JPH05297002A - 免疫凝集反応の増感方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 この発明は、免疫凝集反応の増感方法に関
し、いわゆるラテックス凝集反応を行う際、特定の構造
式を有するポリエチレングリコール脂肪酸モノエステル
を共存させることで、該凝集反応を増感させる方法を提
供することを目的とする。 【構成】 被検試料中に存在する抗原または抗体と、水
不溶性担体に結合させた抗体または抗原とを接触させ
て、免疫反応（抗原・抗体反応）に伴う凝集によって被
検試料中の抗原または抗体を測定する方法において、下
記一般式（１）で示されるポリエチレングリコール脂肪
酸モノエステルの存在下で前記免疫反応を行う。 一般式（１）：Ｃ_n Ｈ_m ＣＯＯ−（−ＣＨ₂ ＣＨ₂ Ｏ
−）_x −Ｈ （ｎ＝１１〜２１，ｍ＝２３〜４２，ｘ＝８〜７０）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、免疫凝集反応の増感
方法に関し、更に詳しくは、いわゆるラテックス凝集反
応を行う際、特定の構造式を有するポリエチレングリコ
ール脂肪酸モノエステルを共存させることで、該凝集反
応を増感させる方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、臨床診断の免疫凝集反応の分野で
広範に利用されているラテックス凝集法は、ポリスチレ
ン微粒子（いわゆるラテッククス）を担体粒子として用
い、抗原抗体反応による凝集像を、該担体粒子どうしの
凝集像に置き換えることにより増感する抗原抗体反応の
検出法である。この方法は、抗原（抗体）を吸着（ある
いは結合）させたラテックス粒子量を一定にした場合、
凝集に伴う濁度の変化を目視的あるいは分光学的に検出
することにより、測定対象である抗体（抗原）濃度を半
定量的あるいは定量的に測定することが可能である。測
定対象も多岐にわたっており、特に近年は医療技術の進
歩により、より高感度で、かつ広範囲な濃度に対応でき
る測定系が求められている。例えば定量的測定に使用す
るラテックス粒子の粒径を特定な範囲に規定する方法、
大粒径のラテックス粒子と小粒径のラテックス粒子を混
合して測定レンジを拡大する方法、界面活性剤等を添加
する方法（特開昭６０−５３８４６号、特開平１−１１
８７７０号、特開平２−２５７０６３号）等がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ラテッ
クス粒子の粒径が大きくなると凝集速度は増すが測定範
囲が狭まり、逆に粒径が小さくなると測定範囲が広がる
が凝集速度が低下してしまう。また、大小の粒径のラテ
ックス粒子を混合する場合、単独で用いたときの問題点
をある程度解消できるものの、それぞれの粒径の混合割
合の管理の煩雑さや、ロット間による再現性の面で問題
を残している。更に、特開平１−１１８７７０号に開示
されている特定の界面活性剤でも十分な効果は得られて
いない。

【０００４】

【問題点を解決するための手段】本願発明は、以上の欠
点を解消するためになされたもので、特定の構造式を有
するポリエチレングリコール脂肪酸モノエステルにより
該凝集反応を増感させる方法である。本願は次の（イ）
〜（ハ）の記載する請求項から構成されている。 （イ）被検試料中に存在する抗原または抗体と、水不溶
性担体に結合させた抗体または抗原とを接触させて、免
疫反応（抗原・抗体反応）に伴う凝集によって被検試料
中の抗原または抗体を測定する方法において、下記一般
式（１）で示されるポリエチレングリコール脂肪酸モノ
エステルの存在下で前記免疫反応を行うことを特徴とす
る免疫凝集反応の増感方法。 一般式（１）：Ｃ_n Ｈ_m ＣＯＯ−（−ＣＨ₂ ＣＨ₂ Ｏ
−）_x −Ｈ （ｎ＝１１〜２１，ｍ＝２３〜４２，ｘ＝８〜７０） （ロ）ポリエチレングリコール脂肪酸モノエステルを終
濃度として、０．０１％〜８％、好ましくは０．０５〜
６％となるように反応系に存在させる前記（イ）に記載
する免疫凝集反応の増感方法。 （ハ）ポリエチレングリコール脂肪酸モノエステルが、
ポリエチレングリコールモノオレイルエステル、ポリエ
チレングリコールモノステアリルエステル、ポリエチレ
ングリコールモノラウリルエステル、ポリエチレングリ
コールモノアラキルエステル、ポリエチレングリコール
モノパルミチルエステル、ポリエチレングリコールモノ
パルミトオレイルエステル、ポリエチレングリコールモ
ノミリスチルエステルである前記（イ）及び（ロ）に記
載する免疫凝集反応の増感方法。

