CN103293299B

CN103293299B - 拓宽双抗体夹心免疫检测浓度范围的方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN103293299B
Application number: CN201210043004.9A
Authority: CN
Inventors: 吴冯波
Original assignee: PerkinElmer Medical Diagnostic Products Shanghai Co Ltd
Current assignee: Ruifudi Biomedical Shanghai Co ltd
Priority date: 2012-02-24
Filing date: 2012-02-24
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2032-02-24
Also published as: CN103293299A

Abstract

本发明公开了一种拓宽双抗体夹心免疫检测浓度范围的方法及其试剂盒，其方法包括：1)用捕获抗体包被固相材料；2)以信号生成物质标记示踪抗体；3)当校准品或样本中的待测抗原浓度过高，或者检测信号超出仪器的检测上限时，使用未标记的示踪抗体稀释已标记的示踪抗体；4)通过捕获抗体及示踪抗体，与校准品或样本中的待测抗原发生免疫反应；检测信号强度，用于检测样本中待测抗原的含量；本发明的试剂盒包括：包被有捕获抗体的固相材料，信号生成物质标记的示踪抗体，未以信号生成物质标记的示踪抗体。通过未标记的示踪抗体和已标记的示踪抗体的总浓度的提高和检测信号的降低，使双抗体夹心免疫检测的浓度范围得到有效地拓宽。

Description

拓宽双抗体夹心免疫检测浓度范围的方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种免疫检测方法及其试剂盒，特别是涉及一种拓宽双抗体夹心免疫检测浓度范围的方法及其试剂盒。

背景技术

结合标记物和游离标记物的分离是影响非均相免疫分析准确性和灵敏性的关键步骤，而固相免疫分析为此提供了一有效手段；在固相免疫分析中，固相材料既作为免疫试剂的载体，又作为免疫反应的场所，因此可以通过简单的洗涤方式有效地分离游离标记物与结合标记物，从而方便地实现非均相免疫分析。自1967年Cattle等人首次将聚苯乙烯塑料固相引入常规免疫分析之后，固相免疫分析已经得到广泛的应用，目前已成为最成熟、最常见的免疫检测模式。

当以固相免疫分析方式实施双抗体夹心免疫检测时，固相抗体(即捕获抗体)及标记抗体的浓度和活性是影响检测浓度范围的重要因素。当固相抗体(即捕获抗体)及标记抗体的用量和活性足以结合标本中的被测抗原时，双抗体夹心免疫检测的信号强度与待测抗原浓度往往呈现良好的线性关系；而当标本含有高浓度待测抗原，固相抗体(即捕获抗体)及标记抗体的用量/活性相对不足，或者高浓度待测抗原引发的检测信号超出仪器的线性检测范围时，校准曲线的信号强度与待测物浓度常常偏离线性关系，从而使免疫检测失去准确定量高浓度端待测抗原的能力；此时，增加固相抗体(即捕获抗体)及标记抗体的用量常常可以缓和这一现象；但对于微孔和试管固相，可以增加的固相抗体的量往往非常有限，因此，增加标记抗体用量的方法往往为首选方法。但在实际操作中，增加标记抗体用量常常导致检测信号过强而超出仪器的检测范围，同样会使高浓度待测抗原的检测失去准确性。

然而，目前为止，尚未见本发明所述的双抗体夹心免疫检测中的拓宽免疫检测浓度范围的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种拓宽双抗体夹心免疫检测浓度范围的方法及其试剂盒。本发明以未标记的示踪抗体稀释已标记的示踪抗体，通过提高示踪抗体总浓度和降低检测信号，使待测物抗原的可测浓度范围得到拓宽。该方法不需要变更体系其他组分，实施简便而有效，可解决常见的双抗体夹心法不能准确测量高浓度待测物的问题。

为解决上述技术问题，本发明的拓宽双抗体夹心免疫检测浓度范围的方法，包括以下步骤：

(1)用捕获抗体包被固相材料；

(2)以信号生成物质标记抗体(示踪抗体)；

(3)当校准品或样本中的待测抗原浓度过高，导致标记抗体活性/浓度相对不足，或者检测信号超出仪器的检测上限时，使用未标记的示踪抗体稀释已标记的示踪抗体；

(4)通过捕获抗体及示踪抗体，与校准品或样本中的待测抗原发生免疫反应，形成双抗体夹心复合物：捕获抗体-待测抗原-示踪抗体；检测信号生成物质产生的信号强度，用于检测样本中待测抗原的含量。

