CN101310186B - 测定抗原的方法和用于其的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及测定抗原的方法和用于其的试剂盒，通过使用共价结合于水溶性聚合物的抗体作为用于均匀体系中的竞争性免疫凝集测定法的抗体，可以不依靠稀释精确地测定未稀释体系中的高浓度蛋白抗原。
Description
技术领域
本发明涉及测定抗原的方法和用于其的试剂盒。更具体地，本发明涉及通过均匀体系中的竞争性免疫凝集测定法测定样品中抗原的方法，其中该方法适合于测定抗原例如白蛋白，一种以高浓度存在于生物样品中的蛋白质，并且涉及用于所述方法的试剂盒。
背景技术
已知比浊免疫测定法例如胶乳比浊免疫测定法为测定存在于血液样本中的蛋白质的方法之一。因为这种方法能够在短时间内测定大量样本，它们被广泛用于实验室检验领域。然而，在使用这种方法尝试测定以约10-3M的高浓度存在于血液中的蛋白质例如白蛋白时，产生了各种问题。特别地，在那种情况下，测定前的操作是复杂的，因为必须在使用前将作为样本收集的血液分析物稀释。此外，这种方法需要使用大量的抗体作为测量试剂，使得测量试剂成本更高。另外，容易发生前带现象，因此在高浓度区域测定也许是不可能的。结果是，通过比浊免疫测定法测定未稀释体系中的蛋白质还未用于实际应用。
同时，与比浊免疫测定法相关联，已知均匀体系中的竞争性免疫凝集测定法为免疫测定法之一(专利文件1、2和3)。均匀体系中的竞争性免疫凝集测定法是基于细颗粒上带有的抗原与抗体之间的抗原-抗体反应所产生的凝集程度而定量测定被测抗原的方法，该方法包括以下步骤：将包含被测抗原的样本、针对该抗原的抗体、和带有能够 结合于该抗体的抗原的细颗粒混合，和使样品中的抗原和细颗粒带有的抗原之间竞争与抗体的抗原-抗体反应。这个方法的优点在于可以通过各种努力测定低浓度的抗原，因此研究是从这个视角进行的。然而，在使用这个方法测定高浓度的蛋白质时，在生成校正曲线时，当被测蛋白质的浓度为0时，测量空白超过可测量的上限。因此，测定变得不可能。因此，几乎没有研究来通过这个方法测定高浓度蛋白质，结果是，该方法仍未用于实际应用。
专利文献1：JP-A-57-206859专利文献2：JP-A-58-500874专利文献3：JP-A-2002-296281
发明公开
因此，本发明涉及使用通常很少用于测定高浓度的抗原的、均匀体系中的竞争性免疫凝集测定法测定未稀释体系中的抗原的方法，和涉及用于该测定方法的试剂盒。
在这种情况下，为了解决这些问题，本发明人对从未从测定高浓度蛋白质的方面考虑过的、通过均匀体系中的竞争性免疫凝集测定法测定样本中的白蛋白进行了研究。结果，意外地发现，当将共价结合于水溶性聚合物的抗体用作均匀体系中竞争性免疫凝集测定法的抗体时，可以不依靠稀释准确地测定未稀释体系中的高浓度白蛋白。由此完成了本发明。
因此，本发明涉及通过均匀体系中的竞争性免疫凝集测定法测定抗原的方法，包括以下步骤：将包含被测抗原的样品、针对该抗原的抗体、和带有与被测抗原相同的抗原或该抗原类似物的细颗粒混合，所述类似物可以与所述抗体发生抗原-抗体反应；使样品中的抗原和细颗粒带有的与被测抗原相同的抗原或细颗粒带有的抗原类似物之间竞争与抗体的抗原-抗体反应；和基于抗体与细颗粒带有的与被测抗原相同的抗原或细颗粒带有的抗原类似物的抗原-抗体反应所产生的凝集程度定量地测定被测抗原，所述方法的特征在于抗体共价结合于水溶性聚合物。
此外，本发明涉及用于测定抗原的试剂盒，包括针对被测抗原的抗体和细颗粒，所述抗体共价结合于水溶性聚合物，所述细颗粒带有与被测抗原相同的抗原或该抗原的类似物，所述类似物可以进行与抗体的抗原-抗体反应。
本发明的测定方法可以进行以高浓度存在于生物样品中的蛋白质抗原例如白蛋白的免疫测定法而不发生前带现象、以及无须稀释样本、少量使用作为测量试剂的昂贵的抗体。
附图简述
