ES2834880T3 - Prueba combinada de sífilis treponémica y no treponémica - Google Patents

Abstract

Un kit que comprende: (i) perlas recubiertas con antígeno de cardiolipina-lecitina-colesterol; y (ii) perlas recubiertas con el antígeno de Treponema pallidum, en el que (i) y (ii) se envasanmezcladas en elmismo recipiente y se almacenan en una solución de almacenamiento que comprende el detergente iónico o zwitteriónico pero que carece de detergente no iónico.

Description

DESCRIPCIÓN

Prueba combinada de sífilis treponémica y no treponémica

Antecedentes de la invención

La sífilis es una enfermedad de transmisión sexual (STD) causada por la bacteria espiroqueta Treponema pallidum. Las pruebas serológicas para la sífilis pueden clasificarse en dos grupos, pruebas no treponémicas y treponémicas. Las pruebas no treponémicas detectan anticuerpos no treponémicos (reagina) contra el material lipoideo liberado por las células huésped dañadas. Las pruebas no treponémicas más usadas son las pruebas del Laboratorio de Investigación de Enfermedades Venéreas (VDRL) y la de reagina plasmática rápida (RPR), que son pruebas (generalmente pruebas de floculación) que emplean un antígeno basado en cardiolipina-lecitina-colesterol. Las pruebas no treponémicas tienen la ventaja de estar ampliamente disponibles, ser económicas y cómodas de realizar. Los resultados de estas pruebas generalmente vuelven a ser negativos después de un tratamiento exitoso, por lo que pueden usarse para monitorear la respuesta a la terapia. Sin embargo, estas pruebas normalmente requieren una interpretación subjetiva, por lo que son difíciles de interpretar, especialmente para los sueros débilmente reactivos. Las pruebas no treponémicas también tienen un potencial limitado para la automatización y las pruebas de gran volumen. Por el contrario, las pruebas treponémicas detectan anticuerpos dirigidos contra antígenos de superficie nativos o recombinantes de T. pallidum tales como proteínas de 15 kDa, 17 kDa y 47 kDa. Las pruebas treponémicas incluyen el ensayo de aglutinación pasiva de partículas de T. pallidum (TP-PA), la prueba de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes (FTA-ABS) y la mayoría de las pruebas de ensayos inmunoenzimáticos (EIA). En comparación con las pruebas no treponémicas, las pruebas treponémicas muestran mayor especificidad y sensibilidad. Sin embargo, no pueden usarse para controlar la respuesta a la terapia porque los anticuerpos treponémicos permanecen durante años después de la infección. AR Castro y otros, J. Clin. Microbiol. 48(12): 4615-4619 (2016) y EE.UU. 2014/0322800 divulgan ensayos múltiples para los antígenos treponémicos y no treponémicos en base a tiras reactivas o perlas recubiertas con los antígenos respectivos.

La sífilis se diagnostica mediante el algoritmo tradicional (muestra de paciente examinada mediante prueba no treponémica seguida de confirmación de prueba tremonémica) o el algoritmo inverso (muestra de paciente examinada mediante prueba treponémica seguida de confirmación no treponémica). Básicamente, ambos algoritmos siguen un cribado inicial positivo con una prueba de confirmación.

Breve sumario de la invención

En la presente memoria se proporcionan kits para detectar los anticuerpos treponémicos y no treponémicos en una muestra de un individuo sospechoso de tener una infección por sífilis. El kit de la invención en su sentido general se define en la reivindicación independiente 1 e incluye (i) perlas recubiertas con el antígeno de cardiolipina-lecitinacolesterol; y (ii) perlas recubiertas con el antígeno de Treponema pallidum, en el que (i) y (ii) se envasan mezclados en el mismo recipiente (por ejemplo, en un recipiente o tubo), y las perlas se almacenan en una solución que comprende un detergente iónico o zwitteriónico pero que carece de detergente no iónico.

En algunas realizaciones, el antígeno lipoideo es cardiolipina, lecitina o colesterol. En algunas realizaciones, el antígeno de Treponema pallidum es r15, r17, r47, una mezcla de estos o una fusión de r17 y r47.

En algunas realizaciones, el kit incluye además un anticuerpo antiinmunoglobulina (Ig) marcado, por ejemplo, un anticuerpo anti-Ig humana. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Ig es específico para la IgG (por ejemplo, la IgG humana) y/o la IgM (por ejemplo, la anti-IgM humana). En algunas realizaciones, el anticuerpo antiinmunoglobulina humana marcado es un conjugado de anticuerpo que se une a la IgG humana y a la IgM humana. En algunas realizaciones, el kit comprende un primer anticuerpo anti-Ig humano marcado específico para la IgG y un segundo anticuerpo anti-Ig humano marcado específico para la IgM. El anticuerpo anti-IgG humano y el anticuerpo anti-IgM humano pueden tener las mismas o diferentes marcadores.

En algunas realizaciones, el kit incluye además una solución de lavado o una solución madre de lavado (por ejemplo, concentrado o deshidratado). En algunas realizaciones, la solución de lavado o solución madre de lavado incluye PBS y, opcionalmente, un detergente iónico, no iónico o zwitteriónico. En algunas realizaciones, la solución de lavado tiene detergente no iónico. En algunas realizaciones, la solución de lavado carece de detergente no iónico.

En algunas realizaciones, el antígeno lipoideo se acopla (une) al soporte sólido de (i) mediante una interacción iónica. En algunas realizaciones, el soporte sólido de (i) se recubre con polietilenimina (PEI). En algunas realizaciones el antígeno de Treponema pallidum se acopla a las perlas de (ii) mediante una interacción covalente. En algunas realizaciones, las perlas de (i) y (ii) están marcadas de manera diferente, de diferentes tamaños o de diferentes pesos.

También se proporcionan procedimientos para detectar la presencia de anticuerpos contra la sífilis en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica de un individuo, por ejemplo, un humano. El procedimiento de la invención en su sentido general se define en la reivindicación independiente 10 y comprende (a) poner en contacto la muestra con (i) perlas recubiertas con antígeno de cardiolipina-lecitina-colesterol y (ii) perlas recubiertas con el antígeno de Treponema pallidum mezclado en el mismo recipiente, y formar así una mezcla de muestra-perla, en la que el contacto se realiza en presencia de detergente iónico o zwitteriónico pero en ausencia de detergente no iónico; (b) lavar la mezcla de muestra y perlas para eliminar la muestra no unida; (c) poner en contacto la mezcla de muestra y perlas con un anticuerpo antiinmunoglobulina (Ig) marcado (por ejemplo, el anticuerpo anti-Ig humana); y (d) detectar la presencia de anticuerpos contra la sífilis al detectar el marcador en el anticuerpo anti-Ig.

En algunas realizaciones, la etapa (c) se realiza en un tampón que no incluye detergente no iónico.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además lavar para eliminar el anticuerpo anti-Ig no unido entre las etapas (c) y (d). En algunas realizaciones, el lavado se realiza con detergente no iónico. En algunas realizaciones, el lavado se realiza en ausencia de detergente no iónico. En algunas realizaciones, el lavado se realiza con solución salina tamponada con fosfato (PBS), opcionalmente con detergente iónico, no iónico o zwitteriónico. En algunas realizaciones, se usa detergente no iónico en los tampones de lavado en los ensayos que se describen actualmente, pero a una concentración menor que en los ensayos estándar que tienen componentes hidrófilos (no lipídicos). En algunas realizaciones, el lavado con detergente no iónico se realiza con una duración reducida en comparación con los ensayos estándar que tienen componentes hidrófilos (no lipídicos) (por ejemplo, 2-20, 1-10 o 2-8 segundos, en comparación con 10-60 o 30-90 segundos). En algunas realizaciones, se realizan menos lavados con detergente no iónico en comparación con los ensayos estándar que tienen componentes hidrófilos (no lipídicos) (por ejemplo, 2-4, 2, 3 o 4 veces durante la duración del ensayo, en comparación con 4, 8 o 5-10 veces).

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Ig marcado es la anti-Ig humana. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-Ig humana marcado es específico para la IgG y/o IgM. En algunas realizaciones, el anticuerpo antiinmunoglobulina humana marcado es un conjugado de anticuerpo que se une a la IgG humana y a la IgM humana. En algunas realizaciones, la etapa (c) comprende poner en contacto la mezcla de soporte de muestra con un primer anticuerpo anti-Ig humana marcado específico para la IgG y un segundo anticuerpo anti-Ig humana marcado específico para la IgM. El primer y segundo anticuerpos marcados pueden marcarse con el mismo o con diferentes marcadores.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además prescribir un curso de tratamiento si se detectan anticuerpos contra la sífilis en la etapa (d). En algunas realizaciones, el curso de tratamiento incluye el tratamiento con un antibiótico (por ejemplo, penicilina, tetraciclina, doxiciclina).

