JPH04503865A - カルジオリピン、フォスファチジルコリン及びコレステロールを固相に固定化する方法及びイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 カルシオリビン　フォスフアナジルコ１ン　びコレステロール　に　゛　びイム ノア・・セイ１１廊と１最 １、　発明の分野 本発明は、カルシオリピン（ＣＡＲＤ）、フォスファチジルコリン（ｐｃ）及び コレステロール（ＣＩ（ＯＬ）を個々に又は組み合わせて固相に固定化する方法 並びに、梅毒患者の血清に存在する抗体等の、ヒトの血清又は血漿中のレアギン 性抗体の定量への該固相の使用に関する。

２、　先行技術 ヒト血漿又は血清中のレアギン、すなわち「抗体様」物質の存在は梅毒性疾患を 示すものである。レアギン（又はレアギン性抗体）は種々の試験法を用いて測ら れる。上記定量法はいずれもレアギンの検出にカルシオリピン抗原を使用してい る。この抗原はフォスファチジルコリンすなわちレシチン：カルシオリビン：コ レステロールの重量比２：０．３：９の混合物である。

最も一般的なものにＲＰＲ（Ｒａｐｉｄ　Ｐｌａｓｍａ　Ｒｅａｇｉｎ）カード 試験のようなカード綿状試験がある。ＲＰＲカード試験は、レアギン含有血漿に 露されると綿化する炭素粒子カルシオリピン抗原懸濁液を使用する。綿化は、カ ードの白い背景に対し黒い炭素粒子の凝集として裸眼で認められる。他の試験９ 例えばＶＤＲＬ（Ｖｅｎｅｒｅａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ ｂ）やＲ３Ｔ（レアギンスクリーンテスト）は同じ綿化原理に基づいておりカル シオリピン抗原を使用している。例えば、一つの特許、米国特許第４７３８９３ ２号は、梅毒関連抗体用の凝集反応試験を開示している。この試験は、ポリペプ チド架橋を介してラテックス粒子にイオン的に結合したカルシオリビン抗原の緩 衝化した水性懸濁液よりなる抗原試薬を用いている。綿状試験は多数の標本をス クリーニングする際には労力の集中を要し、そして結果が主観的解釈に基づいて いるという限界を有する。

多数の研究者が、カルシオリピン抗原をＥＬ　Ｉ　ＳＡタイプの操作に組み込む ことによりレアギン試験を改良せんと試みてきた。これらの酵素免疫抗体法（Ｅ ＬＩＳＡ）は学術文献に記述されており、市販のポリスチレンミクロタイター板 へのＣＡＲＤ、ＰＣ及びＣＨＯＬの吸着を伴っている。更に、レアギンＥＬＩＳ ＡはＡＤＩ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ　ｉｃｓより市販されている。これらのＥＬＩＳ Ａ法は多数の標本のスクリーニングのためにはカード試験より優れており（例え ば、より少ない労力集中）、また数値的又は半定量的結果を与える。しかしなが らそれらは、ＲＰＲ又はＶＤＲＬ試験はどには特異的でも高感度でもない（すな わち、偽の陽性結果をより多く与える）９例えば、ＡＤＩ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ ｃｓはＶＤＲＬ試験に比し特異性では９５．４％、感度では８２．２％を主張し ている。

これらのＥＬｒＳＡタイプのアッセイは、しかしながら、Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ− ４０やＴｗｅｅｎ２０のような界面活性剤の存在下では満足に働かない。ＥＩＡ 又はＥＬＩＳＡにおける界面活性剤の使用は、試薬の非特異的結合を減少させて アッセイの感度と特異性を非常に高める。これら前記のアッセイにおいては界面 活性剤が使用できない（恐ら＜ＣＡＲＤ、ＰＣ及びＣＨＯＬが固相から除去され るものと思われる）ことから、それらは余り高感度でなく特異性も余り高くない 。本発明の利点の一つは、定量性能を落とすことなく定量においてこれらの界面 活性剤を使用できることである。

主里坐皿！ 本発明によれば、受動的吸着及び／又は共有結合によってカルシオリビン、フォ スファチジルコリン及びコレステロールヲ個々に又は組合わせて固相に固定化し 、この固相をヒト血清又は血漿中のレアギン性抗体の定量に使用する方法が開示 される。加えて、ここに記載する本発明は、レアギンを半定量的に測定するアッ セイであり、自動化のために設計されておりそしてＲＰＲカード試験のように高 感度かつ特異的である。

日の量　なｉ′木　び　のノ旨 本発明は、受動的吸着若しくは共有結合又は両者の組合せにより、カルシオリビ ン、フォスファチジルコリン及びコレステロールを個々に又は組合せて固相に固 定化する方法に関する。固相は常磁性粒子、非常磁性粒子又は他のいかなる固相 でもよい。固定化は、特定のタイプの受動的吸着により又は共有結合の化学によ り行うことができる。固定化したカルシオリピン、フォスファチジルコリン及び ／又はコレステロールを含んでなる固相は、抗カルシオリビン。