图1表示通过本发明的方法制备的校正曲线；图2表示本发明的方法与TIA方法之间的相关性的血清白蛋白测量结果。
发明详述
本发明的测定方法基于这样的原理，即，在竞争性免疫反应中，在其它组分溶于水时，反应试剂或产物中的任何一个具有混浊度。以下举例说明该原理。将以下对象用于作为反应试剂混合：(i)得自样品的抗原；(ii)与(i)的抗原相同的抗原或该抗原的类似物与细颗粒的结合物；和(iii)作为试剂的抗体。(i)的抗原、(ii)的结合物和(iii)的抗体都可溶解于水或者能够称为均匀的分散体。然后将它们混合以进行抗原-抗体反应，其引起竞争性形成以下抗原-抗体复合物：(iv)：(ii)的结合物和(iii)的抗体的复合物；和(v)：(i)的抗原与(iii)的抗体的复合物。(iv)的复合物不溶于水，其引起混浊，而(v)的复合物可溶于水。因此，随着(iv)的复合物形成越多，在反应溶液的混浊度增加。在这个竞争性反应中，(i)的抗原与(ii)的结合物，对有限量的(iii)抗体发生竞争反应，并且由此减少得到的(iv)的不溶性复合物的量，同时降低反应溶液的混浊度。因此，随着样本中抗原浓度越高，反应溶液的混浊度越小。由此可以基于浊度测定样品中的抗原。
同时，在竞争性免疫反应中，当样本中(i)的抗原浓度高时，必须提高(ii)的结合物和(iii)的抗体的浓度。在这种情况下，因为形成大量的(iv)的复合物，混浊度变得过于稠密，使得测量可能失败。在本发明中，将共价结合于水溶性聚合物的抗体用作起到抑制抗原-抗体反应的试剂作用的抗体，使得反应系体系的混浊度可以降低到可测量的水平。
在本发明中，优选被测抗原是存在于生物样品中的物质，特别是以高浓度存在于生物样品中的蛋白质。特别地，优选为白蛋白、IgG、 IgA和IgM，更优选为白蛋白和IgG。在这些物质中，最优选白蛋白，因为本发明能够通过免疫测定法定量测定而不稀释样本，尽管这种定量测定尚未在实验室检验领域中实际应用。在本发明中，样本是例如得自活生物的液体样本。其实例包括血浆、血清或尿。
用于本发明的抗体是针对被测抗原的抗体。只要它是上述的抗体，可以使用多克隆抗体和单克隆抗体。
在本发明中，抗原的类似物是结构上与抗原相似并且能够通过抗原-抗体反应与抗体结合的物质。
在本发明中，细颗粒可以直接使用通常用于免疫凝集的细颗粒。最常用的细颗粒是胶乳粒子。通常使用粒径范围为0.01到0.5微米的细颗粒。
在本发明中，可以使用普通的方法如基于疏水性相互作用的物理吸附方法或共价结合方法使细颗粒携带与被测抗原相同的抗原或其类似物。
共价结合抗体的水溶性聚合物的实例包括聚乙二醇类、聚乙烯醇、右旋糖酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰基吗啉或聚 
唑啉、聚(N-2-(羟丙基)甲基丙烯酰胺)。在这些聚合物中，优选聚乙二醇和聚乙烯醇，条件是该聚合物在室温下为水溶性的。
对于聚乙二醇类没有特别限制，包括聚乙二醇均聚物、聚氧乙烯化的多元醇、聚氧乙烯化的甘油、聚氧乙烯化的山梨醇、或聚氧乙烯化的葡萄糖，只要聚合物具有-CH2CH2O-的重复单元。还要指出的是，聚乙二醇类的一末端可被具有1到4个碳原子、优选1到2个碳原子的烷基取代。
优选的聚乙二醇类的实例包括未被取代的聚乙二醇、聚乙二醇单甲基醚、或聚氧乙烯化的甘油。在这些聚乙二醇类中，更优选聚乙二 醇单甲基醚。
可以使用使肽或蛋白质共价结合水溶性聚合物的常规方法将抗体共价结合于水溶性聚合物例如聚乙二醇类。例如，可以通过以下方法将水溶性聚合物与抗体共价结合：使羧酸的4-羟基-3-硝基苯磺酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-羟基琥珀酰亚胺)、或对硝基苯基碳酸酯或2，4，5-三氯苯基碳酸酯结合于水溶性聚合物例如聚乙二醇类的末端，优选地通过间隔物结合；使得到的物质与抗体中的氨基反应；并且形成酰胺键或氨基甲酸酯键。根据例如使用的抗体选择聚合物的平均分子量。然而，通常，其平均分子量优选为约200到10,000，更优选为300到4,000。在分子量太低时，对抗原-抗体反应的抑制可能是不充分的。同时，当分子量太高时，共价结合于水溶性聚合物的抗体可能难以在水中融化。