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la ilustración esquemática de una prueba combinada para la detección de anticuerpos treponémicos y no treponémicos en una plataforma automatizada (por ejemplo, BioPlex ™ 2200).

La Figura 2 representa la funcionalización de la superficie de las perlas para permitir que las perlas se recubran con el antígeno lipídico no treponémico.

Descripción detallada de la invención

A. Introducción

En la presente memoria se describe una nueva prueba de combinación para la detección simultánea de los anticuerpos treponémicos y no treponémicos en muestras de pacientes. Los ensayos pueden realizarse de manera eficiente en una plataforma automatizada. La prueba de combinación comprende una prueba treponémica (por ejemplo, perlas marcadas con un primer marcador y recubiertas con la proteína de fusión recombinante r17 y r47 de T. pallidum) y una prueba no treponémica (por ejemplo, perlas marcadas con un segundo marcador y una mezcla de antígenos de cardiolipina-lecitina-colesterol). La prueba de combinación también puede comprender indicadores anti-IgG humana marcados y anti-IgM humana marcados (por ejemplo, anti-hIgG-PE y anti-hIgM-PE) para cuantificar los anticuerpos treponémicos y no treponémicos en la muestra.

La combinación de (i) perlas unidas covalentemente al antígeno (treponémicas) con (ii) perlas recubiertas de forma no covalente con un antígeno lipídico (no treponémico) en un único ensayo o kit no es sencilla porque generalmente se usan diferentes condiciones para el almacenamiento y lavado de los dos tipos de perlas. Sin embargo, mediante el uso de las técnicas de conjugación y las condiciones de tampón que se divulgan actualmente, los reactivos combinados son estables durante al menos 12-24 meses. Además, los ensayos son sensibles y precisos a pesar de la falta de detergente no iónico en la solución de almacenamiento (en la que se almacenan el soporte sólido o las perlas), el tampón de dilución de la muestra y la solución de ensayo (en la que la muestra se incuba con las perlas). Por lo general, los detergentes no iónicos se usan en varias soluciones para reducir la señal de fondo, pero como se muestra en la presente memoria, los ensayos que combinan perlas funcionalizadas con amina recubiertas con el antígeno no treponémico hidrofóbico y perlas recubiertas con el antígeno treponémico hidrofílico detectaron anticuerpos con alta precisión en pacientes con sífilis en varias etapas de la infección y tratamiento. En algunas realizaciones, se usa detergente no iónico en los tampones de lavado en los ensayos que se describen actualmente, pero a una concentración menor que en los ensayos estándar que tienen componentes hidrófilos (no lipídicos). En algunas realizaciones, el lavado con detergente no iónico se realiza con una duración o frecuencia reducida en comparación con los ensayos estándar que tienen componentes hidrófilos (no lípidos).

La combinación de los dos tipos de perlas con diferentes afinidades y complejidad implicó la modificación del procedimiento, tal como la omisión de detergentes del diluyente de la muestra. Los dos tipos de perlas normalmente se almacenarían y usarían en distintas condiciones; nadie ha combinado los dos formatos, es decir, microambientes hidrófilos e hidrófobos en un ensayo.

Además, los resultados que se describen en la presente memoria identifican anticuerpos IgM e IgG específicos de reagina mediante el uso de conjugados IgM-PE e IgG-PE. Este enfoque ha ayudado a detectar la presencia de anticuerpos IgM entre los pacientes con reagina positiva. De hecho, determinamos que la mayoría de los anticuerpos anti-reagina son del isotipo IgM. Los ensayos actuales informan resultados reactivos/no reactivos sin identificar el isotipo de los anticuerpos. Los anticuerpos de isotipo IgM son indicativos de una infección aguda en etapa temprana y los anticuerpos de isotipo IgG se vuelven prevalentes más tarde. La pérdida o disminución de los anticuerpos IgM específicos de RPR puede permitir que un médico controle y prescriba el tratamiento farmacológico de manera adecuada, por ejemplo, prescribir una dosis más alta o más frecuente de antibióticos para infecciones más avanzadas). En algunas realizaciones, el estadio puede determinarse al detectar anti-IgM-PE o anti-IgG-PE solo, o mediante el uso de diferentes marcadores en los anticuerpos anti-Ig.

B. Definiciones

A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente memoria tienen el mismo significado que el que se entiende comúnmente por un experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier (4ta ed. 2007); Sambrook y otros, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989).

Los ensayos múltiples son análisis que miden simultáneamente los niveles de más de un analito en una sola muestra. Los procedimientos y reactivos de los ensayos múltiples se divulgan, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 6.773.578 y WO2008148883.

El término "perlas" se usa en la presente memoria para indicar una superficie o cuerpo inerte sólido en el que puede inmovilizarse un agente, tal como un anticuerpo o un antígeno. Los ejemplos no limitantes incluyen plástico, nitrocelulosa, membranas, chips, perlas magnéticas o no magnéticas. El término "inmovilizado", como se usa en la presente memoria, indica un acoplamiento de base molecular que no se desacopla significativamente en las condiciones impuestas durante las etapas de los ensayos que se describen en la presente memoria. Tal inmovilización puede lograrse mediante un enlace covalente, un enlace iónico, un enlace de tipo afinidad o cualquier otro enlace químico.

El término "partícula" se usa en la presente memoria para referirse a un cuerpo sólido o semisólido, a menudo con dimensiones lineales en la escala de micrómetros (es decir, menos de 100 m), de cualquier forma, o textura superficial. Excepto cuando se indique, el término se usa indistintamente con "micropartícula", que se refiere a una partícula de escala micrométrica, y "perla", que se refiere a partículas que son de forma esférica o casi esférica, a menudo de composición polimérica.

Los términos "receptáculo", "recipiente", "tubo", "pozo" y "compartimento" se refieren a un recipiente que puede contener reactivos o un ensayo. Si el receptáculo está en un kit y contiene reactivos, normalmente estará cerrado o sellado. Si el receptáculo se usa para un ensayo, normalmente estará abierto o accesible durante los pasos del ensayo.

Los términos "muestra" y "muestra biológica" abarcan una variedad de tipos de muestras obtenidas de un organismo. El término abarca fluidos corporales tales como saliva, esputo, sangre, componentes sanguíneos, suero, plasma, orina y otras muestras líquidas de origen biológico, biopsia de tejido sólido, cultivos de tejido o sobrenadante extraído de células cultivadas de pacientes. En el contexto de la presente divulgación, la muestra biológica es típicamente un fluido corporal con cantidades detectables de anticuerpos, por ejemplo, esputo, moco, biopsia de tejido mucoso o raspado. La muestra biológica puede procesarse antes del ensayo, por ejemplo, para eliminar células o restos celulares. El término engloba muestras que han sido manipuladas después de su obtención, como por tratamiento con reactivos, solubilización, sedimentación o enriquecimiento de ciertos componentes.

Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido codificado por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de estos, que se unen de manera específica y reconocen a un analito (antígeno). Las cadenas ligeras de inmunoglobulina que son reconocidas se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas de inmunoglobulinas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, las cuales a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. En los seres humanos, hay cuatro subclases de IgG, denominadas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Un ejemplo de una unidad estructural de inmunoglobulina G (anticuerpo IgG) es un tetrámero. Cada tal tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). El N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 aminoácidos o más responsables principalmente del reconocimiento antigénico. Los términos "cadena ligera variable" (VL) y "cadena pesada variable" (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas respectivamente.

Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como fragmentos bien caracterizados que se producen por digestión de inmunoglobulinas intactas con diversas peptidasas. Así, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo cerca de los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab')2, un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena ligera unida al VH-CH1 mediante un enlace disulfuro. El dímero F(ab')2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra, y convertir así el dímero F(ab')2 en dos monómeros Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la región de bisagra (véase, Paul (Ed.), Fundamental Immunology, Third Edition, Raven Press, NY (1993)). Aunque varios fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que tales fragmentos pueden sintetizarse de novo ya sea químicamente o mediante el uso de la metodología de ADN recombinante. Por tanto, el término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, también incluye fragmentos de anticuerpos producidos por la modificación de anticuerpos completos o por síntesis de novo mediante el uso de metodologías de ADN recombinante tales como Fv de cadena sencilla.