抗フォスファチジルコリン及び／又は抗コレステロール抗体を検出するためのイ ムノアッセイ（すなわち梅毒の血清学的試験）に使用することができる。

カルシオリピン（ＣＡＲＤ）、　フォスファチジルコリン（ＰＣ）及び／又はコ レステロール（ＣＨＯＬ）は、ここに記述の手段で固相に結合したときは、以下 の特徴を有する。

ａ、　それら自身の抗原性を保持する。

ｂ、　イムノアッセイに通常使用される界面活性剤（例えばＮｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ −４０又はＴｗｅｅｎ　２０）の存在に抵抗し、アンセイ操作の間、少なくとも 部分的に、固相に固定化されたまま残るＣ１　梅毒用血清学的試験〔すなわち梅 毒状態を示すＣＡＲＤ、ＰＣ及び／又はＣＨＯＬに特異的な抗体（レアギン）の 存在を検出する〕又は抗ＣＡＲＤ、ＰＣ及び／又はＣＨＯＬ抗体を測定する他の 血清学的試験において使用できる。

ｄ、−２０±３°Ｃ，５±３℃、２５±３°Ｃ及び３７±１℃の温度に付しても 安定で抗原性を保持する。

本発明の他の利点は、上述の梅毒用血清学的試験が、レアギンの検出用に現在市 販されているもの（すなわちＲＰＲ又はＶＤＲＬ試験）に近似の感度及び特異性 を提供できることである。

本発明の更なる他の利点は、上述の梅毒用血清学的試験が自動化されたシステム でもマニュアルシステムでも使用できることである本発明のなおも更なる他の利 点は、凝集アッセイにおける抗原固定化粒子の使用である。このタイプのアッセ イはＲＰＲ試験に形式上類似するが、しかし陽性（レアギン反応）サンプルの存 在下において抗原固定化粒子の凝結又は凝集が観察される。粒子は、陰性サンプ ルの存在下においては凝結又は凝集することがない。

受動的吸着の化学には、米国特許出１８７／１１３２９４．７／３３７５１１． ７／３３７５１３．７／３３７２４４及び７／３３７２３４、以下Ｗａｎｇ　ａ ｎｄ　５ｈａｈ出願という（併せて示す）、の種々の官能基を有するＰａｎｄｅ χ（登録商標）常磁性粒子（直径約０．１μｍ−１００，好ましくは４．０μｍ ）を用いた。

これらの粒子上の官能基はアミノ基、ジメチルアミノ基、トリエチルアンモニウ ム基又は、ＣＡＲＤ及び／又はＰＣのリン酸エステル部分の負電荷と強く相互作 用するその他の官能基である。吸着の化学は、常磁性粒子表面上へのＣＡ　’Ｒ Ｄ及びＰＣの物理的吸着又は濃縮を用いて行った。

このようにして調製された粒子の適合性は、低濃度の界面活性剤の存在下におけ る良好なイムノアッセイ性能として測定する。粒子の適合性は使用した官能基に 依存する。トリエチルアンモニウム基を含む粒子はジメチルアミノ基又はアミノ 基を含むものより通している。カルボキシル基を含む粒子又は疎水性ポリスチレ ン粒子は、トリエチルアミノ、ジメチルアミノ及びアミノ基を含む粒子より適合 性が低い。こうして受動的吸着により、低濃度の界面活性剤の存在に半抵抗性の 特定の粒子の調製が可能である。共有結合の化学は、しかしながら、低濃度の界 面活性剤に一層抵抗力のある形態のＣＡＲＤ、ＰＣ及びＣＨＯＬの固定化を提供 する。

極性の末端基を介し及び／又は脂肪酸部分を介する以下の共有結合による結合方 法は、ＣＡＲＤ及び／又はＰＣに使用することができる。

ａ、　５ｅＯｔ酸化 す、　ＦＣＣ（塩化クロム酸ピリジニウム）酸化ｃ、ｍ−クロル過安息香酸酸化 ｄ、１．４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（オキシラン）結合 ｅ、　ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ ド〕の存在下におけるビオチン結合ｆ、　無水コハク酸結合 修飾されたＣＡＲＤ及び／又はＰＣを、必要なら結合試薬の存在下で、アミノ基 若しくはカルボキシル基を有する又はアビジンで被覆した粒子に結合させる。

上述の全ての結合方法が、抗ＣＡＲＤ、抗ＰＣ又は抗ＣＨＯＬ抗体を検出するた めにアッセイ（梅毒用血清学的試験）において使用し得る粒子を与える。しかし ながら、ＳｅＯ□とＦＣＣ，又はＳｅＯ□とＥＤＣ化学の組合せが、ＣＡＲＤ及 びＰＣについては最も性能がよい。試験の感度と特異性を高めるために、ＣＡＲ Ｄ及びＰＣとともにコレステロールが組み込まれる。これらの修飾は試験の性能 を非常に改善することが認められた。共有結合に用いるＣＡＲＤ、ＰＣ及びＣＨ ＯＬの比率（重量）は夫々０．０１〜１．０．０１〜３及び０．１〜１０の範囲 であるが、最良のアッセイは比率０゜１．０．３及び８を用いることにより得ら れる。