在本发明中，作为定量测定凝集纯度的方法，通常使用通过吸光度测量产生的混浊度的方法。然而，还可以通过用肉眼观察凝集或通过计数非凝集颗粒的数目来进行。具体地，本发明的测定方法可以如下进行：首先制备试剂，包括第一试剂和第二试剂，第一试剂中，携带与被测抗原相同的抗原或该抗原的类似物的细颗粒均匀分散在缓冲液例如磷酸盐缓冲液中，第二试剂中，共价结合于水溶性聚合物的抗体溶解于缓冲液例如磷酸盐缓冲液。然后，使用自动分析器将第一和第二试剂加入到包含被测抗原的样本中并且进行抗原-抗体反应以得到凝集比例，将其通过二端点方法测量为在例如800nm波长的吸光度改变的量。可以通过如此得到的测量结果并参考使用已知抗原浓度的标准样品预先生成的校正曲线定量决定样品中的期望的抗体。
为了实现本发明的定量测定，可使用用于定量测定抗原的试剂盒，其包括针对抗原的抗体和细颗粒，所述抗体共价结合于水溶性聚合物，所述细颗粒带有抗原或抗原的类似物。可使用在定量测定方法中所述的抗体和细颗粒作为共价结合于水溶性聚合物的对抗原的抗体，和作为带有抗原或抗原的类似物的细颗粒。
以下实施例举例说明本发明，并且不用于限制本发明的范围。实施例1和比较例1PEG化的抗体的讨论为了通过使抗体结合于PEG(聚乙二醇)控制抗原-抗体反应，进行以下实验。为了对比，通过向未PEG化的抗体加入免疫应答抑制剂例如氯化钠进行相同的实验。
1)人白蛋白敏化的胶乳粒子的制备如下进行白蛋白对胶乳粒子的吸附：向100ml的粒径67nm的聚苯乙烯胶乳粒子的1％悬浮液加入100ml的通过将人血清白蛋白(由The Scripps Research Institute产生)溶解在磷酸盐缓冲液中制成的10％的浓度的溶液。将得到的混合物在室温下搅拌2小时，然后在18,000rpm离心3小时，以除去上清液，从而得到沉淀物。将如此得到的沉淀物悬浮在100ml的磷酸盐缓冲液中，并且进一步离心以从中除去未吸附的过量人血清白蛋白。然后，将得到的沉淀物悬浮在20ml的磷酸盐缓冲液中，然后经过超声波处理以完全分散胶乳粒子。将胶乳浓度为5％的人白蛋白敏化的胶乳粒子悬浮液冷藏。
2)PEG化的抗人白蛋白山羊血清γ级分的制备将由式CH3O(CH2CH2O)nCOCH2CH2CO-OSu(其中OSu为从HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)除去H得到的残基)表示的试剂(由NOF Corporation 生产，商品名：SUNBRIGHT ME-020CS，PEG分子量为2,000)用作PEG化试剂。如下将抗体PEG化。作为抗体，使用抗人白蛋白山羊血清γ级分(由InternationalImmunology Corporation生产，总蛋白浓度为6.5g/dL)的10ml溶液。除了抗体之外，向10ml的磷酸盐缓冲液加入1g的PEG化试剂并且使其溶解，以制备PEG化溶液。然后，将抗体溶液和PEG化溶液以1∶1的混合比例混合并且使其在室温静置过夜，得到蛋白质浓度为3.25g/dL的PEG化抗体。
3)血清白蛋白测量试剂的制备使用其中已吸附白蛋白的胶乳粒子和PEG化抗体制备第一和第二试剂。使用的第一试剂为4％胶乳浓度的悬浮液，通过将5ml磷酸盐缓冲液加入到人白蛋白敏化的胶乳粒子20mL的悬浮液中制备。使用的第二试剂为蛋白质浓度1.3g/dL的溶液，通过将15mL的磷酸盐缓冲液加入到蛋白质浓度为3.25g/dL的PEG化抗人白蛋白山羊血清γ级分的10mL溶液中制备。得到的溶液具有20％的γ级分浓度。另外，通过用磷酸盐缓冲液稀释未PEG化的抗人白蛋白山羊血清γ级分到1.3g/dL的蛋白质浓度制备对照试剂。此外，作为比较例1，通过向未PEG化的抗人白蛋白山羊血清γ级分加入用于抑制免疫反应的1,000mM氯化钠制备蛋白质浓度为1.3g/dL的γ级分溶液。通过相应地用生理盐水稀释已知白蛋白浓度的血清制备样本。