Los anticuerpos se denominan comúnmente de acuerdo con sus dianas. Si bien la nomenclatura varía, un experto en la técnica estará familiarizado y comprenderá que pueden aplicarse varios nombres al mismo anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo específico para IgM puede denominarse "anti-IgM", "anticuerpo IgM" y "anticuerpo anti-IgM".

Los términos "antígeno", "inmunógeno", "anticuerpo diana", "analito diana" y términos similares se usan en la presente memoria para referirse a una molécula, compuesto o complejo que es reconocido por un anticuerpo, es decir, puede unirse específicamente al anticuerpo. El término puede referirse a cualquier molécula que pueda ser reconocida específicamente por un anticuerpo, por ejemplo, un polipéptido, polinucleótido, carbohidrato, lípido, grupo químico o combinaciones de estos (por ejemplo, polipéptidos fosforilados o glicosilados). Un experto comprenderá que el término no indica que la molécula sea inmunogénica en todos los contextos, sino que simplemente indica que puede ser dirigida por un anticuerpo.

Los anticuerpos se unen a un "epítopo" de un antígeno. El epítopo es el sitio localizado en el antígeno que es reconocido y unido por el anticuerpo. Los epítopos pueden incluir algunos aminoácidos o porciones de algunos aminoácidos, por ejemplo, 5 o 6, o más, por ejemplo, 20 o más aminoácidos, o porciones de esos aminoácidos. En algunos casos, el epítopo incluye componentes no proteicos, por ejemplo, de un carbohidrato, ácido nucleico o lípido. En algunos casos, el epítopo es un grupo tridimensional. Así, por ejemplo, cuando la diana es una proteína, el epítopo puede estar compuesto por aminoácidos consecutivos o aminoácidos de diferentes partes de la proteína que se acercan mediante el plegamiento de las proteínas (por ejemplo, un epítopo discontinuo). Lo mismo ocurre con otros tipos de moléculas diana que forman estructuras tridimensionales. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y usualmente más, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los procedimientos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, la cristalografía de rayos X y la resonancia magnética nuclear de 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996).

Los términos "específico para", "se une específicamente" y términos similares se refieren a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se une a su diana con una afinidad al menos 2 veces mayor que los compuestos no diana, por ejemplo, al menos cualquiera de 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces o 100 veces mayor afinidad. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a una diana de anticuerpo dada típicamente se unirá a la diana de anticuerpo con al menos una afinidad 2 veces mayor que una diana sin anticuerpo. La especificidad puede determinarse mediante el uso de procedimientos estándar, por ejemplo, inmunoensayos ELISA en fase sólida (véase, por ejemplo, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)) para obtener una descripción de los formatos y las condiciones de los inmunoensayos que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad específica).

El término "se une" con respecto a una diana de anticuerpo (por ejemplo, un antígeno, analito), normalmente indica que un anticuerpo se une a la mayoría de las dianas del anticuerpo en una población pura (al asumir proporciones molares apropiadas). Por ejemplo, un anticuerpo que se une a una diana de anticuerpo determinado normalmente se une a al menos 2/3 de las dianas del anticuerpo en una solución, por ejemplo, al menos cualquiera de 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 %). Un experto reconocerá que surgirá cierta variabilidad en función del procedimiento y/o umbral de determinación de la unión.

Los términos "marcador", "marcador detectable", "grupo detectable" y términos similares se refieren a una composición detectable pormedios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros medios físicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen los tintes fluorescentes (fluoróforos), los agentes luminiscentes, los reactivos densos en electrones, las enzimas (por ejemplo, como se usa comúnmente en un ELISA), la biotina, la digoxigenina, el 32P y otros isótopos, los haptenos y proteínas que pueden hacerse detectables, por ejemplo, al incorporar un radiomarcador en el péptido o usado para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el péptido. El término incluye combinaciones de agentes de marcado únicos, por ejemplo, una combinación de fluoróforos que proporciona una firma detectable única, por ejemplo, en una determinada longitud de onda o combinación de longitudes de onda. Puede emplearse cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar el marcador con un agente deseado, por ejemplo, mediante el uso de los procedimientos que se describen en Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego.

El término "positivo", cuando se refiere a un resultado o señal, indica la presencia de un analito o elemento que se está detectando en una muestra, en este caso, un anticuerpo indicativo de infección por sífilis. El término "negativo", cuando se refiere a un resultado o señal, indica la ausencia de un analito o elemento que se está detectando en una muestra. Los valores positivos y negativos se determinan típicamente en comparación con al menos un control, por ejemplo, un nivel de umbral que se requiere para que una muestra se determine positiva o un control negativo (por ejemplo, un blanco conocido).

Una muestra o valor de "control" se refiere a una muestra que sirve como referencia, generalmente una referencia conocida, para compararla con una muestra de prueba. Por ejemplo, puede tomarse una muestra de prueba de una condición de prueba, por ejemplo, en presencia de un compuesto de prueba, y en comparación con muestras de condiciones conocidas, por ejemplo, en ausencia del compuesto de prueba (control negativo), o en presencia de un compuesto conocido (control positivo). Un control también puede representar un valor promedio obtenido de una serie de pruebas o resultados. Un experto en la técnica reconocerá que los controles pueden diseñarse para la evaluación de cualquier número de parámetros, comprenderá qué controles son valiosos en una situación determinada y podrá analizar datos en base a comparaciones con valores de control. Los controles también son valiosos para determinar la importancia de los datos. Por ejemplo, si los valores de un parámetro dado son variables en los controles, la variación en las muestras de prueba no se considerará significativa.

Un "control de calibración" es similar a un control positivo, en el sentido que incluye una cantidad conocida de un analito conocido. En el caso de un ensayo múltiple, el control de calibración puede diseñarse para incluir cantidades conocidas de múltiples analitos conocidos. La cantidad de analito(s) en el control de calibración puede establecerse en una cantidad mínima de corte, por ejemplo, de modo que una cantidad mayor se considerará "positiva" para el analito(s), mientras que una cantidad menor se considerará "negativa" para el analito(s). En algunos casos, pueden usarse controles de calibración multinivel, de modo que pueda determinarse con mayor precisión un intervalo de cantidades de analito. Por ejemplo, un ensayo puede incluir controles de calibración en cantidades bajas y altas conocidas, o cantidades mínimas, intermedias y máximas conocidas.

Los controles también pueden diseñarse para garantizar la integridad de la muestra (por ejemplo, para detectar un componente en un tipo de muestra dado que se sabe que está presente universalmente en un cierto nivel), o la integridad de una señal (por ejemplo, para detectar un fluoróforo agregado en una cantidad conocida). Estos controles pueden ser internos (ejecutados en la misma muestra que se está probando) o externos (ejecutados por separado de la muestra que se está probando). En algunas realizaciones, los ensayos que se divulgan actualmente incluyen un control de la calidad de la muestra. El control de calidad de la muestra puede incluir un soporte sólido recubierto con un reactivo que se une a un componente sanguíneo como un factor de coagulación, albúmina, globulina o fibrinógeno (por ejemplo, el anti-factor XIII, véase, por ejemplo, WO2013192445). Este componente (por ejemplo, una perla de verificación de suero o SVB) asegura que el suero o plasma está presente y de una calidad inicial. El control de calidad de la muestra también puede incluir una perla en blanco de reactivo (RBB) sola o en combinación con el soporte sólido recubierto con un reactivo que se une a un componente sanguíneo. Este componente sirve para identificar y/o cuantificar la unión no específica en la muestra. En algunas realizaciones, los ensayos que se divulgan actualmente incluyen un control de calidad de la señal, por ejemplo, solo o en combinación con el control de calidad de la muestra. El control de calidad de la señal puede ser un soporte sólido con una fluorescencia intrínseca o recubierto con una cantidad conocida de fluoróforo. Este componente (por ejemplo, una perla estándar interna o ISB) puede ser útil para detectar y compensar las fluctuaciones del detector que pueden ocurrir durante el análisis.

El término "diagnóstico" se refiere a una probabilidad relativa de que un sujeto tenga una infección, trastorno o enfermedad. De manera similar, el término "pronóstico" se refiere a una probabilidad relativa de que un determinado resultado futuro pueda ocurrir en el sujeto. Por ejemplo, en el contexto de la presente divulgación, el pronóstico puede referirse a la probabilidad de que una persona se infecte en el futuro (por ejemplo, poco probable si está inmunizado). Los términos no pretenden ser absolutos, como apreciará cualquier experto en el campo de los diagnósticos médicos.