ＣＡＲＤ、ＰＣ及び／又はＣＨＯＬを固定化する技術は種々の固相に通用するこ とができる。これらの固相には、常磁性粒子、非常磁性粒子又はミクロタイター 板が含まれるが、これらに限定されるわけではない。

１施■ ■、　固相へのＣＡＲＤ及びＰＣの受動的吸着６２５μＥのトリメチルアンモニ ウム官能基を有する常磁性粒子（４％ｗ　／　ｖ　、約４μｍ、Ｗａｎｇ　ａｎ ｄ　５ｈａｈ出＠）を磁気分離機により分離し、透明な上澄を吸引除去する。残 った粒子に２１ｄのＣＡＲＤ　（Ｒｏａｃｈ　Ｌａｂｓ、ジョーシア州ローガン ビル；５■、エタノール中２．５１ｇ／ＩＮ）、２３８ｕｊｌ！のＰＣ（Ｒ。

ａｃｈ　Ｌａｂｓ；１５ｍｇ、エタノール中６３＋ａｇ／ｄ）、５ｄのＮｏｎ１ ｄｅｔ−Ｐ２Ｏ（ＮＰ−４０）を加えた。この粒子懸濁液にアルゴンを通じて乾 燥させた。受動的吸着をさせた粒子を脱イオン水で洗浄し、磁気分層又は遠心に より上澄が透明になるまで分離した。最後に、粒子を、ナトリウムアジド０．１ ％を含むｐＨ６，５の０．０１Ｍ酢酸緩衝液５４に再懸濁させて粒子濃度０．５ ％Ｗ／Ｖとした。

２、　固相へのＣＡＲＤ及びＰＣ抗原の共有結合による結合６ｄのＣＡＲＤ　（ １５■）及び６８２μ２のＰＣ（４５■）を蒸発乾固した。残渣に４ｍのジクロ ルメタン及び１３５■のＳｅＯ□を加えた。反応混合物を室温下４〜６時間ゆす った。その間、３〇−のアミン官能基を有する架橋常磁性粒子（４，０％ｗ　／ 　ｖ　、約４μｍ；Ｗａｎｇ　ａｎｄ　５ｈａｈ出Ｗｉ）を無水エタノールで５ 分間かけて１回洗浄し、次いで無水ジメチルホルムアミド中で３回洗浄した。残 った粒子に、３０ｄのジメチルホルムアミドに溶解した１、２ｇのクロル蟻酸コ レステリルを加え、次いで３−のトリエチルアミンを加えた。４〜６時間ゆすっ た後、粒子を磁気分離機で分離し、未反応のクロル蟻酸コレステリルを上澄を吸 引することにより取り除いた。

ＣＡＲＤとＰＣの溶液をＯ，工ｕｍのＴｅｆｌｏｎ（登録商標）濾過膜を通して 濾過し、減圧乾燥した。残渣を３０−の無水ジメチルホルムアミドに再溶解した 。このＣＡＲＤ及びＰＣの溶液をクロル蟻酸コレステリル処理残渣粒子に加え、 次いで１．０５ｇのＥＤＣ及び３−のトリエチルアミンを加えた。この反応混合 物を約１６時間室温にてゆすり、次いで５３０■のＥＤＣ及びＰＨ６，０の０． ０５Ｍ　ＭＥＳ　（４−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液１８．０戚を加え た。６時間ゆすった後、２５０■の水素化ホウ素ナトリウムを加え、更に１時間 ゆすった。被覆された粒子を脱イオン水で洗浄し、磁気分離又は遠心により上澄 が透明になるまで分離した。最後に、ナトリウムアジド０．１％ｗ　／　ｖを含 むｐＨ６，５の０．０１Ｍ酢酸緩衝液２００ｄに粒子を再懸濁させて粒子濃度を 約０．５％ｗ　／　ｖとした。

３、　梅毒用磁性粒子アッセイ Ａ、ヒト血清又は血漿標本を溶液Ａ（１−！Ｊス塩酸塩３．１５ｇ。

トリス塩基１．２１ｇ、及びナトリウムアジド０．２ｇ；Ｍｉｌｌた。次いで希 釈標本の一部を、溶液Ａを２０μ！及び溶液Ｂ（リン１酸２ナトリウム４，３４ ６ｇ、リン酸１ナトリウム０．５２４ｇ。

Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０５，Ｏｒｄ、、塩化ナトリウム２９．２２ｇ及びナト リウムアジド１．Ｏｇ；１０００Ｉｉとする；ｐＨ７，４）を５μ！含むミクロ タイター板のウェル（５μりに加えた。Ｎｏｎ１ｄｅｔ−Ｐ２Ｏ（ＮＰ−４０） と塩化ナトリウムの濃度は、板へのヒ）ＩｇＭとＩｇＧの非特異的結合を最少限 にするよう調整した。アッセイは１組となった６種のアッセイの一部として行な われるので、１枚の板には最大１６の希釈標本（１６ウエル）を加えることがで きる。アッセイは咳組とは独立して行うこともでき、その場合は９６の希釈標本 を１枚の板に加えることができる。

