JP2005069926A - 免疫検査用磁性粒子 - Google Patents

Abstract

【課題】 二次プローブなどの非特異吸着が少ないため、免疫測定において高いS/N比と測定精度が得られ免疫検査用磁性粒子を得る。
【解決手段】 免疫検査用の磁性粒子であって少なくともその表面が検査に使用される物質に対して低吸着性の材料で形成されており、さらに粒子表面には検査用プローブとの化学結合に使用可能な官能基を有することを特徴とする免疫検査用磁性粒子。
【選択図】 図なし

Description

本発明は、生化学・医薬品分野での免疫検査用磁性粒子に関する。

磁性粒子は感染症・癌マーカー・ホルモンなどの検査のため、抗原抗体反応を利用した診断薬の反応固相として用いられている。このような診断薬においては、抗体または抗原等の検査用プローブ（一次プローブ）が磁性粒子上に固定化される。サンプル中の検査対象物質は一次プローブを介して磁性粒子上に捕捉された後、第二の検査プローブと反応される。第二の検査プローブ（二次プローブ）は蛍光物質や酵素で標識されており、蛍光や酵素反応によって検出が行われる。近年、疾病の早期発見などの目的のため検査の高感度化が求められており、診断薬の感度向上は大きな課題となっている。磁性粒子を用いた診断薬においても感度向上のため、検出法として酵素発色を用いる方式からより高い感度が得られる蛍光や化学発光を用いる方式へと切り替わりつつある。

これらの検出技術の発展により理論上は一分子の検査対象物質の存在まで検出できるレベルに達しているといわれているが、実際には十分な感度が得られていない。その原因としては、磁性粒子表面への二次プローブや夾雑物の非特異的な吸着があげられる。例えば理論上一分子の検査対象物質を検出可能な検査技術であっても、数分子の二次プローブが磁性粒子表面に非特異的に吸着してしまえば一分子検出は不可能である。このようなことから磁性粒子表面への検査に使用される物質に対して非特異的な吸着の抑制が強く求められている。

従来、このような非特異吸着の抑制法として、ブロッキングと言われる方法が行われてきた。ブロッキングは、一次プローブを磁性粒子上に固定化した後に、二次プローブや夾雑物等の吸着の少ないアルブミンやスキムミルクなどのブロッキング剤で磁性粒子表面を被覆する。しかし、ブロッキング剤の被覆効果が十分得られない場合や、生体物質であるブロッキング剤の品質安定性の問題、ブロッキングが十分に行われた場合でもブロッキング剤の変質などによってその作用が経時的に変化し非特異吸着が発生するといった問題点があり、十分な非特異吸着の抑制効果は得られていなかった。

非特異吸着の問題を解決するための方法として、96ウェルプレートに代表される免疫測定用基材の表面に親水性ポリマーを導入する方法が提案されている（特開平11-174057、特開2000-304749、特開2001-272406）。しかし、このような平面を利用した免疫測定用基材では、一次プローブを固相する面積が限られること、また、固液反応のため抗原抗体反応の効率が悪く検査時間が長くなることなどの欠点があった。

特開平11-174057公報

特開2000-304749公報 特開2001-272406公報

本発明は、このような従来の問題点を解決するために、検査に使用される物質に対して低吸着性表面をもつ磁性粒子により二次プローブや夾雑物の磁性粒子へ非特異吸着を抑制し、従来に比較して高感度の検査を可能とする磁性粒子の提供を目的とするものである。

すなわち本発明は、免疫検査用の磁性粒子であって少なくともその表面が検査に使用される物質に対して低吸着性の材料で形成されており、さらに粒子表面には一次プローブとの化学結合に使用可能な官能基を有することを特徴とする免疫検査用磁性粒子である。