"Sujeto", "paciente", "individuo" y términos similares se usan indistintamente y se refieren, excepto donde se indique, mamíferos como humanos y primates no humanos, así como conejos, ratas, ratones, cabras, cerdos y otras especies de mamíferos. El término no indica necesariamente que el sujeto haya sido diagnosticado con una enfermedad en particular, pero típicamente se refiere a un individuo bajo supervisión médica. Un paciente puede ser un individuo que busca tratamiento, seguimiento, ajuste o modificación de un régimen terapéutico existente, etc.

C. Ensayos múltiples para detectar anticuerpos treponémicos y no treponémicos

Los ensayos que se describen actualmente implican la detección de más de un analito en un único ensayo y, por tanto, se describen como ensayos múltiples. Los ensayos que se describen actualmente incluyen componentes para inmovilizar múltiples analitos en soportes sólidos distinguibles de modo que cada uno de los múltiples analitos pueda identificarse y cuantificarse mediante citometría de flujo. Los componentes y consideraciones del ensayo incluyen los soportes sólidos y cómo distinguir los diferentes tipos de soportes sólidos entre sí (por ejemplo, marcadores u otros parámetros de diferenciación), componentes para inmovilizar específicamente los analitos deseados y eliminar otros materiales de muestra, y marcadores para detectar y cuantificar los analitos deseados.

En este caso, el ensayo múltiple incluye un componente hidrófobo, por ejemplo, un soporte sólido acoplado al antígeno lipídico (por ejemplo, cardiolipina-lecitina-colesterol) y un componente hidrofílico, por ejemplo, el soporte sólido acoplado a un antígeno de sífilis (por ejemplo, r15, r17, r47 o mezclas o fusiones de estos). Las perlas se funcionalizan comúnmente para la unión a proteínas (explicado con más detalle a continuación), pero la unión del antígeno lipídico de tal manera que permita el procesamiento simultáneo con las perlas recubiertas con el antígeno de sífilis se realiza con consideraciones específicas.

1. Acoplamiento de los antígenos no treponémicos a soportes sólidos

Mezcla de antígenos no treponémicos (RPR o VDRL)

La mezcla de antígenos no treponémicos puede estar en una solución etanólica de cardiolipina (un difosfatidilglicerol purificado de corazón de res o sintético), lecitina (de yema de huevo de gallina, soja o sintético) y colesterol, en el que la proporción en peso de cardiolipina, lecitina y colesterol está en el intervalo de 0,03-1 mg/mL, 0,01-3 mg/mL y 0,1­ 10 mg/mL respectivamente. También podrían usarse otros disolventes orgánicos como metanol, cloroformo, benceno y acetona para solubilizar el antígeno no treponémico (RPR o VDRL). Los ejemplos muestran el uso del antígeno VDRL con cardiolipina 0,3 mg/mL, lecitina 2,1 mg/mL y colesterol 9 mg/mL.

Acoplamiento antígeno no treponémico/perla

Para asegurar suficientes cargas positivas en la superficie de la perla para la interacción iónica con la mezcla de antígenos no treponémicos, el pH del tampón de acoplamiento puede estar por debajo del pI de las perlas funcionalizadas con amina, generalmente entre 5 y 8. Los ejemplos incluyen tampón MES pH 6,1, tampón fosfato pH 7,0 y tampón MOPS pH 7,4.

El ligando cargado positivamente acoplado a la perla puede ser una molécula amina funcional, que incluye, pero no se limita a, etilendiamina, N, N-Dietiletilendiamina, otros compuestos de amina o polímeros policatiónicos tales como, pero no limitativos, polietilenimina (PEI). La PEI puede incluir polietileniminas lineales o ramificadas que contienen grupos amino primarios, secundarios o terciarios con pesos moleculares que varían de 1000 a 1,000,000 daltons, o polilisina y otros copolímeros con pesos moleculares que varían de 1,000 a 300,000 daltons. En algunas realizaciones, la polilisina está entre 15.000 y 30.000 daltons.

2. Acoplamiento de los antígenos treponémicos a soportes sólidos

El antígeno treponémico (por ejemplo, r15, r17 y r47, o subcombinaciones, mezclas o fusiones de estos) pueden acoplarse a una perla mediante enlace covalente. En algunas realizaciones, la perla se carboxila para permitir la adición conveniente de grupos funcionales. En algunas realizaciones, la perla carboxilada se activa y esterifica antes de añadir el antígeno treponémico. La activación del carboxilo puede lograrse mediante el uso de una carbodiimida soluble en agua, como 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), 1 -ciclohexil-3-(2-morfolinoetil) carbodiimida (CMC) o diciclohexilcarbodiimida (DCC). La esterificación puede lograrse, por ejemplo, mediante el uso de NHS, NHSS o HOBt.

Después de la activación y esterificación del carboxilo, el antígeno treponémico puede agregarse a la superficie activa en tampones con pH entre 6-10. Los ejemplos incluyen tampón MES pH 6,1, tampón fosfato pH 7,0, tampón MOPS pH 7,4 y tampón carbonato pH 9,0.

Después del acoplamiento, el soporte sólido (por ejemplo, las perlas) pueden bloquearse en tampones que contienen bloqueadores de proteínas tales como BSA, caseína, leche en polvo, IgG de ratón, gammaglobulina bovina (BGG), suero animal (cabra, caballo, murino). Por ejemplo, el o los bloqueadores de proteínas pueden estar presentes en una cantidad que oscila entre aproximadamente el 0,1-10 por ciento en peso/volumen.

3. Tampón de almacenamiento

Las perlas recubiertas con el antígeno no treponémico pueden suspenderse en un tampón acuoso pH 5-10, por ejemplo, 6-8. Las perlas recubiertas con el antígeno no treponémico pueden almacenarse con o separarse de perlas recubiertas con el antígeno treponémico. Pueden usarse varios tampones como Trizma, glicina y fosfato, siendo este último el más común. La concentración de tampón generalmente estará en el intervalo de aproximadamente 0,001 a 0,1 M, por ejemplo, 0,01-0,05 M. El tampón puede contener una sal como cloruro de sodio, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,01 a 0,5 M o 0,05-0,2 M. En algunas realizaciones, el tampón de almacenamiento comprende además colesterol.

Los detergentes no iónicos como Tween-20 pueden ejercer un efecto perjudicial sobre el microambiente hidrofóbico sobre las perlas recubiertas del antígeno no treponémico (por ejemplo, RPR). Esto puede provocar inestabilidad del antígeno no treponémico y un rendimiento deficiente del ensayo (por ejemplo, la afinidad reducida de los anticuerpos específicos de RPR por el antígeno).

Por consiguiente, para el almacenamiento o ejecución del ensayo, se omite el detergente no iónico y se reemplaza con aditivos que minimizan o mitigan la inestabilidad y que estabilizan los antígenos individuales o mejoran el rendimiento del ensayo. Particularmente, el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) puede emplearse en cantidades de aproximadamente 0,1 a 1,0 por ciento en peso/volumen (p/v). Pueden emplearse CHAPS u otros detergentes zwitteriónicos tales como CHAPSO, IGEPAL y Zwittergent 3-8, 3-10, 3-12, 3-14 y 3-16, por ejemplo, en cantidades del 0,01 al 0,5 por ciento p/v. Puede emplearse BSA, por ejemplo, en cantidades de 0,01 a 3 por ciento p/v. Puede emplearse glicerol, por ejemplo, en cantidades de 0,05 a 25 por ciento p/v. Puede emplearse azida de sodio en cantidades de 0,005 a 0,1 por ciento p/v.

El tampón reactivo conjugado también incluye opcionalmente colesterol en concentraciones de 30-150 pg/mL, 30-100 |jg/mL, 30 pg/mL, 35 pg/mL, 40 pg/mL o 50 pg/mL. En algunas realizaciones, el colesterol es colesterol bovino.