各个试剂的组成如下所述：磷酸盐缓冲液的组成磷酸二氢钠二水合物20mM pH7.50EDTA·2Na 1mM第一试剂的组成磷酸二氢钠二水合物20mM pH7.50EDTA·2Na 1mM人白蛋白敏化的胶乳粒子4％(v/v)第二试剂的组成磷酸二氢钠二水合物20mM pH7.50EDTA·2Na 1mMPEG化的抗人白蛋白山羊血清γ级分1.3g/dL(蛋白质浓度)
第二试剂的组成(对照试剂)磷酸二氢钠二水合物20mM pH7.50EDTA·2Na 1mM抗人白蛋白山羊血清γ级分(未经处理的)1.3g/dL(蛋白质浓度)第二试剂的组成(比较例1)磷酸二氢钠二水合物20mM pH7.50EDTA·2Na 1mM抗人白蛋白山羊血清γ级分(未经处理的)1.3g/dL(蛋白质浓度)氯化钠1,000mM
4)吸光度的测量使用Hitachi 7170S型自动分析器测量血清白蛋白，其中使用270μL的每种第一和第二试剂与2μL的作为样品的血清反应。然后，通过二端点方法在800nm的波长测量测光点19和测光点30(对应于加入第二试剂之后的1到4分钟)之间的吸光度改变量。
5)测量结果在通过使用上述试剂测量血清白蛋白的情况中，吸光度改变量如表1中所示。
表1：通过Hitachi 7170S型自动分析器测量的血清白蛋白吸光度的改变量 
如表1所示，在使用PEG化的抗体的情况中，随着白蛋白浓度增加，吸光度降低。这是由于样本中的白蛋白与加入到试剂中的结合于胶乳粒子的白蛋白之间的竞争性反应所引起的。另外，在本发明中，因为用于反应的抗体被PEG化，反应的吸光 度保持在可测量的水平内。认为这是由于抗体的PEG化引起的，使得结合于抗体的白蛋白发生位阻，因此吸光度得到适当控制。本发明是第一次提供了如下的发现：可以通过抗体的PEG化自由地控制反应的吸光度，因此是不可预见的。同时，在使用未PEG化抗体的情况中，抗体与白蛋白敏化的胶乳粒子之间的反应变得不可控制，并且吸光度超过自动分析器的可测量上限。最终，根本不可能进行测量。同样，当使用免疫反应抑制剂例如氯化钠时，吸光度超过可测量的上限，由此使得不可能进行测量。
实施例2血清白蛋白的测量通过使用其中已吸附白蛋白的胶乳粒子和PEG化的抗体进行血清白蛋白的测量。1)人白蛋白敏化的胶乳粒子的制备向粒径为67nm的聚苯乙烯胶乳粒子的200mL 1％悬浮液加入200ml的通过将人血清白蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中制备的浓度为10％的溶液。将得到的混合物在室温搅拌2小时，然后通过于实施例1同样的方法离心。然后，将如此得到的沉淀物悬浮在40ml磷酸盐缓冲液中并且进行超声波处理以分散胶乳粒子。如上述实施例1中所述，得到胶乳浓度为5％的人白蛋白敏化的胶乳粒子悬浮液。
2)PEG化的抗人白蛋白山羊血清γ级分的制备以与实施例1的2)中相同的方法制备PEG化的抗人白蛋白山羊血清γ级分。3)用于血清白蛋白测量的试剂的制备以与实施例1相同的方法使用其中已吸附白蛋白的胶乳粒子和PEG化抗体制备第一和第二试剂。 使用的第一试剂为4％胶乳浓度的悬浮液，通过将10ml磷酸盐缓冲液加入到40mL的人白蛋白敏化的胶乳粒子悬浮液中制备。使用的第二试剂为蛋白质浓度为1.3g/dL的溶液，通过将30mL磷酸盐缓冲液加入到PEG化的抗人白蛋白山羊血清γ级分的20mL溶液中制备。
各个试剂的组成如下所述：第一试剂的组成磷酸二氢钠脱水物20mM pH7.50EDTA·2Na 1mM人白蛋白敏化的胶乳粒子4％(v/v)第二试剂的组成磷酸二氢钠二水合物20mM pH7.50EDTA·2Na 1mMPEG化的抗人白蛋白山羊血清γ级分1.3g/dL(蛋白质浓度)