【０００５】本願発明で用いられる前記一般式（１）の
非イオン界面活性剤は、特定の構造式を有するポリエチ
レングリコール脂肪酸モノエステルである。一般式
（１）において、ｎは１１〜２１（好ましくは１５〜１
９）、ｍは２３〜４２（好ましくは２９〜３９）であ
り、また、ｘは８〜７０（好ましくは１０〜６５）であ
る。またこのときの非イオン界面活性剤のＨＬＢ値は１
３〜１８である。疎水基部分を構成する脂肪酸基は飽和
脂肪酸または不飽和脂肪酸のどちらでもよい。具体的に
は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステア
リン酸、アラキン酸、ベヘン酸（飽和型）、またはリン
デル酸、ラウロレイン酸、ツヅ酸、フィセトレイン酸、
ミリストレイン酸、パルミトオレイン酸、ペトセロリン
酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール
酸、リノレン酸、エレオステアリン酸、ブニカ酸、バリ
ナリン酸、カドレイン酸、セトレイン酸、エルカ酸、ア
ラキドン酸（不飽和型）等を挙げることができる。 こ
れらの好ましい物質としては、ポリエチレングリコール
モノオレイルエステル、ポリエチレングリコールモノス
テアリルエステル、ポリエチレングリコールモノラウリ
ルエステル、ポリエチレングリコールモノアラキルエス
テル、ポリエチレングリコールモノパルミチルエステ
ル、ポリエチレングリコールモノパルミトオレイルエス
テル、ポリエチレングリコールモノミリスチルエステル
等が挙げられる。これらのポリエチレングリコール脂肪
酸モノエステルを終濃度として、０．０１％〜８％、好
ましくは０．０５〜６％となるように反応系に存在させ
る。このとき、ポリエチレングリコール脂肪酸モノエス
テルは、水あるいは緩衝液に適宜溶解して用いることが
できる。緩衝液としては、例えばトリス−塩酸緩衝液、
リン酸緩衝液等を用いることができる。

【０００６】水不溶性担体としては、従来公知のポリス
チレン粒子を用いればよい。また、粒子表面にカルボキ
シル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基等を導入
したポリスチレン粒子を用いることもできる。その粒径
は０．０５〜０．８μｍが適している。

【０００７】測定対象としては、生体液中に含まれる免
疫グロブリン、蛋白、ホルモン類、及び薬物であり、生
体液とは血液、尿、髄液等である。

【０００８】測定に際しては、抗原あるいは抗体を公知
の手段によって結合させたラテックス粒子と測定対象を
含む被検試料を液中にて接触させ、抗原抗体反応を行
う。そして、本発明のポリエチレングリコール脂肪酸モ
ノエステルを、該反応の前、または同時、または直後に
所望濃度を存在させ、該反応によって生じる濁度を好ま
しくは分光学的手段によってその量を測定すればよい。
具体的には、例えば抗原含有被検試料とポリエチレング
リコール脂肪酸モノエステル含有溶液を混合し、そこに
抗体を結合させたラテックス分散液の一定量を添加した
後、適当な波長（例えば４００〜１０００ｎｍの任意の
波長）で濁度の変化量を測定する。

【０００９】このように構成することによって、ポリエ
チレングリコール脂肪酸モノエステルを添加しないもの
に比較して、測定凝集速度は約１０〜１５倍に増加させ
ることができ、また本発明のポリエチレングリコール脂
肪酸モノエステル以外の非イオン界面活性剤である、例
えば高級アルコールをエーテル結合させた同一重量濃度
のポリエチレングリコール高級アルコールエーテルと比
較しても、測定凝集速度を約３倍に増加させることがで
きる。

