, carboxylierten magnetischen Teilchen in Doppelbestimmung versetzt. Die die magnetischen Teilchen enthaltenden Vertiefungen werden mit 100 µm reinem Plasma mit einem Gehalt an unterschiedlichen Mengen an HBsAg oder HBsAg-negativem Plasma versetzt. Nach 30minütiger Inkubation bei 37°C werden die Teilchen 2 Minuten auf einem Magnet­ separator abgetrennt und einmal mit 100 µl Waschpuffer mit einem Gehalt an Salzen und Detergens gewaschen. Diese Teilchen enthaltenden Vertiefungen werden jeweils mit 20 µl Mäuse- anti-HBsAg-β-Galaktosidase-Konjugat in einem Verdünnungsmittel mit einem Gehalt an Salzen, Proteinstabilisatoren, Glycerin, Detergens und antimikrobiellen Mitteln versetzt. Nach 15minütiger Inkubation bei 37°C werden die Teilchen getrennt und 5mal auf die vorbeschriebene Weise gewaschen. Diese Teilchen enthaltenden Vertiefungen werden jeweils mit 50 µl einer Lösung mit einem Gehalt an 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactopyranosid (MUG, Sigma) versetzt. Die Platte wird bei 37°C inkubiert. Die Fluoreszenzintensität wird unter Verwendung eines Fluoreszenz­ konzentrationsanalysengeräts (FCA, Pandex), das mit 365-nm-Anregungsfiltern und 450-nm-Emissionsfiltern ausgerüstet ist, in Abständen von 5 Minuten und bei 10facher Verstärker­ einstellung gemessen. Die Zunahme der Fluoreszenzintensität in einem Abstand von 5 Minuten wird in Form von willkürlichen Fluoreszenzeinheiten (AFU) aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.
HBsAg-Konzentration (ng)
AFU (5 Min.) Mittelwert von zwei Vertiefungen
1,0
1149
0,5 455
0,25 218
0,125 118
neg. 14
Beispiel 37
Die HIV-1-Antigene von HTLV-IIIB/H-9-Zellen (Gallo-Stamm) werden an carboxylierte magnetische Teilchen von 3,6 µm unter Anwendung ähnlicher Verfahren wie in Beispiel 34 gekoppelt.
Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen werden mit jeweils 20 µl von 0,25% (Gew./Vol.) mit HIV- beschichteten magnetischen Teilchen in Doppelbestimmung versetzt. Die die Teilchen enthaltenden Vertiefungen werden mit jeweils 50 µl an positiven Proben, Grenzfall-Proben und negativen Proben, die in Probenverdünnungspuffer (SDB) mit einem Gehalt an Phosphatpuffer, Proteinstabilisatoren, Detergens und anti­ mikrobiellen Mitteln auf 1 : 100 verdünnt sind, versetzt. Nach 30minütiger Inkubation bei 37°C werden die Teilchen 2 Minuten auf einem Magnetseparator abgetrennt und dreimal mit jeweils 100 µl Waschpuffer mit einem Gehalt an Salzen und Detergens gewaschen. Die die Teilchen enthaltenden Vertiefungen werden jeweils mit 50 ml Ziegen-antihuman-β-Galactosidase-Konjugat (etwa 0,5 µg/ml) in einem Verdünnungsmittel mit einem Gehalt an Salzen, Proteinstabilisatoren, Glycerin, Detergens und antimikrobiellen Mitteln versetzt. Nach 15minütiger Inkubation bei 37°C werden die Teilchen 4mal auf die vorstehend beschriebene Weise gewaschen. Sodann werden die Teilchen auf eine schwarze Mikrotiterplatte (Dynatech) übertragen. Die die Teilchen enthaltenden Vertiefungen werden jeweils mit 100 µl einer Lösung mit einem Gehalt an 4-Methylumbelliferryl-β-D- galactopyranosid (MUG, Sigma) versetzt. Die Platte wird bei 37°C inkubiert, und die Fluoreszenzintensität wird unter Ver­ wendung eines Fluoreszenzkonzentrationsanalysengeräts (FCA, Pandex), das mit 365-nm-Anregungsfiltern und 450-nm-Emissionsfiltern ausgerüstet ist, in Abständen von 5 Minuten und bei 25fachen Verstärkereinstellung gemessen. Der Anstieg der Fluoreszenzintensität in einem Abstand von 5 Minuten wird in Form von willkürlichen Fluoreszenzeinheiten (AFU) aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.