Ｂ、２０μ２の標本希釈用緩衝液〔修生血清７５０ｍ、塩化ナトリウム４３．８ ３ｇ、ナトリウムアジド１．Ｏｇ、トリス塩基９゜５８ｇ及びアデノシン−５− モノフォスフェート（ＡＭＰ）：以下ｒｓＤＢ、という。〕を次いで加えた。修 生血清と塩化ナトリウムの濃度は、次の段階において加えられる常磁性粒子への ヒ）ＩｇＧ及びＩｇＭの非特異的結合を最少限とするように設計した。ＡＭＰは 常磁性粒子に結合した抗原に対する偽の反応を最少限とするものであり、本発明 の必須の成分である。ＡＭＰのリン酸エステル残基が恐らく粒子上の類似のエピ トープに結合するＩｇＧ及びＩｇＭをめて競合するものと思われる。次いで、リ ンａｍ衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈した常磁性粒子を加えた。常磁性粒子は、重量 比０．１：Ｏ，３：ＳにてＣＡＲＤ、ＰＣ及びＣ１（ＯＬで被覆されたものであ る。ＣＡＲＤ、ＰＣ及びＣＨＯＬ粒子は熱不活化修生血清（５６’Ｃ，４５分間 ）で２時間回転して更に被覆し、洗浄し、磁気的に分離し、上澄を除去し、そし て溶液Ｃ（リン酸２ナトリウム４．３４６ｇ、リンＭ１ナトリウム０．５２４ｇ 、塩化ナトリムウ８．７６ｇ及びナトリウムアジドＩｇ；Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１ ０００戚とする；ｐＨ７，４）で所定量とした。

粒子へのＣＡＲＤ、ＰＣ及びＣＨＯＬの担持の化学は共有結合的結合の形成に最 適なものとした。反応ウェル中に粒子と共にＮＰ−４０が存在してもＣＡＲＤ、 ＰＣ及びＣＨＯＬが粒子から完全に除去されてしまうことはない。対照的に、Ｅ ＬＩＳＡタイプのアッセイにおけるＮＰ−４０の存在は、おそら＜　ＥＬ　Ｉ　 ＳＡミクロタイター板の壁からＰＣ，ＣＡＲＤ及びコレステロールを除去するこ とにより、陽性のシグナル反応をかなり減少させてしまう。本アッセイの発明に おいては、ＮＰ−４０はミクロタイター板へのＩｇＧとＩｇＭとの結合を最少限 にするほか、粒子への非特異的結合をも最少限にし、それによりアッセイの特異 性を高める（例えば、偽の陽性反応を最少限にする）。抗原を被覆した常磁性粒 子（粒子）はレアギンの最大限の結合を可能にする。これは加えられる大きな表 面積（４Ｘ１０５粒子／ウェル；粒子直径４．０μｍ）及び反応の速度によるも のである。速度は３０分間のインキュベージジンの間ミクロタイター板のウェル の底へと粒子がゆっくり沈降することによって高められている。レアギンとの最 大限の接触及びその結果得られる結合は、インキュベージジンの間に起こる。

加えて、ＡＭＰは、常磁性粒子に結合した抗原に対する偽の反応を最少限とし、 常磁性粒子を使用した場合におけるこの発明の必須の成分であることが観察され た。ＡＭＰのリン酸エステル残基が恐らく、粒子上の類似のエピトープに結合す るＩｇＧ及びＩｇＭをめて競合するものと思われる。ＡＭＰの範囲は１０乃至２ ０（１ｍＭ、好ましくは５０乃至１００ｍＭである。リン脂質、特に例えばフォ スファチジルセリンのような負電荷を有するリン脂質にも、偽の反応を最少限に する働きがある。また、チミジン−３−モノフォスフェート（ＴＭＰ）にＡＭＰ 欅の効果のあることにも注意すべきである。

ＣＡＲＤ、ＰＣ及びＣＨＯＬで被覆した粒子と共に、異なったタイプの粒子を加 える。ＣＡＲＤ、ＰＣ及びＣＨＯＬ被覆粒子がレアギンと（もし存在すれば）反 応するのに対し、他のタイプの粒子は非結合性であるよう設計されている。代わ りに、その役割は、ウエルあたり正しい数の粒子が放出されていること及び続く 段階における粒子の損失のマーカーを提供することである。これらの常磁性粒子 は、ナイル赤による螢光コア、カルボキシル化された表面及び修生血清アルブミ ンの被覆を有してなる。加えられるナイル赤粒子の数は、ウェルあたりの螢光カ ウントの測定前数を与える。Ｗ　ａ　ｎ　ｇａｎｄ　５ｈａｈ　米国特許出願を 参照：磁気応答性螢光ポリマー粒子の製造方法、米国出願番号第０７／４５２０ ９９号、出願臼１ク８９ 、米国出願番号第０７／４５１４８３号，出願臼１９８９年１２月１４日；イム ノアッセイにおけるマーカーとしての螢光磁性ポリマー粒子の使用方法，米国出 願番号第０７／４５１２７４号．出願臼１９８９年１２月１４日；分子診断アッ セイにおける磁気応答性螢光ポリマー粒子の使用方法，米国出願番号第０　７７ ４　５　１　４　９　４。