4. Tampones de ensayo

Los tampones de ensayo (por ejemplo, para realizar los ensayos de unión de anticuerpos con las perlas combinadas) puede incluir un tampón tal como fosfato, MOPS, trietanolamina (TEA), HEPES, TES, EPPS o Trizma. En algunas realizaciones, el tampón está en una concentración de 10-100 mM, por ejemplo, a un pH de 6,0 a 8,0. El tampón puede comprender además cloruro de sodio, por ejemplo, a 50-300 mM. En algunas realizaciones, el tampón contiene estabilizadores de proteínas tales como BSA, caseína, leche en polvo, IgG de ratón, gammaglobulina bovina (BGG), suero animal (cabra, caballo, murino). En algunas realizaciones, el estabilizador o estabilizadores de proteínas se encuentra en una cantidad que oscila entre aproximadamente el 0-10 % del volumen final. Los tampones pueden contener conservantes que incluyen, pero no se limitan a ProClin 300, ProClin 900, benzoato de sodio y azida de sodio.

Todos los tampones pueden contener detergentes iónicos y zwitteriónicos como CHAPS, IGEPAL, CHAPSO y Zwittergent 3-8, 3-10, 3-12, 3-14 y 3-16, por ejemplo, en concentraciones entre 0,05 a 1,0 o 0,1-0,5 por ciento en volumen.

5. Tampones de lavado

Los tampones de lavado (por ejemplo, para eliminar el reactivo no reactivo y las uniones no específicas de las perlas después de cada etapa de incubación) puede incluir un tampón tal como fosfato, MOPS, trietanolamina (TEA), HEPES, TES, EPPS o Trizma. El tampón puede tener una concentración de, por ejemplo, 10-100 mM, por ejemplo, a pH 6,0 a 8,0. El tampón puede comprender además cloruro de sodio, por ejemplo, a 50-300 mM. En algunas realizaciones, el tampón de lavado puede contener Tween-20 o un detergente no iónico como Tween 40, Tween 60 y Triton X-100, en concentraciones entre 0,05 y 1,0 o 0,1-0,5 por ciento en volumen.

6. Controles

Los controles (por ejemplo, los controles internos) pueden usarse con los ensayos que se describen actualmente. Un estándar interno (por ejemplo, una perla estándar interna o ISB) puede usarse para rectificar las fluctuaciones en las señales debido a picos de voltaje o cambios progresivos en la temperatura del detector u otros factores que afectan el rendimiento del detector. El estándar interno tiene una fluorescencia inherente que es independiente de la química del ensayo. Por ejemplo, el estándar interno puede derivatizarse con tetrametilrodamina u otro marcador estable que no interfiera ni se superponga con los marcadores que se usan para detectar los componentes de la muestra.

También puede usarse un control de muestra para asegurar que la muestra, por ejemplo, el suero o plasma, se ha introducido en la reacción y no se ha diluido. Un control de muestra puede incluir perlas recubiertas con un agente que se une a un componente de la muestra, por ejemplo, una perla de verificación de suero (SVB). Las perlas de suero pueden recubrirse con el anticuerpo anti-Factor XIII. El Factor XIII soluble (subunidad p) puede medirse en un inmunoensayo tipo sándwich. Un control de muestra también puede incluir un control de blanco de reactivo, por ejemplo, perlas que no están recubiertas con nada, para detectar la unión de fondo de la muestra al soporte sólido.

7. Perlas

Como se explicó anteriormente, los ensayos múltiples que se describen actualmente implican el uso de perlas. Para la detección por citometría de flujo, deben evitarse las partículas que emiten autofluorescencia, ya que esto aumentará la señal de fondo y las hará inadecuadas. Las partículas creadas por polimerización en emulsión estándar a partir de una variedad de monómeros de partida generalmente exhiben baja autofluorescencia, mientras que las que se han modificado para aumentar la porosidad (partículas "macroporosas") exhiben alta autofluorescencia. La autofluorescencia en tales partículas aumenta aún más al aumentar el tamaño y el porcentaje de monómero de divinilbenceno.

El intervalo de tamaño de las micropartículas puede variar y los intervalos de tamaño particulares no son críticos. En la mayoría de los casos, el intervalo de tamaño agregado de las micropartículas se encuentra dentro del intervalo de 0,3 pm a 100 pm de diámetro de partícula, por ejemplo, dentro del intervalo de 0,5 pm a 40 pm.

Las partículas magnéticas se usan comúnmente en la técnica y pueden hacer que las etapas de separación y lavado sean más convenientes para los ensayos que se describen actualmente. "Partículas magnéticas", "material que responde magnéticamente", "perlas magnéticas" y términos similares denotan un material que responde a un campo magnético. Los materiales que responden magnéticamente incluyen los materiales paramagnéticos (por ejemplo, hierro, níquel y cobalto, así como óxidos metálicos como Fe³O⁴ , BaFe-^O-ig, CoO, NiO, Mn²O³ , Cr²O³ , y CoMnP), los materiales ferromagnéticos, los materiales ferrimagnéticos y los materiales metamagnéticos. En lugar de constituir la micropartícula completa, el material magnéticamente sensible constituye típicamente un componente de la micropartícula, mientras que el resto consiste en un material polimérico que puede derivatizarse químicamente para permitir la unión de un reactivo de ensayo (por ejemplo, el antígeno o anticuerpo). La fijación del reactivo del ensayo puede ser directa (por ejemplo, covalente) o indirecto (por ejemplo, a través de interacciones iónicas u otras de afinidad).

Los expertos en la técnica conocen los procedimientos y la instrumentación para aplicar y eliminar un campo magnético como parte de un ensayo y se divulgan en la bibliografía. Ejemplos de informes bibliográficos son Forrest y otros, US 4,141,687; Ithakissios, Estados Unidos 4,115,534; Vlieger y otros, Analytical Biochemistry 205: 1-7 (1992); Dudley, Journal of Clinical Immunoassay 14:77-82 (1991); y Smart, Journal of Clinical Immunoassay 15:246-251 (1992).

La matriz polimérica que forma la micropartícula puede ser cualquier material que sea compatible con los ensayos que se describen actualmente. La matriz debe ser inerte para los componentes de la muestra biológica y los reactivos del ensayo, tener una autofluorescencia mínima, ser sólida e insoluble en la muestra y en cualquier otro reactivo o lavados usados en el ensayo, y capaz de fijar un reactivo del ensayo micropartícula. Ejemplos de polímeros adecuados son los poliésteres, los poliéteres, las poliolefinas, los óxidos de polialquileno, las poliamidas, los poliuretanos, los polisacáridos, las celulosas y los poliisoprenos. La reticulación es útil en muchos polímeros para impartir integridad estructural y rigidez a la micropartícula.

Los grupos funcionales para la unión de un reactivo de ensayo (por ejemplo, el antígeno o anticuerpo) pueden incorporarse a la estructura del polímero por medios convencionales. Ejemplos de grupos funcionales adecuados son los grupos amina, los grupos amonio, los grupos hidroxilo, los grupos ácido carboxílico y los grupos isocianato. El reactivo de ensayo se une típicamente covalentemente a la superficie de la fase sólida, ya sea directa o indirectamente, por ejemplo, con un grupo de enlace. Los grupos de enlace pueden usarse como un medio para aumentar la densidad de los grupos reactivos en la superficie de la fase sólida y disminuir el impedimento estérico para aumentar el intervalo y la sensibilidad del ensayo, o como un medio para agregar tipos específicos de grupos reactivos a la superficie de la fase sólida para ampliar la gama de tipos de reactivos de ensayo que pueden fijarse a la fase sólida. Ejemplos de grupos de enlace útiles adecuados son la polilisina, el ácido poliaspártico, el ácido poliglutámico y la poliarginina.

Las micropartículas de diferentes tipos en un ensayo múltiple pueden distinguirse entre sí, por ejemplo, por el tamaño, el peso, la dispersión de la luz o absorbancia, la reflectancia, la forma o el marcador, por ejemplo, el marcador fluorescente.

Cuando se usa el tamaño de micropartículas como factor de diferenciación (característica distintiva), los anchos de los subintervalos de tamaño y el espaciado entre los diámetros medios de los subintervalos adyacentes se seleccionan para permitir la diferenciación de diferentes tipos de micropartículas mediante citometría de flujo, como será evidente para los expertos en el uso e instrumentación de la citometría de flujo. Normalmente, un subintervalo para un diámetro medio dado es aproximadamente ± 5 % CV o menos del diámetro medio, donde CV es el coeficiente de variación y se define como la desviación estándar del diámetro de partícula dividido por el diámetro medio de partícula multiplicado por 100 por ciento. Los diámetros medios de los subintervalos para los diferentes tipos de partículas están generalmente separados por al menos un 6 % del diámetro medio de uno de los subintervalos, por ejemplo, al menos aproximadamente el 8 % o el 10 % del diámetro medio de uno de los subintervalos.