本発明の免疫検査用磁性粒子において、少なくともその表面が検査に使用される物質に対して低吸着性の材料を得るためには、磁性粒子の表面を親水性のポリマーで被覆することにより達成される。磁性粒子表面への二次プローブや夾雑物の非特異吸着は、おもに疎水結合がその重要な役割を果たしており、粒子表面の親水化により非特異吸着を大幅に低減できる。
本発明の免疫検査用磁性粒子において、基材となる磁性粒子には特に制限は無く、特公平０５−１０８０８や特開平７−８２３０１、特表平２−５０１７８５３などの方法で製造した粒子が利用可能であるが、好ましくは磁性粒子が核粒子の表面にＦｅ_２Ｏ_３およびＦｅ_３Ｏ_４の少なくとも一方を含む磁性体層が形成された母粒子に重合により該磁性体層上にポリマー層を形成する磁性粒子を用いることが出来る。磁性粒子の表面に親水性ポリマーを導入する方法としては、（１）磁性粒子の存在下で、親水性モノマーおよびその他の共重合性モノマーを液体中で重合を行う方法、（２）磁性体表面の官能基に親水性ポリマーを結合させる方法等をあげることができる。
（１）の方法としては、磁性粒子の存在下で、主原料としての親水性モノマーおよび必要に応じて官能基を有する共重合性モノマーや他の共重合性モノマー、副原料である重合開始剤、乳化剤、分散剤、界面活性剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤などが必要に応じて添加し、液体中で重合を行う。親水性モノマーとしては、ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、アルコキシアルキル（メタ）アクリレート、ポリオキシアルキレン（Ｃ２−Ｃ４）基含有（メタ）アクリレート、エポキシ基含有（メタ）アクリレート、ホスホリルコリン類似基含有単量体などをあげることができる。官能基を有する共重合性モノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、無類マレイン酸、クロトン酸などのモノまたはジカルボン酸化合物をあげることができる。他の共重合性モノマーとしては、スチレン、ジビニルベンゼンなどの芳香族ビニル単量体、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルなどをあげることができる。
（２）の方法としては、磁性粒子表面に導入されたカルボキシル基またはアミノ基などに対し、アミノ基またはカルボキシル基を持つ親水性ポリマーをカルボジイミドなどの公知の方法により結合させることで本発明の磁性粒子を得ることができる。この場合、検査用プローブを結合できる官能基を持たない親水性ポリマーを利用する場合は、粒子表面の官能基の一分を残したまま親水性ポリマーを結合すれば、検査用プローブとの反応には粒子表面の官能基を用いることも可能である。また、親水性ポリマー中に検査用プローブが結合可能な官能基が存在する場合は、親水性ポリマーまたは粒子上の官能基のいずれにも検査用プローブを結合することが可能である。ここで用いられる親水性ポリマーとしては、ポリ（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸−アルキル（メタ）アクリレート共重合体、ポリヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、ポリメトキシアルキル（メタ）アクリレート、ポリオキシアルキレン（Ｃ２−Ｃ４）基含有（メタ）アクリレート共重合体、ポリエチレンオキシド、リン脂質・高分子複合体など、及びこれらのポリマーの少なくとも一種を側鎖にもつ分岐ポリマーで、そのポリマー鎖中にアミノ基、カルボキシル基、チオール基等を含有するポリマーを上げることができる。

本発明の免疫検査用磁性粒子において、検査に使用される物質の非特異吸着が完全に抑制されノイズがゼロとなることが理想であるが、現実にはシグナルに比較して十分小さなレベルのノイズであればよく、非特異吸着量が０．０５ｐｍｏｌ／ｃｍ^２以下であれば問題はない。

本発明において、検査に使用される物質は免疫検査用試薬および被検査試料に含まれる生理活性物質および化学物質であり、生理活性物質としては、タンパク質、脂質、糖質などを挙げることができる。

本発明の免疫検査用磁性粒子の実際の使用に当たって一次プローブを結合させる方法としては、物理吸着法または化学結合法をあげることができるが、安定的な使用のためには通常一次プローブを磁性粒子表面の官能基と化学的に結合させる。この方法としては、例えば粒子表面のカルボキシル基と一次プローブのアミノ基を反応させる場合はカルボジイミド等の縮合剤を使用することができ、粒子表面のアミノ基と一次プローブのアミノ基を反応させる場合はグルタルアルデヒドを使用することができる。また、エポキシ基やトシル基などの活性基を粒子表面に導入した場合は、一次プローブと粒子を混合するだけで、一次プローブの化学的な結合が達成できる。
一次プローブの結合後、過剰の一次プローブを洗浄し、必要に応じて未反応の官能基を不活化する。不活化剤としては、エタノールアミン、トリスヒドロキシアミノメタン等の水酸基を含有する不活化剤の利用が好ましい。また、一次プローブの結合の後、通常行われるブロッキングの操作は不要であるが、上記不活化の工程にアルブミン等のブロッキング剤を併用してもかまわない。以降は、通常の免疫学的な分析工程に移行すればよい。