出願臼１９８９年１２月１４日。

Ｃ１　インキュベーション完了後、ウェル中の粒子を溶液Ｄ（リン酸２＋）’Ｊ ウム２．０６ｇ，’Ｊ７酸１１ト’Ｊつｈｏ．３１８ｇ，Ｔｗｅｅｎ−２０　０ ．５ｄ，塩化ナトリウム８．７６ｇ，及びナトリウムアジド１．Ｏｇ；ｍ１ｌｌ ｉ−Ｑ水にて１ｏｏｏ＊に調製；ｐＨ７．４）（Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ） で洗浄した。Ｔｗｅｅｎ−２０は非特異的に結合したＩｇＧ及びＩｇＭを除去す ることが観察された。ここでも、結合化学により、Ｔｗｅｅｎ−２０の存在下に おいてもＣＡＲＤ，ＰＣ及びＣＨＯＬは粒子に結合したまま残った。対照的に、 ＥＬＩＳＡ法においてＴｗｅｅｎ−２０を使用した場合には、恐らくミクロタイ ター板ウェルの表面から抗原を除去することにより、陽性標本のシグナル発生が 減少することが観察ｎ　＋’　二／Ｉ　Ｌ　＋−”　二）　−’／　ｌｊ　１１ 　＋　７　０　ｙ　１．　Ｉｈ’／　’／　（　＋　Ｐ　ｉ　ｔ−　ｉ　−　− された。こうして本発明は、はるかに徹底した洗浄と、ＴｇＧ又はＩｇＭの非特 異的結合によって生ずる偽の陽性反応の減少とを可能にする。洗浄操作の間、常 磁性粒子は板の底にかけた磁場によってミクロタイターウェルに保持した。粒子 をこの方法で６回洗浄したり．　粒子を３０μ２の溶液Ｃ（リン酸２ナトリウム ４．３４６ｇ、リン酸１ナトリウム０．５２４ｇ，塩化ナトリウム８．７６ｇ。

ナトリウムアジドＩｇ，ｍ１ｌｌｉ−Ｑ水で１．０ＯＯｄに調製；ｐＨ７．４） に再懸濁させた。３００ｍの新生修生血清，塩化ナトリウム及びリン酸緩衝液（ すなわち結合体希釈緩衝液（ｐＨ７．４の０、１Ｍリン酸緩衝液２４０ｄ．グリ セロール６０ｄ．ナトリウムアジド１．２ｇ，新生修生血清３００ｄ．塩化マグ ネシウム０．　４８７ｇ，塩化ナトリウム３５．０６ｇ　；ｍｉ　ｌ　ｌ　ｉ− Ｑ水で１０００−に調製；ｐＨ７．２））の溶液中の（希釈した）β−ガラクト シダーゼと結合したヤギ抗ヒ）　Ｉ　ｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）（結合体）２０μｌをウ ェルに加えた。粒子に結合したいかなると）ＩｇＧ又はＩｇＭ（レアギンを含む ）も結合体に認識され結合されるであろう。結合体溶液は、最大限の液体安定性 と反応性とを与えるよう設計した。特に、新生修生血清は修生血清より好ましい 。結合体と１５分間のインキュベーションの後、ウェル中の粒子を洗浄し、結合 していない結合体の本質的に全てを除去した。ここでも、洗浄液中のＴｗｅｅｎ −２０は、洗浄工程を促進し非特異的に結合した結合体を除去した。

Ｅ．　最後に、基質である４−メチル−ウンベリフェリル−β−ガラクトシド（ ＭＵＧ）の溶液（４−メチルウンベリフェリル−βーＶー刀フクｒしフノンｉυ ．１　ｔａｇ．ｌ”ＪＬ／７１ＬｒｌＣ１ｎｅ）：Ｌ５８ｇ，ジメチルスルホキ シド５．１ｄ，メチルアルコール３０ｍ１，ナトリウムアジド０．２０ｇ，Ｔｗ ｅｅｎ−２０　０．５ｄ；ｍ１ｌｌｉ　Ｑ水で１　０　０　０　ｎｉｌに調製； ｐＨ８．５）をウェルに加えた。ウェル中のβ−ガラクトシダーゼ（例えば結合 体）の存在は、ＭＴＪＧを切断し螢光物質を発生させる。この試薬と結合体とは 鋭敏な検出システムとして使用される。ＭＵＧの添加の後、螢光（波長４００／ ４５０）を２種の時間間隔（すなわち２分及び１４分）で測定する６２つの値の 差は、螢光物質発生の速度論的測度であり、また粒子に結合した結合体とヒトＴ ｇＧ／ＩｇＭの直接的測度である。