4)吸光度的测量使用Hitachi 7170S型自动分析器测量血清白蛋白浓度，其中使270μL的每种第一和第二试剂与2μL的作为样本的血清反应。然后，通过二端点方法在800nm的波长测量测光点19和测光点30(相当于1加入第二试剂之后的1到4分钟)之间的吸光度改变量。参考使用分析器的多点校正曲线生成函数生成的校正曲线计算白蛋白浓度，其中将通过蛋白质标准血清CRM 470评价的血清用作标准。另外，通过根据TIA方法使用“N-assay TIA Micro A1b”(由NittoBoseki Co.，Ltd.生产)作为对照试剂进行相关性的证实。将用生理盐水稀释100倍的血清用作TIA方法的试剂的样品。如上所述，使用Hitachi 7170S型自动分析器进行测量，其根据指定的参数进行测量。 将测量结果乘以100，得到血清白蛋白值。
5)测量结果A)本发明的测定法的校正曲线每个标准的吸光度改变量如表2值所示，校正曲线如图1所示。
表2：本发明的测定方法中通过Hitachi 7170S型自动分析器测量的每个标准的吸光度改变量
| 标准的浓度(g/dL) | 在800nm的吸光度改变量 |
| 0 | 0.3736 |
| 0.53 | 0.3103 |
| 1.05 | 0.2604 |
| 2.11 | 0.1946 |
| 4.08 | 0.1218 |
| 7.96 | 0.0873 |
如表2和图1中所示，可以通过控制吸附于胶乳粒子的白蛋白的量、和PEG化的抗体而不依靠稀释测定血清样品。因为本发明的方法利用了竞争性反应，所以随着白蛋白浓度增加，吸光度降低。这使得有可能防止在利用免疫反应的测量试剂中产生问题的前带现象。在根据常规的免疫测定法的血清白蛋白测量中，样品必须被稀释到可测量的浓度。然而，本发明的方法能够不依靠稀释进行测定，证明本发明的方法在样品稀释的准确性和可操作性方面非常有用。
B)与TIA方法的相关性本发明的方法与TIA方法之间的相关性的血清白蛋白测量结果如图2中所示。通过指定TIA方法为X和本发明方法为Y证实相关性。结果表现出良好的相关性，即Y＝0.97X+0.05，并且相关系数为0.974(N＝30)。在血清白蛋白测量中，已知免疫测定法是精确测定血清白蛋白的唯一方法。因此，因为证实了本发明与一种免疫测定法，TIA，相关，所以可以通过本发明的方法精确地测定血清白蛋白。
工业实用性
本发明的测定方法使得有可能进行以高浓度存在于生物样品中的蛋白质抗原例如白蛋白的免疫测定法而不发生前带现象，以及无须稀释样本，少量使用作为测量试剂的昂贵的抗体。
Claims (6)
1.通过均匀体系中的竞争性免疫凝集测定法测定抗原的方法，包括以下步骤：
将包含被测抗原的样品、针对该抗原的抗体、和带有与被测抗原相同的抗原或该抗原类似物的细颗粒混合，所述类似物可以与所述抗体发生抗原-抗体反应；
在样品中的抗原和细颗粒带有的与被测抗原相同的抗原或细颗粒带有的该抗原类似物之间，使抗体的抗原-抗体反应竞争；和
基于抗体与细颗粒带有的和被测抗原相同的抗原或细颗粒带有的该抗原类似物的抗原-抗体反应所产生的凝集程度，定量地测定被测抗原，
所述方法的特征在于抗体共价结合于水溶性聚合物。
2.权利要求1的通过均匀体系中的竞争性免疫凝集测定法测定抗原的方法，其中水溶性聚合物是聚乙二醇类、聚丙二醇均聚物、或聚乙烯醇。
3.权利要求1的通过均匀体系中的竞争性免疫凝集测定法测定抗原的方法，其中水溶性聚合物是聚乙二醇类。
4.权利要求1到3中任一项的通过均匀体系中的竞争性免疫凝集测定法测定抗原的方法，其中被测抗原是以高浓度存在于生物样品中的蛋白质。
5.权利要求4的通过均匀体系中的竞争性免疫凝集测定法测定抗原的方法，其中被测抗原是白蛋白。
6.权利要求1到3中任一项的通过均匀体系中的竞争性免疫凝集测定法测定抗原的方法，其中在不稀释包含被测抗原的样品的情况下进行测定。
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