La dispersión de la luz también puede usarse para distinguir diferentes tipos de micropartículas. La dispersión de la luz del ángulo lateral varía con el tamaño de las partículas, la granularidad, la absorbancia y la rugosidad de la superficie, mientras que la dispersión de la luz del ángulo de avance se ve afectada principalmente por el tamaño y el índice de refracción. Variar cualquiera de estas cualidades puede resultar en diferencias de dispersión de la luz que pueden servir como un medio para distinguir los diversos grupos.

Otro ejemplo más de un parámetro de diferenciación es la absorbancia. Cuando se aplica luz a las partículas, la absorbancia de la luz por las partículas se indica principalmente por un cambio en la intensidad de la luz dispersada lateralmente (ángulo lateral), mientras que la intensidad de la luz dispersada hacia adelante no se ve relativamente afectada. En consecuencia, la diferencia de absorbancia entre varios tintes de colores asociados con las partículas se determina al observar las diferencias en la intensidad de la luz dispersada lateralmente.

Puede usarse una amplia gama de parámetros o características como parámetros de diferenciación para distinguir las partículas de un grupo de las de otro. Los parámetros de diferenciación pueden surgir del tamaño de partícula, la composición, las características físicas que afectan la dispersión de la luz, los tintes fluorescentes excitables o los tintes coloreados que imparten diferentes espectros de emisión y/o características de dispersión a las partículas, o de diferentes concentraciones de uno o más tintes fluorescentes.

Cuando la característica distinguible es un color o tinte fluorescente, puede recubrirse sobre la superficie de la micropartícula, incrustarse en la micropartícula o unirse a las moléculas del material de la micropartícula. Por tanto, pueden fabricarse micropartículas fluorescentes al combinar el material polimérico con el tinte fluorescente o al impregnar la micropartícula con el tinte. Las micropartículas con tintes ya incorporados y por lo tanto adecuadas para su uso en la presente invención están disponibles comercialmente de proveedores tales como Spherotech, Inc. (Libertyville, Ill, EE.UU.) y Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oreg., EE.UU.). Puede encontrarse una lista de proveedores de productos de citometría de flujo, por ejemplo, en el sitio web de molbio.princeton.edu/facs/FCMsites.html.

8. Marcadores detectables

Los ensayos que se describen actualmente pueden tener varios componentes marcados, por ejemplo, perlas, anticuerpos secundarios (por ejemplo, anticuerpos anti-Ig marcados), controles de calidad de la señal y de calidad de la muestra. Los marcadores pueden ser cualquier sustancia o componente que, directa o indirectamente, emita o genere una señal detectable. En algunas realizaciones, los marcadores son fluoróforos, muchos de los cuales se describen en la bibliografía y, por tanto, son conocidos por los expertos en la técnica, y muchos de los cuales están fácilmente disponibles comercialmente. Las fuentes de bibliografía sobre fluoróforos incluyen Cardullo y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85: 8790-8794 (1988); Dexter, J. of Chemical Physics 21: 836- 850 (1953); Hochstrasser y otros, Biophysical Chemistry 45: 133-141 (1992); Selvin, Methods in Enzymology 246: 300-334 (1995); Steinberg, Ann. Rev. Biochem., 40: 83-114 (1971); Stryer, Ann. Rev. Biochem. 47: 819-846 (1978); Wang y otros, Tetrahedron Letters 31: 6493-6496 (1990); y Wang y otros, Anal. Chem. 67: 1197-1203(1995).

Los siguientes son ejemplos de fluoróforos que pueden usarse como marcadores:

ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'disulfónico acridina

isotiocianato de acridina

ácido 5-(2'-aminoetilo)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS)

4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato N-(4-anilin-1-naftil)maleimida

antranilamida

BODIPY

Amarillo Brillante

cumarina

7-amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120)

7-amino-4-trifluorometilcumarina (Cumarán 151)

tintes de cianina

cianosina

4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI)

5', 5"-dibromopirogalol-sulfonaftalina (Bromopirogalol Rojo)

7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina dietilentriamina pentaacetato

ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfónico

ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico

cloruro de 5-[dimetilamino]naftaleno-1-sulfonilo (DNS, dansilcloruro)

ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL)

4- dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC) de eosina

isotiocianato de eosina

eritrosina B

isotiocianato de eritrosina

etidio

5- carboxifluoresceína (FAM)

5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF)

2',7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE)

fluoresceína

isotiocianato de fluoresceína

fluorescamina

IR144

IR1446

Verde malaquita isotiocianato

4-metilumbeliferona

orto cresolftaleína

nitrotirosina

pararrosanilina

Rojo de fenol

ficoeritrina (que incluye, pero no se limita a los tipos B y R) o-ftaldialdehído

pireno

butirato de pireno

butirato de succinimidil 1-pireno

puntos quántum

Rojo reactivo 4 (Cibacron™ Rojo brillante 3B-A)

6-carboxi-X-rodamina (ROX)

6-carboxirodamina (R6G)

rodamina B como cloruro de sulfonil lisamina de rodamina B

rodamina 123

isotiocianato de rodamina X

sulforodamina B

sulforodamina 101

derivado sulfonil cloruro de sulforodamina 101 (Texas Rojo)

N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA)

tetrametil rodamina

isotiocianato detetrametil rodamina (TRITC)

riboflavina

ácido rosólico

derivados de quelatos de lantánidos

Un grupo destacado de fluoróforos para inmunoensayos son la fluoresceína, el isotiocianato de fluoresceína, la ficoeritrina, la rodamina B y el rojo Texas (derivado sulfonil cloruro de la sulforrodamina 101). Cualquiera de los fluoróforos de la lista que precede a este párrafo puede usarse en los ensayos que se describen actualmente, ya sea para marcar la micropartícula o para marcar un agente de unión (por ejemplo, un anticuerpo o la estreptavidina). Los fluorocromos pueden unirse mediante enlaces covalentes convencionales, mediante el uso de grupos funcionales apropiados en los fluoróforos y en la micropartícula o agente aglutinante. El reconocimiento de tales grupos y las reacciones para formar los enlaces serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Otros marcadores que pueden usarse en lugar de los fluoróforos son los marcadores radiactivos y los marcadores enzimáticos. Estos se conocen en la técnica de igual manera.

D. Detección de los anticuerpos treponémicos y no treponémicos

Una vez que los soportes sólidos se recubren con los antígenos treponémicos y no treponémicos como se describió anteriormente, los soportes sólidos recubiertos se ponen en contacto con la muestra, por ejemplo, la muestra biológica de un individuo sospechoso de haber estado expuesto a la sífilis, por ejemplo, en presencia de tampón de ensayo como se describe anteriormente. La muestra no unida puede lavarse. En este ensayo, pueden usarse 3, 4 o 5 pasos de lavado. Se agregan anticuerpos anti-Ig marcados para permitir la detección de los anticuerpos de la muestra unida a los soportes sólidos. Cuando la muestra es de un ser humano, se usan anticuerpos anti-Ig humana marcados. Por ejemplo, puede usarse una mezcla de anticuerpos anti-IgG y anti-IgM, o un anticuerpo que se una tanto a IgG como a IgM.

La citometría de flujo puede usarse para detectar el tamaño, el peso, la dispersión de la luz y la fluorescencia de los componentes del ensayo. Los procedimientos e instrumentación de la citometría de flujo son conocidos en la técnica. Pueden encontrarse descripciones de instrumentación y procedimientos, por ejemplo, en Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide (2000) Becton, Dickinson, and Company; McHugh, "Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes," Methods in Cell Biology 42, Part B (Academic Press, 1994).

La citometría de flujo en general implica el paso de una suspensión (por ejemplo, perlas o micropartículas) como una corriente que pasa por un haz de luz y por sensores electroópticos, de tal manera que solo una partícula a la vez atraviesa la región. A medida que cada partícula pasa por esta región, el haz de luz se ve perturbado por la presencia de la partícula y se detecta la luz fluorescente y dispersada resultante. Las señales ópticas se usan por la instrumentación para identificar el subgrupo al que pertenece cada partícula, junto con la presencia y cantidad de marcador, de modo que se obtengan resultados de ensayo individuales. Las descripciones de la instrumentación y los procedimientos para la citometría de flujo se encuentran en la bibliografía. Ejemplos son McHugh, "Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes," Methods in Cell Biology 42, Part B (Academic Press, 1994); McHugh y otros, "Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays Using Flow Cytometry Instrumentaron," Clinical Flow Cytometry, Bauer, K.D., y otros, eds. (Baltimore, Maryland, USA: Williams and Williams, 1993), pp. 535-544; Lindmo y otros, "Immunometric Assay Using Mixtures of Two Particle Types of Different Affinity," J. Immunol. Meth. 126: 183-189 (1990); McHugh, "Flow Cytometry and the Application of Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays," Immunochemica 5: 116 (1991); Horan y otros, "Fluid Phase Particle Fluorescence Analysis: Rheumatoid Factor Specificity Evaluated by Laser Flow Cytophotometry," Immunoassays in the Clinical Laboratory, 185-189 (Liss 1979); Wilson y otros, "A New Microsphere-Based Immunofluorescence Assay Using Flow Cytometry," J. Immunol. Meth. 107: 225-230 (1988).