陽性標本はカットオフ値と同等又はより大きい速度論値を与える。カットオフ値 は陰性試験値の平均の約４乃至５倍であった。

アッセイの信頬性確認のため、各ウェルをナイル赤粒子の螢光（波長５２５１５ ８０）が測定前のレベルに存在するか否かにつき評価し、その結果、粒子の損失 はなくかつ正しい数の粒子がウェルに加えられていたことが示された。螢光磁性 粒子及びアッセイにおけるそれらの利用に関するＷａｎｇ−３ｈａｈの米国特許 出願、番号第１１３２９４号，第３３７５１　１号，第３３７５１３号．第３３ ７２４４号及び第３３７２３４号を参照のこと。

他の者によって以前に記述されたＥＬ　Ｉ　ＳＡ法の結果は、静定な値（例えば 、１回の測定により得られる吸光度の（ｌりに基礎をおいている。静的な値は、 少なくとも部分的には、光学的／システム的ノイズを含むものである。このタイ プのシステムノイズは速度論値で除去される。従って、速度論値は一層正確であ る。

ｖｕｅ　（登録商標）試験に比し、９８．９％（９４／９５）及び９９、８％（ ９７３／９７５）である。

Ｇ．　自動化された又はマニュアルによる方法において行われる磁するｐＨ７， ４のＯ，１Ｍリン酸カリウム緩衝液１０．ｄに加えた。

）を加え３７°Ｃにて４０分間インキュベートした。Ｂｉｏｔｅｋミクロタイタ ー板読み取り機により、波長４０５にて板の吸光度を読みとった。

梅毒用磁性粒子アッセイの性能を、上記の方法を用いたＶＤＲＬＥＬＩＳＡのそ れと比較した。同じドナーからの同一の標本を両方のアッセイで試験した。カッ トオフ値は、両方のアッセイにつき同一の方式を用いて計算した。表ＩＡおよび ＩＢに示した結果から、Ｍａｃｒｏｖｕｅ　（登録商標）ＲＰＲカード試験との 比較における各アッセイの感度と特異性とを決定した。磁性粒子アッセイの感度 と特異性はいずれも１００％であったが、ＶＤＲＬ　ＥＬＩＳＡの感度と特異性 はそれぞれ８５．７％及び８０％であった。

５、Ｍａｃｒｏｖｕｅ’（登録商標）ＲＰＲカード試験との比較における梅毒用 磁性粒子アッセイの特異性を決定した。

ランダムなドナーからＥＤＴＡ血漿標本（９００）及び血清標本（１０２５）を 得た。実施例３に記載の方法に従って、各標本並びに陽性及び陰性対照につい速 度論的螢光値を得た。アッセイでのカットオフは次の通りにして計算した： 各標本につき、速度論的螢光値をカットオフ値で割って指数値を得た。これらの 指数値を分布表にプロットし、図１及び２に示すように血清及びＥＤＴＡ血漿標 本についての分布図を得た。全標本中１．０より大なる指数値を与え（すなわち 二カットオフ僅に対して陽性）しかもＲＰＲに無反応なものが３例であった。残 りの１９２２例は同様にＲＰＲに反応しなかった。このようにして、磁性粒子ア ッセイの特異性は、（１９２２／１９２５ｘ１００）−９９，８４％と計算され た。血漿及び血清標本は非常に近似した成績を与えた。

６、　実施例３に記載のアッセイを使用してＭａｃｒｏｖｕｅ　（登録商標）Ｒ ＰＲカード試験との比較における梅毒用磁性粒子アッセイの感度を決定した。

梅毒トレポネーマに対する抗体をも有することが確認されたＲＰＲ反応性の標本 （１９５）（すなわち、確認陽性標本）について評価した（表２参照）。ＲＰＲ 反応性の５標本は磁性粒子アッセイで陰性であった。残りの１９０標本はいずれ の試験にも反応性であった。こうして、磁性粒子アッセイの感度は１９０／１９ ５Ｘ１００＝９７．４％と計算された。