【００１０】

【実施例】

＜実施例１＞ＦＤＰの検出 （１）抗体結合ラテックスの調製 ポリスチレン粒子（日東電工社製、粒径０．２４μｍ）
に公知の手段により、抗ＦＤＰマウスモノクローナル抗
体（ヤトロン社製）を粒子表面に共有結合させた。すな
わち、カルボキシル基導入ラテックスに、１−メチル−
３−（３−ジメチルアミノプロリル）−カルボジイミド
塩酸塩（同仁化学研究所）を添加した後、抗体溶液を加
え、一夜反応させる。遠心操作にて未結合の抗体を除き
緩衝液に再懸濁し、抗体結合ラテックスを得た。 （２）ＦＤＰ抗原溶液の調整 ＦＤＰ溶液は、Ｏｌｅｘａ等の方法（Ａｍ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．，１８，９９１〜９９５，１９７９）に従い調
製した。すなわち、ヒトフィブリン（カビ社）溶液に、
牛トロンビン（持田製薬社）を加え、フィブリンクロッ
トを作った。これを破砕し、緩衝液に懸濁し、ヒトプラ
スミン（カビ社）を加え反応させた後、遠心上澄みを回
収し、ＦＤＰ溶液を得た。ＦＤＰ量は２８０ｎｍにおけ
る１％濃度の分子吸光係数を１８．１として計算した。
そして、１２８μｇ／ｍｌから、０．５μｇ／ｍｌの希
釈列を調製し、測定に用いた。 （３）界面活性剤含有溶液の調製 ポリエチレングリコールモノオレイルエステル（商品
名：ＭＯ−６００、三洋化成製、ＨＬＢ：１３．７）を
１〜６ｗ／ｖ％範囲内で、０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ
８．２）で種々調製した。 （４）操作法 界面活性剤含有のトリス緩衝液２５０μｌとＦＤＰ抗原
希釈液５μｌを３７℃にて混合し、抗体結合ラテックス
分散液７０μｌを添加し、直ちに攪拌しながら９０秒
間、５秒ごとに波長７００ｎｍにおける濁度を測定し、
１分間当たりの濁度の変化量を求めた。結果を図１に示
す。 （５）図１によれば、ＭＯ−６００を１〜５％添加すれ
ば、無添加の標準曲線と比較して、約２倍（１％添加）
〜１５倍（５％添加）の凝集速度の増加が認められる。
また５％添加までは、濃度依存的に凝集速度が増加して
いるが、６％添加した場合には、ＭＯ−６００の添加濃
度が過剰となったことを示している。更に標準曲線の最
大凝集速度は、無添加の場合１６０ｍＡｂｓ／ｍｉｎ．
程度を示すのに対し、２％〜５％添加の場合、２０５〜
２４０ｍＡｂｓ／ｍｉｎ．程度と増加し、測定範囲を広
げることができることも明らかになった。

【実施例】

【００１１】＜実施例２＞実施例１のＭＯ−６００に替
えて、ポリエチレングリコールモノオレイルエステル
（商品名：ＥＳ−１６９、第一工業製薬製、ＨＬＢ：１
６）を０．５〜３．０ｗ／ｖ％となるよう種々調製し、
実施例１と同様の操作を行った。結果を図２に示す。図
２によれば、ＥＳ−１６９は、２．５％添加の場合に無
添加の場合に比較して約１０倍と、最も凝集速度が増加
し、３％濃度の添加で過剰となった。またこの範囲の添
加濃度において、凝集速度の濃度依存性、及び測定範囲
を広げる効果共ＭＯ−６００と同様に認められた。界面
活性剤ＭＯ−６００は、ＨＬＢ１３．７のポリエチレン
グリコールモノオレイルエステルで構成されているのに
対し、ＥＳ−１６９は、ＨＬＢ１６のポリエチレングリ
コールモノオレイルエステルで構成されているので、Ｅ
Ｓ−１６９は、ＭＯ−６００よりポリエチレングリコー
ル鎖の分子量のみが大きい。従って、ポリエチレングリ
コール鎖の分子量のみが異なる類縁物質にも、ＭＯ−６
００及びＥＳ−１６９と同様に凝集速度を増加させ、測
定範囲を広げる効果が存在することが認められる。

【００１２】

【実施例】

＜実施例３＞同様にポリエチレングリコールモノステア
リルエステル（商品名：Ｓ−１５．４、日本油脂製、Ｈ
ＬＢ：１６．７）を１．０〜５．０ｗ／ｖ％となるよう
種々調製し、同様の操作を行った。結果を図３に示す。
図３によれば、Ｓ−１５．４は、４．０％添加の場合
に、無添加の場合と比較して約７倍と最も凝集速度が増
加し、凝集速度の濃度依存性や、測定範囲を広げる効果
は、ＭＯ−６００及びＥＳ−１６９と同様にみいだされ
た。Ｓ−１５．４は、ＨＬＢ１６．７のポリエチレング
リコールモノステアリルエステルで構成されており、Ｍ
Ｏ−６００及びＥＳ−１６９とは、アルキル側鎖がオレ
イン酸ではなくステアリン酸由来である点が大きく異な
っている。また、データには示さないが、Ｓ−１５．４
に対し、ポリエチレングリコール鎖の分子量の小さいＨ
ＬＢ１５．６の界面活性剤Ｓ−１０においてもほぼ同様
の結果を得た。従って、ポリエチレングリコール鎖（脂
肪酸）の分子量のみが異なる類縁物質にも、ＭＯ−６０
０及びＥＳ−１６９と同様に凝集速度を増加させると共
に測定範囲を広げる効果が存在することが認められる。
また、ポリエチレングリコールモノアラキルエステル、
ポリエチレングリコールモノパルミチルエステル、ポリ
エチレングリコールモノパルミトオレイルエステル、ポ
リエチレングリコールモノミリスチルエステルについて
もその凝集速度を増加させる効果が、同様に認められ
た。