La señal también puede detectarse por un generador de imágenes fluorescente (por ejemplo, un Luminex Magpix®), por ejemplo, para los ensayos que se realizan en formato ELISA (por ejemplo, en una placa de microtitulación). Además, para las perlas o placas, la detección de señales puede realizarse mediante una matriz direccionable (por ejemplo, un detector Illumina o un sistema similar).

E. Kits

También se proporcionan kits para detectar anticuerpos treponémicos y no treponémicos como se describe en la presente memoria. El kit comprende (i) perlas acopladas al antígeno no treponémico y (ii) perlas acopladas al antígeno treponémico. Los soportes sólidos de (i) y (ii) están en el mismo recipiente de almacenamiento (por ejemplo, tubo o vial). Las perlas de (i) están funcionalizadas con PEI.

El kit también puede contener otros reactivos, por ejemplo, anticuerpos secundarios, tampones de ensayo, tampones de lavado y soluciones madre (por ejemplo, tampones concentrados). En algunas realizaciones, el anticuerpo secundario se marca como anti-Ig humana como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, el kit puede incluir consumibles tales como placas o tubos de pocillos múltiples para realizar el ensayo.

F. Ejemplos

1. Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra el rendimiento de la prueba combinada treponémica y no treponémica (que detecta anticuerpos contra el antígeno de la sífilis y el antígeno lipoideo, respectivamente) frente a comparadores en un conjunto de 113 muestras de suero clínico con etapas de enfermedad conocidas y estado de tratamiento, y 285 muestras de prueba de sífilis solicitadas. Las muestras de pacientes se analizaron para detectar la presencia de anticuerpos treponémicos y no treponémicos mediante el uso de la plataforma BioPlex ™ 2200 como se muestra en la Figura 1.

Como se muestra en la Figura 1, las perlas recubiertas con una proteína de fusión treponémica r17-r47 recombinante (fusión Rec Tp17/r47) y las perlas funcionalizadas con PEI recubiertas con los antígenos no treponémicos cardiolipina, lecitina y colesterol se mezclaron en tampón de ensayo (50 mM MOPS, NaCl 150 mM, BSA al 0,05 %, EDTA 10 mM, CHAPS al 0,1 %, glicerol al 20 % y azida de sodio al 0,095 %). Los dos conjuntos de perlas de analito pueden distinguirse mediante diferentes marcadores (R17 frente a R21 para las perlas treponémicas frente a las no treponémicas). Se usaron dos conjuntos de perlas de control, una perla de verificación de suero recubierta con FXIII y una perla estándar interna derivatizada con tetrametilrodamina. Estos se distinguen debido a una combinación única de tintes fluorescentes (tintes de clasificación). Las muestras se diluyeron con un tampón de dilución de muestras (TEA 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl 75 mlVh, 3 % de BSA, 0,03 % de IgG de ratón, 0,47 % de gammaglobulina, 0,0015 % de PSMA, 10 UI/L de aprotinina, 0,1 % de benzoato de sodio, 0,095 % de azida de sodio, 0,3 % de ProClin, a pH 7,4). Se añadió la muestra diluida, cada muestra potencialmente incluye anticuerpos anti-treponémicos (IgG anti-Syph Ab e IgM anti-Syph Ab) y anticuerpos anti-no treponémicos (IgG anti-CrL Ab e IgM anti-CrL Ab). Después de 20 min de incubación, las perlas se lavaron en tampón de lavado que contenía PBS 50 mM y Tween-20 al 0,1 %. Las perlas se incubaron después con un reactivo conjugado (anticuerpo secundario marcado específico para IgG e IgM humanas). El reactivo conjugado en este caso fue un anti-IgG humano biespecífico y anti-IgM humano marcado con PE en una solución de fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, BSA al 1 %, IgG de ratón al 0,1 %, aprotinina 3,3 UI/L, 0,1 % de benzoato de sodio, 0,095 % de azida de sodio y 0,3 % de ProClin a pH 7,4. Después de 10 min de incubación, las perlas se lavaron por segunda vez en tampón de lavado que incluía PBS 50 mM y Tween-20 al 0,1 %.

Posteriormente, las perlas lavadas se suspendieron en fluido envolvente (solución salina tampón fosfato (PBS) que contenía ProClin 300 al 0,3 % y azida de sodio al 0,095 %) y se enviaron al detector. La firma del tinte fluorescente y la presencia de anticuerpos unidos se detectaron para cada perla mediante un citómetro de flujo. Se comparó la señal específica treponémica y/o no treponémica asociada con cada perla con los controles emparejados y se informaron los resultados. La división de la señal de la perla de prueba por la señal ISB (relación fluorescente) puede rectificar la señal dentro y entre las corridas, que incluye los controles de estabilidad y fluctuaciones del detector.

En las Tablas 1 y 2 se incluye una comparación de los resultados obtenidos de la prueba combinada y los de los comparadores.

Tabla 2

Para las muestras de sífilis diagnosticadas médicamente, se observó una excelente concordancia entre las infecciones primarias secundarias y latentes no tratadas y tratadas clínicamente diagnosticadas y la prueba treponémica combinada, así como la prueba comparativa. La prueba de combinación detectó anticuerpos no treponémicos en 20 de 24 muestras de enfermedad primaria tratadas, 14 de 17 muestras de enfermedad secundaria tratadas, 16 de 25 muestras de enfermedad secundaria no tratadas y 5 de 7 muestras de enfermedad latente no tratadas; mientras que la prueba no treponémica de comparación detectó en 17 de 24 enfermedades primarias tratadas, 17 de 17 enfermedades secundarias tratadas, 15 de 25 enfermedades secundarias no tratadas y 6 de 7 muestras de enfermedad latente no tratadas. De las 285 muestras negativas para sífilis, 284 resultaron negativas para anticuerpos treponémicos y 282 para anticuerpos no treponémicos. En general, la prueba de combinación presenta una sensibilidad del 100 % y una especificidad del 99,6 % para el ensayo de anticuerpos treponémicos, y una sensibilidad del 92,7 % y una especificidad del 98,9 % para los ensayos de anticuerpos no treponémicos, respectivamente.

2. Ejemplo 2

En un segundo ejemplo, se evaluó el rendimiento de la prueba combinada treponémica y no treponémica que detecta anticuerpos (tanto IgG como IgM tanto para treponémica como no treponémica) contra el antígeno treponémico y lipoideo mediante el uso de 228 muestras de suero positivas para RPR/VDRL, 226 muestras de suero ordenadas para prueba de sífilis y 122 muestras de suero clínico con estadios de enfermedad conocidos y estado de tratamiento. Posteriormente, los resultados de la prueba combinada se compararon directamente con el ensayo de treponema Diasorin Liaison ™ o el ensayo Fujirebio Serodia ™ TPPA y la prueba de tarjeta BD Macro-Vue ™ RPR (Tablas 3-5).

Para la cohorte de muestras positivas de RPR/VDRL, se observó una concordancia positiva del 99,5 % (211/212) y una concordancia negativa del 100 % (14/14) entre el componente treponémico de la prueba de combinación y el ensayo Liaison™ Treponema, Tabla 3a. Por el contrario, una comparación entre el componente no treponémico de la prueba de combinación y la prueba de tarjeta BD Macro-Vue RPR reveló una concordancia positiva del 99,1 % (217/219) y una concordancia negativa del 71,4 % (5/7), Tabla 3b.

Tabla 3. Comparación directa entre el componente treponémico del ensayo combinado y los ensayos Liaison™ Treponema (3a) y entre el componente del ensayo combinado no treponémico y los ensayos BD Macro-vue™ RPR (3b) mediante el uso de una cohorte de 226 muestras RPR/VDRL positivas.