本発明は、梅毒の血清学における利用に限定されるものではなく、抗ＣＡＲＤ、 抗ＰＣ又は抗ＣＨＯＬ抗体を測定する他の試験システムにも使用することができ る。

螢光コアを有する常磁性粒子の使用は、最適のアッセイ能力のために必要とされ るものではない。それらは単に、ウェルあたりの正確な数の粒子の放出と粒子の 損失の測定のためのマーカーにすぎない。従って、アッセイは、これらの粒子な しにも行うことができる（以下余白） 表　ＩＡ カットオフに対するＥＬＩＳＡ試験の指数値ＲＰＲ陰性標本　ＲＰＲ陽性標本　 対　照ＩＤ　指致土　ＩＤ　Ｎ歎鼻　ヒ　＊ ５Ｐ１５　０．３７６　ＳＰ２　１．７４０　陽性対照　１．５５（０，０８４ ００）ＳＰ１６　０．４１３　３１３４１：１５０．７５３　陰性対照　０．４ ２（０，０２３００）ＳＰ１７　０．１９１　０ＬＪ　４．４３ＢＳＰ１８　１ ．６１１　０ＬＫ　９．５４９　ブランク　０．０９（０，００５００）ＳＰ１ ９　０．７３４　ＳＰ６　１．９１９ＳＰ２０　０．７４６　５Ｐ３９　１．７ ２２ＳＰ２１　２．４０７　０ＬＬ　８．０９２ＳＰ２２　０．６５４ ＳＰ２３　０．４８１ ＳＰ２４　０．５２４ Ｇ３−３　０．５６７ ＳＰ４３　０．５５５ ＳＰ４４　０．２８３ ＳＰ１４　０．５ ＳＰ２６　０．４６２ ＳＰ２７　０．９１９ ＳＰ２８　１．６４８　ＲＰＲ＋　ＲＰＲ−３Ｐ２９　０．８３９ ＳＰ３０　２．１４１　ＥＬＩＳＡ＋　６　４ＳＰ３１　０．８４５　ＥＬＩＳ Ａ−１１６＊　指数は、標本の吸光度／カットオフ吸光度と定義される。

カットオフ吸光度は、（陽性対照の吸光度十陰性対照の吸光度）／２と定義され る。

カントオフ＝　（０，０８４＋０．０２３　）　／２　＝０．０５４吸光度怒　 度＝６　／７　Ｘ１００　＝８５．７％特異性−１６／２０Ｘ１００　＝８０％ 平均陰性値＝０．８４ （以下余白） 表　ＩＢ カットオフに対する磁性粒子アッセイの指数値ＲＰＲ陰性標本　ＲＰＲ陽性標本 　対　照５Ｐ１５　０．２　ＳＰ２　２．３１　陽性対照　１．５６１ＳＰ１６ 　０．１２　３１３４１：１５１．５７　陰性対照　０．４３８ＳＰ１７　０． １３　０ＬＪ　７．７ ＳＰ１８　０．２７　０ＬＫ　７．８７　ブランク　０．１０４ＳＰ１９　０． ４２　ＳＰ６　１．７３ＳＰ２０　０．１３　５Ｐ３９　２．３３ＳＰ２１　０ ．２２　０ＬＬ　１８．２７ＳＰ２２　０．１４ ＳＰ２３　０．１５ ＳＰ２４　０．１９ Ｇ３−３　０．４４ ＳＰ４３　０．２６ ＳＰ４４　０．４６ ＳＰ１４　０．８９ ＳＰ２６　０．３１ ＳＰ２７　０．１３ ＳＰ２８　０．０９　ＲＰＲ＋　ｌ？ＰＩ？〜５Ｐ２９　０．３ ＳＰ３０　０．１５　磁性粒子＋　７０ＳＰ３１　０．１９　磁性粒子−０２０ ＊　指数は、標本の螢光／カットオフ螢光と定義される。