本発明の免疫検査用粒子に担持することができるプローブは抗原または抗体であり、検体中に一般に含まれている成分に反応するものであれば特に制限されないが、例えば、アンチプラスミン検査用抗アンチプラスミン抗体、Ｄダイマー検査用抗Ｄダイマー抗体、ＦＤＰ検査用抗ＦＤＰ抗体、ｔＰＡ検査用抗ｔＰＡ抗体、ＴＡＴ検査用抗トロンビン＝アンチトロンビン複合体抗体、ＦＰＡ検査用抗ＦＰＡ抗体等の凝固線溶関連検査用抗原または抗体；ＢＦＰ検査用抗ＢＦＰ抗体、ＣＥＡ検査用抗ＣＥＡ抗体、ＡＦＰ検査用抗ＡＦＰ抗体、フェリチン検査用抗フェリチン抗体、ＣＡ１９−９検査用抗ＣＡ１９−９抗体等の腫瘍関連検査用抗原または抗体；アポリポタンパク検査用抗アポリポタンパク抗体、β２―ミクロブロブリン検査用抗β２―ミクロブロブリン抗体、α１―ミクログロブリン検査用抗α１―ミクログロブリン抗体、免疫グロブリン検査用抗免疫グロブリン抗体、ＣＲＰ検査用抗ＣＲＰ抗体等の血清蛋白関連検査用抗原または抗体；ＨＣＧ検査用抗ＨＣＧ抗体等の内分泌機能検査用抗原または抗体；ＨＢｓ抗原検査用抗ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗体検査用ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体検査用ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ―１抗体用ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ―２抗体検査用ＨＩＶ−２抗原、ＨＴＬＶ―１検査用ＨＴＬＶ−１抗原、マイコプラズマ症検査用マイコプラズマ抗原、トキソプラズマ検査用トキソプラズマ抗原、ＡＳＯ検査用ストレプトリジンＯ抗原等の感染症関連検査用抗原または抗体；抗ＤＮＡ抗体検査用ＤＮＡ抗原、ＲＦ検査用熱変成ヒトＩｇＧ等自己免疫関連検査用抗原または抗体；ジゴキシン検査用抗ジゴキシン抗体、リドカイン検査用抗リドカイン抗体等の薬物分析用抗原または抗体などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。抗体としてはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。

本発明の磁性粒子は二次プローブなどの非特異吸着が少ないため、免疫測定において高いS/N比と測定精度が得られ免疫検査用磁性粒子として優れていることがわかる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。

１．核粒子の作製
特公昭５７−２４３６９号公報記載の膨潤重合法、ジャーナル オブポリマーサイエンス ポリマーレター エディション（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌｅｔｔｅｒ Ｅｄ．）記載の重合方法、あるいは本発明者らが先に提案した重合方法（特開昭６１−２１５６０２、同６１−２１５６０３、同６１−２１５６０４）を参考に下記核粒子を作製した。下記核粒子は、重合後遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥、粉砕した。

核粒子；メチルメタクリレート／ジビニルベンゼン＝８０／２０共重合体
(平均粒子径１．５μｍ ＣＶ値２．２％)
２．核粒子への磁性体の被覆（磁性体層の形成）
油性磁性流体「ＦＶ５５」［松本油脂（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性体（平均粒子径：０．０１μｍを得た。なおこの磁性体は界面活性剤により疎水化処理された表面を有するものである。得られた磁性体をトルエン／水（重量比１：１）に添加し、十分に攪拌した後静置したところ、磁性体はトルエンのみに分散されており、表面が疎水化されたことを確認した。ついで、核粒子５ｇに、疎水化された磁性体を５ｇ混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムNHS−０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度100m/秒（16200rpm）で３分間処理した。
３．母粒子の表面のコーティング重合（コーティングポリマー層の形成）
磁性体被覆粒子３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液３７５ｇと、アニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液３７５ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。ついで、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下６０℃とした。これに、モノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート１５ｇ、メタクリル酸１．５ｇ、ジビニルベンゼン０．６ｇ、２−ヒドロキシエチルメタクリレート１．５ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）１．５ｇ、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液７５ｇおよびアニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液７５ｇの混合物を１０℃以下において超音波微分散により乳化させて、２時間にわたり連続添加して反応させた。その後、さらに温度を８０℃とし３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。粒径は２．１μm、粒子比重は１．６ｇ／ｃｍ^３であった。

実施例１のシクロヘキシルメタクリレートをスチレンに、２−ヒドロキシエチルメタクリレートを２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとした以外は全て実施例１の方法に基づいて実施した。粒径は２．１μm、粒子比重は１．６ｇ／ｃｍ^３であった。