Tabla 3a

Tabla 3b

En condiciones de ensayo similares, la cohorte de muestras ordenadas para la prueba mostró una concordancia positiva del 93,3 % (28/32) y una concordancia negativa del 97,5 % (193/198) entre el componente treponémico del ensayo de combinación y el ensayo Liaison™ Treponema, Tabla 4a. Dentro de la misma población, la concordancia positiva y negativa entre el componente no treponémico del ensayo combinado y la prueba manual en tarjeta BD Macro-Vue RPR fue del 95 % (19/20) y 99,5 % (207/208) respectivamente, Tabla 4b.

Tabla 4. Comparación directa entre el componente treponémico del ensayo combinado y el ensayo Liaison™ Treponema (2a) y entre el componente del ensayo combinado no treponémico y los ensayos BD Macro-vue RPR (2b) mediante el uso de 228 cohortes de muestras ordenadas.

Tabla 4a

Tabla 4b

Para evaluar la sensibilidad clínica del ensayo de combinación, se analizaron un total de 122 muestras con un estado clínico conocido, Tabla 5. Las muestras procedían de pacientes tratados y no tratados con infección primaria, secundaria y latente. Mientras que las muestras sin tratar exhiben una sensibilidad general del 97,6 % (40/41), las muestras tratadas revelaron una sensibilidad del 95,1 % (77/81) mediante el uso del ensayo treponémico combinado. Cuando se analizó la misma cohorte de muestras en paralelo con el ensayo Fujirebio Serodia™ TPPA, se observó una sensibilidad exactamente equivalente para los grupos tratados y no tratados. Por otro lado, el ensayo de combinación notreponémica reveló una sensibilidad global del 95,1 % (39/41) para el grupo no tratado en comparación con el 86,4 % (70/81) del grupo tratado. Estos resultados contrastan con la prueba de la tarjeta BD Macro-Vue ™ que demostró una sensibilidad general del 95,1 % para el grupo sin tratamiento y del 75,3 % para el grupo tratado. En conjunto, estos resultados sugieren una mayor sensibilidad del ensayo combinado no treponémico.

Tabla 5. Comparación del ensayo de combinación con los ensayos en tarjeta Fujirebio Serodia™ TPPA y BD Macro-Vue™ RPR mediante el uso de 122 muestras de sífilis primaria, secundaria y latente caracterizadas clínicamente.

3. Ejemplo 3: Funcionalización de la superficie de la perla para el recubrimiento con el antígeno no treponémico

La Figura 2 muestra un ejemplo de funcionalización de una perla con el ligando de amina para permitir la interacción iónica con la mezcla de lípidos y antígenos RPR. El ligando cargado positivamente se une primero a las perlas con carboxilo mediante adsorción pasiva o unión covalente para introducir cargas positivas en la superficie de la perla.

Los lípidos (con carga neta negativa debido a la presencia del grupo fosfato) no pudieron acoplarse directamente en las perlas carboxiladas activadas. Para unir cardiolipina, colesterol y lecitina (un trío de lípidos) cambiamos la carga neta en las perlas magnéticas mediante el acoplamiento covalente de un grupo cargado positivamente como la polietilenimina (PEI). Las perlas con el grupo imino catiónico se incubaron luego con lípidos cargados negativamente. La interacción produce un antígeno estable que recubre la superficie de la perla según se evalúa mediante los estudios de estabilidad.

Como se explicó anteriormente, el ligando cargado positivamente puede ser una molécula con función amina. Probamos la capacidad del antígeno no treponémico (RPR) para unirse a las perlas recubiertas con etilendiamina, polietilenimina (PEI) y polilisina.

Tabla 6: Rendimiento de las perlas funcionalizadas con el componente indicado

Las perlas se funcionalizaron con etilendiamina, poli(etilenimina) o polilisina y se recubrieron con RPR. Las perlas recubiertas se expusieron después a muestras positivas de anticuerpos RPR (5 filas superiores) o muestras negativas de anticuerpos (5 filas inferiores). En este ensayo, las perlas funcionalizadas con poli(etilenimina) (PEI) generalmente obtuvieron los mejores resultados, con lecturas más altas para las muestras positivas y lecturas de fondo bajas para las muestras negativas.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un kit que comprende:

(i) perlas recubiertas con antígeno de cardiolipina-lecitina-colesterol; y

(ii) perlas recubiertas con el antígeno de Treponema pallidum,

en el que (i) y (ii) se envasan mezcladas en el mismo recipiente y se almacenan en una solución de almacenamiento que comprende el detergente iónico o zwitteriónico pero que carece de detergente no iónico.

2. El kit de la reivindicación 1, en el que el antígeno de Treponema pallidum es una fusión de r17 y r47.

3. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un anticuerpo antiinmunoglobulina (Ig) humana marcado, preferentemente, el anticuerpo anti-Ig humana marcado es específico para IgG o IgM.

4. El kit de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo antiinmunoglobulina humana marcado es un conjugado de anticuerpo que se une a IgG humana e IgM humana.

5. El kit de la reivindicación 3, que comprende un primer anticuerpo anti-Ig humana marcado, específico para IgG y un segundo anticuerpo anti-Ig humana marcado, específico para IgM, preferentemente (a) el primer y el segundo anticuerpos anti-Ig humana marcados tienen el mismo marcador, o (b) el primer y el segundo anticuerpos anti-Ig humana marcados tienen marcadores diferentes.

6. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las perlas de (i)

(a) son catiónicas y el antígeno de cardiolipina-lecitina-colesterol se une a las perlas mediante una interacción iónica; y/o

(b) están funcionalizadas con polietilenimina (PEI).

7. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las perlas de (ii) están unidas al antígeno de Treponema pallidum a través de una interacción covalente.

8. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las perlas de (i) y (ii) están marcadas de manera diferente, son de diferentes tamaños o de diferentes pesos.

9. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el kit comprende, además

(a) una solución de lavado o solución madre de lavado que comprende solución salina tamponada con fosfato (PBS), preferentemente la solución de lavado o solución madre de lavado comprende detergente no iónico; y/o (b) al menos una de (iii) las perlas recubiertas con los anticuerpos específicos para el factor de coagulación XIII (anti-FXIII) y (iv) las perlas recubiertas con tetrametilrodamina.

10. Un procedimiento para detectar la presencia de anticuerpos contra la sífilis en una muestra que comprende:

(a) poner en contacto la muestra con (i) las perlas recubiertas con el antígeno de cardiolipina-lecitina-colesterol y (ii) las perlas recubiertas con el antígeno de Treponema pallidum mezclado en el mismo recipiente, y formar así una mezcla de muestra y perlas, en la que el contacto se realiza en presencia de detergente iónico o zwitteriónico, pero en ausencia de detergente no iónico;

(b) lavar la mezcla de muestra y perlas para eliminar la muestra no unida;

(c) poner en contacto la mezcla de muestra y perlas con un anticuerpo antiinmunoglobulina (Ig) humana marcado; y

(d) detectar la presencia de anticuerpos contra la sífilis al detectar el marcador en el anticuerpo anti-Ig humana.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, que comprende además lavar para eliminar el anticuerpo anti-Ig humana marcado no unido entre las etapas (c) y (d).

12. El procedimiento de la reivindicación 10 u 11, en el que la etapa de contacto (c) se realiza

(i) en ausencia de detergente no iónico; y/o

(ii) en presencia de detergente iónico o zwitteriónico.

13. El procedimiento de las reivindicaciones 10 a 12, en el que

(i) el anticuerpo anti-Ig humana marcado es específico para IgG o IgM; y/o

(ii) el anticuerpo antiinmunoglobulina humana marcado es un conjugado de anticuerpo que se une a la IgG humana e IgM humana.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la etapa (c) comprende poner en contacto la mezcla de muestra y perlas con un primer anticuerpo anti-Ig humana marcado específico para IgG y un segundo anticuerpo anti-Ig humana marcado específico para IgM, preferentemente

(i) el primer y el segundo anticuerpos anti-Ig humana tienen el mismo marcador; o

(ii) el primer y el segundo anticuerpos anti-Ig humana tienen diferentes marcadores.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que el antígeno de Treponema pallidum es una fusión de r17 y r47.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en el que las perlas son de (i)

(a) son catiónicas y el antígeno de cardiolipina-lecitina-colesterol se une a las perlas mediante una interacción iónica; y/o

(b) están funcionalizadas con polietilenimina.

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, en el que las perlas de (ii) se unen al antígeno de Treponema pallidum a través de una interacción covalente.