【００１３】＜比較例＞実施例１〜３の各界面活性剤の
２ｗ／ｖ％液とポリエチレングリコールモノオレイルエ
ーテル（商品名：エマルゲン４２０（Ｅ−４２０）、花
王石けん製、ＨＬＢ：１３．６）及びポリエチレングリ
コールラウリルエーテル（商品名：Ｂｒｉｊ３５、花王
石けん製、ＨＬＢ：１６．９）の各２ｗ／ｖ％溶液を用
いて同様の操作を行った。結果を図４に示す。 （１）図４によれば、従来法と本発明の方法では、各界
面活性剤の添加濃度を同一にした場合、ラテックス凝集
濃度に及ぼす効果は、本発明の方が優れていることが認
められる。データは示さないが、Ｅ−４２０は、６．０
％添加のときに最大の効果が得られるが、無添加の場合
と比較して約５．５倍程度であり、本発明の方法の約７
〜１５倍という凝集速度増加効果に及ばなかった。Ｂｒ
ｉｊ３５も同様に、本発明の効果に及ばなかった。

【００１４】前記比較例に示したエーテル結合型の界面
活性剤が凝集速度を増加させることに関しては、ベーリ
ングヴェルケ・アクチェンゲゼルシャフトにより特許出
願が（特開平１−１１８７７０号）なされている。しか
しながら、以上の実施例及び比較例から、エーテル結合
型よりも本願発明のエステル結合型（特にポリエチレン
グリコールのモノオレイルエステル）が凝集速度を増加
させる効果に関して、最も適していることが認められ
る。また凝集速度の増加と同時に最大凝集速度の値も増
加させる効果を有していることが認められる。この現象
についても、ポリエチレングリコールモノオレイルエス
テルが最も適している。

【発明の効果】本願の免疫凝集反応の増感方法は、以上
のように構成したから、臨床診断の免疫凝集反応の分野
で広範に利用されているラテックス凝集法の感度を著し
く増加させることができ、測定範囲を広げることができ
るという効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＭＯ−６００添加濃度がラテックス凝集速度に
及ぼす効果を示す図である。

【図２】ＥＳ−１６９添加濃度がラテックス凝集速度に
及ぼす効果を示す図である。

【図３】Ｓ−１５．４がラッテックス凝集速度に及ぼす
効果を示す図である。

【図４】本発明の方法とＥ−４２０及びＢｒｉｊ３５が
ラッテックス凝集速度に及ぼす効果を示す図である。

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【手続補正書】

【提出日】平成４年６月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検試料中に存在する抗原または抗体
   と、水不溶性担体に結合させた抗体または抗原とを接触
   させて、免疫反応（抗原・抗体反応）に伴う凝集によっ
   て被検試料中の抗原または抗体を測定する方法におい
   て、下記一般式（１）で示されるポリエチレングリコー
   ル脂肪酸モノエステルの存在下で前記免疫反応を行うこ
   とを特徴とする免疫凝集反応の増感方法。 一般式（１）：Ｃ_n Ｈ_m ＣＯＯ−（−ＣＨ₂ ＣＨ₂ Ｏ
   −）_x −Ｈ （ｎ＝１１〜２１，ｍ＝２３〜４２，ｘ＝８〜７０）
2. 【請求項２】 ポリエチレングリコール脂肪酸モノエス
   テルを終濃度として、０．０１％〜８％、好ましくは
   ０．０５〜６％となるように反応系に存在させる請求項
   １に記載する免疫凝集反応の増感方法。
3. 【請求項３】 ポリエチレングリコール脂肪酸モノエス
   テルが、ポリエチレングリコールモノオレイルエステ
   ル、ポリエチレングリコールモノステアリルエステル、
   ポリエチレングリコールモノラウリルエステル、ポリエ
   チレングリコールモノアラキルエステル、ポリエチレン
   グリコールモノパルミチルエステル、ポリエチレングリ
   コールモノパルミトオレイルエステル、ポリエチレング
   リコールモノミリスチルエステルである請求項１及び請
   求項２に記載する免疫凝集反応の増感方法。