磁性粒子（Spherotech社、粒径２〜２.９μm）３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液３７５ｇと、アニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液３７５ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。ついで、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ_２ガス気流下６０℃とした。これに、モノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート１５ｇ、メタクリル酸１．５ｇ、ジビニルベンゼン０．６ｇ、ヒドロキシ（オリゴエチレングリコールｎ＝４）メタクリレート１．５ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）１．５ｇ、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液７５ｇおよびアニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液７５ｇの混合物を１０℃以下において超音波微分散により乳化させて、２時間にわたり連続添加して反応させた。その後、さらに温度を８０℃とし３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。粒径は２．６μm、粒子比重は１．３ｇ／ｃｍ^３であった。
比較例１

実施例１で2−ヒドロキシエチルメタクリレートを用いなかった以外は全て実施例１の方法に基づいて実施した。粒径は２．１μm、粒子比重は１．６ｇ／ｃｍ^３であった。
比較例２

磁性粒子（Spherotech社、粒径２〜２.９μm）を用いた。粒径は２．５μm、粒子比重は１．３ｇ／ｃｍ^３であった。
二次プローブ吸着の評価
二次プローブの非特異吸着性の評価のため、実施例１〜３および比較例１〜２の磁性粒子０．１ｍｇに、酵素標識したアルカリフォスファターゼコンジュゲート抗ＡＦＰ抗体（抗体濃度２．５μg／ｍＬ、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）１００μLを加えて攪拌し、室温で１０分放置した。磁気分離法により免疫測定用粒子をリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄を行った。この粒子にＡＭＰＰＤ２００μg／ｍＬを含む基質液１００μLを加え攪拌の後、１０分間放置後、ルミノメータ（ベルトールド社製）で測定し、発光量から蛋白吸着量を求め、粒子の粒径と比重から表面積を算出し、粒子単位体積あたりの蛋白吸着量を算出した。結果を図１に示した。
免疫測定による評価
実施例１〜３および比較例１〜２で得られた診断薬用粒子の１００ｍｇを１０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６）５ｍLに分散させ、これに水溶性カルボジイミド５ｍｇを加えた。室温で30分間反応させた後、上清を除去し、抗ＡＦＰマウスIgG抗体溶液（１ｍｇ/ｍL、１０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６））を１０ｍL加え、室温で回転攪拌機にて2時間攪拌した。2時間後、上清を除去し、粒子を実施例１〜３では５０ｍMトリス−HCｌ緩衝液（ｐH７．５）を１０ｍL加え、比較例１〜２ではブロッキングのため０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝塩溶液（ｐH 7.4）を１０ｍL加え室温で回転攪拌機にて2時間攪拌した。その後、実施例、比較例ともにリン酸緩衝液（ｐH 7.4）で４回洗浄後、粒子濃度が０．５重量％となるようにリン酸緩衝液（ｐH 7.4）に再分散し、抗ＡＦＰＩｇＧ結合磁性粒子（免疫測定用粒子）とした。

この免疫測定用粒子１０μLに０〜１０００ｎｇ／ｍＬのＡＦＰを含むサンプル５０μLを加えて攪拌し、室温で10分放置した。磁気分離法により免疫測定用粒子をリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄を行った。

次に、アルカリフォスファターゼコンジュゲート抗ＡＦＰ抗体（抗体濃度２．５μg／ｍＬ、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を１００μL加えて攪拌し、室温で１０分放置した。これを前述の磁気分離法により洗浄を行った。この粒子にＡＭＰＰＤ２００μg／ｍＬを含む基質液１００μLを加え攪拌の後、１０分間放置後、ルミノメータ（ベルトールド社製）で測定した。各種抗原濃度でのシグナル強度を表1に示す。

実施例および比較例における蛋白吸着量を示すグラフ。

Claims (4)

1. 免疫検査用の磁性粒子であって少なくともその表面が検査に使用される物質に対して低吸着性の材料で形成されており、さらに粒子表面には検査用プローブとの化学結合に使用可能な官能基を有することを特徴とする免疫検査用磁性粒子。
2. 検査に使用される物質が免疫検査用試薬および被検査試料に含まれる生理活性物質および化学物質であることを特徴とする請求項１に記載の免疫検査用磁性粒子。
3. 検査に使用される物質の吸着量が０．０５ｐｍｏｌ／ｃｍ^２以下である請求項１に記載の免疫検査用磁性粒子。
4. 磁性粒子が核粒子の表面にＦｅ_２Ｏ_３およびＦｅ_３Ｏ_４の少なくとも一方を含む磁性体層が形成された母粒子に重合により該磁性体層上にポリマー層を形成する磁性粒子である請求項１または２に記載の免疫検査用磁性粒子。
   

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