Anti-HIV-Proben
AFU (5 Min.) Mittelwert von zwei Vertiefungen
Positive Kontrolle
9462
Grenzfall-Probe 527
negative Kontrolle 86
Zellabtrennung unter Verwendung von magnetischen Teilchen Beispiel 38
Gemäß Beispiel 7 hergestellte carboxylierte magnetische Teilchen von 4,3 µm werden gewaschen und in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS vom pH-Wert 7,7) einer Ultraschallbehandlung unterzogen, 10 Minuten in 70% Äthanol sterilisiert, dreimal in PBS gewaschen und 48 Stunden bei 4°C mit affinitäts­ gereinigtem Schaf-anti-Maus-IgG-Antikörper (SAM) in einer Konzentration von 0,5 mg/ml und einem Verhältnis von 3,3 mg Antikörper/100 mg Teilen inkubiert. Vor der Anwendung werden die mit Antikörper beschichteten magnetischen Teilchen in PBS gewaschen und in PBS auf die gewünschte Konzentration resuspendiert.
Human-Gewebekultur-cALLa-positive-NALM-16-Leukämiezellen werden gewaschen und in PBS suspendiert. Eine Fraktion wird nicht mit Antikörper behandelt (-MoAb). Die andere Fraktion wird 30 Minuten bei 4°C mit zwei anti-CD10- und einem anti-CD9- monoklonalen Antikörpern (+MoAb) behandelt, in PBS gewaschen und in PBS auf 3,5 × 10⁶-Zellen/ml eingestellt. Zwei Röhrchen, von denen eines die mit Antikörper behandelten Zellen (+MoAb) und das andere die unbehandelten Zellen (-MoAb) enthält, werden mit mit SAM beschichteten magnetischen Teilchen mit einem Verhältnis von Teilchen zu Ausgangszellen von 45 versetzt. Die Röhrchen werden 30 Minuten bei 4°C rotiert. Die Teilchen werden mit einem Magnetseparator abgetrennt. Der Überstand wird zur Gewinnung der verbleibenden Zellen zentrifugiert. Das Pellet wird in 100 µl Trypanblau resuspendiert. Die Gesamt­ zellzahl wird festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.
Tabelle IV

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung von magnetisch reagierenden Polymerteilchen zum Binden von biologischem Material, bei dem polymere Kernteilchen in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators mit magnetisch reagierenden Metalloxidteilchen und einem Polymer überzogen werden, wobei das biologische Material mittels funktioneller Gruppen passiv adsorbiert oder kovalent gebunden werden kann, dadurch gekennzeichnet,
daß zur Herstellung der magnetisch reagierenden Metalloxidteilchen ein Gemisch von 2- und 3wertigen Übergangsmetallsalzen mit einem Molverhältnis von 0,5 bis 2,0 der 2wertigen zu den 3wertigen Metallsalzen erwärmt, gefällt, gewaschen und suspendiert wird, und
daß die suspendierten magnetisch reagierenden Metalloxidteilchen mit Monomeren vermischt werden und in Gegenwart des Polymerisationsinitiators auf die polymeren Kernteilchen aufgebracht werden, um den Überzug aus den magnetisch reagierenden Metalloxidteilchen und dem Polymer zu bilden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Gruppen sich in einer zusätzlich aufgebrachten Schicht aus einem funktionalisierten Polymer befinden.
3. Verfahren nach Anspruch1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß beim Mischen der magnetisch reagierenden Metalloxidteilchen mit den Monomeren 8-10 Gew.-% eines Vernetzungsmittels zugesetzt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomere aus Styrol, Methylmethacrylat, Vinyltoluol, Divinylbenzol und Glycidylmethacrylat ausgewählt sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Gruppen aus Carboxyl-, Amino- und Hyxdroxylgruppen ausgewählt sind.
6. Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhaltenen magnetisch reagierendenPolymerteilchen als feste Phase in Analyse- oder Reinigungsverfahren, vorzugsweise in Immunoassays, Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahren oder Affinitäts-Verfahren.
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