所述步骤(1)中，固相材料，包括：孔状或管状固相，微球状固相，纤维膜；其中，孔状或管状固相包括：微孔，试管；微球状固相包括：磁微球，乳胶微球；纤维膜包括：硝酸纤维素膜、尼龙膜。

步骤(1)中，包被的步骤，包括：

(a)将捕获抗体溶解于包被缓冲液后，与固相材料接触并静置5～24小时；包被抗体的浓度范围为1.0～10.0μg/ml。

(b)用含表面活性剂的缓冲液作为洗涤液，洗涤步骤(a)制备的捕获抗体包被的固相材料后，加入含封闭蛋白的缓冲液，静置3～12小时；

(c)弃去含封闭蛋白的缓冲液，干燥固相材料，完成捕获抗体包被固相材料的制备。

其中，步骤(a)中，包被缓冲液包括：50mMpH9.5CB缓冲液，其中，该缓冲液中含有：50mMNa₂CO₃-NaHCO₃、150mMNaCl、0.05％的NaN₃；

步骤(b)中，含表面活性剂的缓冲液，包括：含0.1％Tween-20的50mMpH7.8TSA缓冲液；其中，50mMpH7.8TSA缓冲液中含有：50mMTris、150mMNaCl、1％BSA、16％的蔗糖；

步骤(c)中，含封闭蛋白的缓冲液，包括：含0.5％酪蛋白的0.1％Tween-20的50mMpH7.8TSA缓冲液。

所述步骤(2)中，信号生成物质包括：酶、荧光物质、稀土离子、化学发光物质、电化学发光物质；

其中，酶，包括：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶；

荧光物质，包括：异硫氰酸荧光素、荧光素；

稀土离子，包括：Eu³⁺、Sm³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺及其螯合物配基；

化学发光物质，包括：丫啶酯及其衍生物；

电化学发光物质，包括：多环芳烃类、酰肼类、联吡啶类化合物以及三联吡啶钌。

步骤(2)中，以信号生成物质标记示踪抗体的方法可为：

将抗体通过过碘酸钠法与酶结合在一起；将抗体与带有反应官能团的荧光物质或化学发光物质混合，使它们结合在一起；在双功能官能团存在下，将抗体与酶、荧光物质或化学发光物质混合，使它们结合在一起。

所述步骤(3)中，“未标记的示踪抗体”与“标记的示踪抗体”是针对相同抗原表位的抗体，即：在标记之前，上述的“标记的示踪抗体”即是“未标记的示踪抗体”。在免疫检测中，“标记的示踪抗体”和“未标记的示踪抗体”均为示踪抗体；“标记的示踪抗体”可发出标记物的特征信号以供检测，加入的“未标记的示踪抗体”则通过竞争结合而降低示踪抗体导致的信号，使检测信号处于仪器检测的线性范围内。在双抗体夹心免疫检测一步法中，高浓度待测抗原常常会因为HOOK效应引起待测抗原的测量范围变窄，而本发明所述的加入“未标记的示踪抗体”还可通过示踪抗体总浓度的增加而缓和这一问题。

其中，“标记的示踪抗体”与“未标记的示踪抗体”的使用比例根据特定的检测对象而不同，主要依照检测对象对检测灵敏度和检测浓度范围的要求而定。

所述步骤(3)、(4)中，样本包括：血清、血浆、全血、尿液、唾液。

所述步骤(4)中，检测样本中待测抗原的步骤，包括：

I、包被有捕获抗体的固相材料中加入样本；

II、加入含信号生成物质标记的示踪抗体后，固相材料表面的捕获抗体及示踪抗体与样本待测抗原发生免疫反应，形成捕获抗体-待测抗原-示踪抗体复合物；

III、洗涤除去未结合的含信号生成物质标记的示踪抗体；

IV、根据示踪抗体所含的信号生成物质所产生的信号强弱，确定样本中待测抗原的浓度。

所述步骤II中，含信号生成物质标记的示踪抗体，包括：含信号生成物质标记的示踪抗体与未标记的示踪抗体混合物

另外，根据上述方法，本发明还公开了一种拓宽双抗体夹心免疫检测浓度范围的检测试剂盒，包括：包被有捕获抗体的固相材料，信号生成物质标记的示踪抗体，未以信号生成物质标记的示踪抗体。