カットオフ螢光は、（陽性対照の螢光十陰性対照の螢光）／２＝３３６８螢光単 位と定義される。

惑　度＝７　／７　ｘｌｏｏ　＝１００％特異性＝　２０／２０　Ｘ　１００鯰 １００％平均陰性値＝０．２２ （以下余白） 表　２ 梅毒陽性（梅毒トレポネーマ抗体陽性）が確認されたＲＰＲ反応性標本でのＰａ ｎｄｅｘ　（登録商標）アッセイ性能？　−！＋　鋭 要　約　書 本発明は、カルシオリビン２　フォスファチジルコリン及び／又はコレステロー ルを個々に又は組合わせて固相に固定化する方法及び、該固定化したカルシオリ ビン、フォスファチジルコリン及び／又はコレステロールを用いるヒト血清又は 血漿中の梅毒等のレアギン性抗体のための鋭敏かつ迅速なアンセイに関する。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抗原試薬としてカルジオリピン，フォスファチジルコリン及びコレステロー ルを個々に又は組合せて吸着させ又は共有結合により結合させてなる、安定で界 面活性剤抵抗性の生物反応性固相。 ２．カルジオリピン，フォスファチジルコリン及びコレステロールの重量比がそ れぞれ０．０１乃至１、０．０１乃至３及び０．１乃至１０である、請求項１に 記載の組成物。 ３．カルジオリピン，フォスファチジルコリン及びコレステロールの重量比が０ ．１：０．３：８．０である、請求項２に記載の組成物。 ４．該固相が中性であるか、正の又は負の電荷又は反応性の表面基を有するよう 修飾されているものである、請求項１に記載の組成物。 ５．該固相が約０．１なしい１００μｍのサイズ範囲の粒子である、請求項１に 記載の組成物。 ６．該固相が２乃至８μｍのサイズ範囲の粒子である、請求項１に記載の組成物 。 ７．該固相がカルジオリピン及びフォスファチジルコリンの受動的吸着のための 官能基を有する粒子である、請求項１に記載の組成物。 ・該固相が常磁性である、請求項１に記載の組成物。 ・該固相が、有機溶媒の存在下においてカルジオリピン，フォスファチジルコリ ン及びコレステロールを受動的に及び／又は共有結合により結合させるための架 橋された、アミノ基を有する常磁性粒子である、請求項１に記載の組成物。 １０．前記抗原試薬が、前記固相に共有結合により結合されるに先立ち試薬によ り修飾されているものである、請求項１に記載の組成物。 １１．少なくとも一の抗原試薬が前記固相への共有結合による結合のための官能 基を得るために酸化されているものである、請求項１０に記載の組成物。 １２．カルジオリピンが前記固相への共有結合による結合のための官能基を得る ために結合前に化学的に修飾されているものである、請求項１に記載の組成物。 １３．前記化学修飾が、カルジオリピンを、１，４−ブタンジオールジグリシジ ルエーテル（オキシラン）と、ＥＤＣの存在下にビオチンと、又は無水コハク酸 と混合することにより行われるものである、請求項１２に記載の組成物。 １４．個々に又は組合せてラテックス粒子に吸着させ又は共有結合により結合さ せたカルジオリピン，フォスファチジルコリン及びコレステロールよりなる、梅 毒用レアギン試験に使用するための抗原試薬。 １５．カルジオリピン，フォスファチジルコリン及びコレステロールの重量比が それぞれ０．０１乃至１、０．０１乃至３及び０．１乃至１０の範囲である、請 求項１４に記載の組成物。 １６．カルジオリピン，フォスファチジルコリン及びコレステロールの重量比が ０．１：０．３：８．０である、請求項１４に記載の組成物。 １７．該固相が中性であるか、正の若しくは負の電荷又は反応性の表面基を有す るように修飾されているものである、請求項１４に記載の試薬。 １８．該固相が０．１乃至１００μｍのサイズ範囲の常磁性粒子である、請求項 １４に記載の試薬。 １９．該固相が２乃至８μｍのサイズ範囲の常磁性粒子である、請求項１４に記 載の試薬。 ２０．該固相がカルジオリピン及びフォスファチジルコリンの受動的吸着のため の官能基を有する常磁性粒子である、請求項１４に記載の試薬。 ２１．該固相が有機溶媒の存在下においてカルジオリピン，フォスファチジルコ リン及びコレステロールを受動的に及び／又は共有結合により結合させるための 架橋された、アミノ基を有する常磁性粒子である、請求項１４に記載の試薬。 ２２．梅毒関連抗体用レアギン試験であって、（ａ）前記抗体の含有が疑われる 希釈標本サンプルを、請求項１４に記載の抗原試薬とともに、前記抗体と該抗原 試薬中の抗原との間の結合を許容する条件下にインキュベートし、（ｂ）該抗原 試薬が凝集したか否かを決定することよりなり、凝集が前記サンプル中の前記抗 体の存在を示すものである試験。 ２３．該標本が血清又は血漿である、請求項２２に記載の方法。 ２４．前記サンプルが仔牛血清とリン酸エステル含有物質とを含有する緩衝液で 希釈されるものである、請求項２２に記載の方法。 ２５．前記リン酸エステル含有物質がＡＭＰ，ＴＭＰ又はフォスファチジルセリ ンである、請求項２２に記載の方法。 ２６．梅毒関連抗体用の血清学的試験であって、（ａ）前記抗体の含有が疑われ る希釈標本サンプルを、請求項１４に記載の抗原試薬とともに、前記抗体と該抗 原試薬中の抗原との間の結合を許容する条件下にインキュベートし、（ｂ）該抗 原試薬が凝集したか否かを決定することよりなる試験。 ２７．梅毒関連抗体用のアッセイであって、（ａ）前記抗体の含有が疑われるサ ンプルを、請求項９に記載の抗原試薬とともに、前記抗体と該抗原試薬中の抗原 との間の結合を許容する条件下にインキュベートし、（ｂ）前記ラテックス粒子 に結合しなかった材料を分離するために洗浄し、 （ｃ）前記サンプル−抗原試薬を標識された免疫反応性試薬とインキュベートし 、そして （ｄ）洗浄し、標識された免疫反応性試薬を検出又は定量することにより未知物 を検出又は定量することよりなるアッセイ。 ２８．該標識が放射性，酵素，化学発光又は螢光標識である、請求項１４に記載 のアッセイ。 ２９．レアギン抗体のためのアッセイであって、（ａ）前記抗体の含有が疑われ るサンプルを、請求項９に記載の抗原試薬とともに、前記抗体と該抗原試薬中の 抗原との間の結合を許容する条件下にインキュベートし、（ｂ）前記ラテックス 粒子に結合しなかった材料を分離するために洗浄し、 （ｃ）前記サンプル−抗原試薬を標識された免疫反応性試薬とインキュベーショ ンすることによりなるアッセイ。