所述试剂盒，还包括：校准品，洗涤缓冲液，增强液。

其中，该增强液包括：含1.0％冰乙酸和2.0％邻苯二甲酸氢钾的缓冲液，pH3.0-4.5，该缓冲液中同时含有0.4％β-萘基甲酰三氟丙酮、2％三正辛基氧膦、0.1％、TritonX-100。

本发明所述的免疫反应指抗原与针对它们的抗体之间的特异性结合，如本发明所述的大分子抗原与针对它们的二种抗体(捕获抗体与示踪抗体)之间的特异性结合。

所述的双抗体夹心复合物是以待测抗原为“桥”，通过桥连而形成的捕获抗体-待测抗原-示踪抗体复合物。

本发明的免疫检测是一种固相免疫分析，该检测方法中的捕获抗体(即固相抗体)在免疫检测中作为一种结合试剂捕获样本中的待测抗原，而捕获抗体与示踪抗体分别是针对待测抗原上不同抗原表位的抗体。

本发明中，当双抗体夹心免疫检测范围的浓度上限受检测信号强度的线性上限所限制时(如当校准品或标本中的抗原浓度过高而导致检测信号超出仪器的检测上限时)，使用未标记的示踪抗体稀释已标记的示踪抗体，即通过示踪抗体(未标记的示踪抗体和已标记的示踪抗体)总浓度的提高和检测信号的降低，从而在免疫检测中起到增加示踪抗体浓度而不加强检测信号强度的目的，使待测物的浓度与信号强度可在高浓度范围呈现良好的线性关系，使双抗体夹心免疫检测的浓度范围得到有效地拓宽。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是使用不同示踪抗体的双抗体夹心法建立的AFP检测校准曲线；

图2是测量高浓度AFP(甲胎蛋白)标本的准确性和精密性评估图。

具体实施方式

实施例1抗AFP抗体包被微孔板的制备

(1)移取1mg抗AFP抗体(芬兰Medix)于200ml包被缓冲液[50mMpH9.5CB缓冲液，含50mMNa₂CO₃-NaHCO₃、150mMNaCl、0.05％(w/v)的NaN₃]中，充分混匀，避免产生气泡，配制成抗AFP抗体包被液；

(2)取微孔板每孔加入抗AFP抗体包被液200μL，室温(20～25℃)静置24小时；

(3)用含表面活性剂的缓冲液[含0.1％(v/v)Tween-20的50mMpH7.8TSA缓冲液，其中，50mMpH7.8TSA缓冲液中含有：50mMTris、150mMNaCl、1％(w/v)BSA(牛血清白蛋白)、16％(w/v)的蔗糖]洗涤2次；每孔注入含封闭蛋白的封闭缓冲液[含0.5％(w/v)酪蛋白、0.1％(v/v)Tween-20的50mMpH7.8TSA缓冲液]300μL，室温(20～25℃)静置8小时；

(4)吸干封闭缓冲液，每孔加入4％(w/v)蔗糖溶液300μL，吸干，将微孔板放入甩干机甩干5分钟；打开冻干机，使真空度＜50Pa，保持3小时，停机，将干燥后的微孔板装入锡铂袋并热封置2～8℃保存。

实施例2Eu标记抗AFP抗体的制备

(1)将抗AFP抗体(芬兰Medix公司)1mg溶于2000μL纯水，室温(20～25℃)对pH9.5100mMCBS(100mMNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，含150mMNaCl)透析24小时，换液两次，每次2000mL。

(2)取1mgEu-DTTA，用1000μLpH9.5100mMCBS溶解。将溶解完全的Eu-DTTA加入透析后的抗AFP抗体溶液中(约1mg/mL)，边加边振荡，室温(20～25℃)静置72小时。Eu-DTTA与抗AFP抗体的质量比约为1∶1。

(3)用SephacrylS-200HR(1.6×50cm)分离Eu-抗AFP抗体与游离的Eu-DTTA，用pH7.850mMTSA[50mMTris，含150mMNaCl、1％(w/v)BSA、16％(w/v)的蔗糖]洗脱。分离过程以核酸蛋白检测仪监控。得到纯化的Eu标记抗AFP抗体。

实施例3以标记抗AFP抗体为示踪抗体的双抗体夹心一步法检测AFP

(1)吸取25μL的样品或校准品按顺序加入相应微孔(实施例1制备的抗AFP抗体包被的微孔板)。

(2)在各微孔内加入100μL实施例2制备的Eu标记抗AFP抗体工作液(浓度分别为0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml，室温(20～25℃)慢速振荡90分钟。

(3)用含0.1％(v/v)Tween-20的50mMTSA缓冲液(pH7.8)洗板6次，将板条在洁净的吸水纸上拍干。

(4)在每个微孔内加入150μL的增强液[含1.0％(v/v)冰乙酸和2.0％(w/v)邻苯二甲酸氢钾缓冲液，pH3.0-4.5，并含有0.4％(w/v)β-萘基甲酰三氟丙酮(β-NTA)，2％(w/v)三正辛基氧膦(TOPO)，0.1％(v/v)TritonX-100]，室温(20～25℃)慢速振荡5分钟。

(5)选择新波生物有限公司生产的Anytest2000荧光检测仪的相应程序测荧光强度。

实施例4以标记抗AFP抗体和未标记抗AFP抗体的混合液为示踪抗体的双抗体夹心一步法检测AFP

(2)在各微孔内加入100μLEu标记抗AFP抗体和未标记抗AFP抗体的混合液(Eu标记抗AFP抗体和未标记抗AFP抗体的浓度分别为1.0μg/ml，标记与未标记的抗AFP抗体比例为1∶1)，室温(20～25℃)慢速振荡90分钟。

(4)在每个微孔内加入150μL的实施例3中的增强液，室温(20～25℃)慢速振荡5分钟。

实施例5测量高浓度AFP标本的准确性和精密性评估

按实施例3和实施例4二种方式平行12次检测三份AFP浓度分别为226ng/ml、635ng/ml、978ng/ml的人血清标本(上海仁济医院)，根据校准品以及根据12次检测所得的AFP浓度计算变异系数(CV)。结果见表1-3。

其中，校准品的配制方法为：将已知含量的AFP国家标准品(购自中国药品生物制品检定所)溶解于含20％(v/v)小牛血清中，通过调节小牛血清体积和AFP量，配制成不同AFP浓度的校准品。

表1以标记抗AFP抗体为示踪抗体的双抗体夹心一步法

表2以标记和未标记抗AFP抗体混合液为示踪抗体的双抗体夹心一步法

表3测量高浓度AFP标本的准确性和精密性评估

上述实验结果表明：

1)表1结果表明，使用较低浓度(如：上述实验中0.5μg/ml)的标记抗体建立校准曲线时，因为标记抗体量的相对不足而出现HOOK现象，标本浓度与测量信号失去线性关系；加大标记抗体浓度(如：上述实验中1.0μg/ml、1.5μg/ml)可以缓和这一问题，但加大标记抗体浓度会导致检测信号超出仪器测量范围，也使校准曲线的AFP浓度与测量信号偏离线性关系(见图1)。

2)表2结果表明，当使用未标记抗体稀释已标记的示踪抗体，通过示踪抗体(未标记的示踪抗体和已标记的示踪抗体)总浓度的提高和检测信号的降低，校准曲线呈现良好的线性关系(见图1)。

3)表3结果表明，当标本含有高浓度待测抗原(如：上述实验中978ng/mlAFP)时，通过使用未标记抗体稀释已标记的示踪抗体，使示踪抗体总浓度的提高和检测信号的降低，测量高浓度AFP标本的精密性得到显著改善，使免疫检测浓度范围得到有效地拓宽(见图2)。

Claims

1.一种拓宽双抗体夹心免疫检测浓度范围的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)用捕获抗体包被固相材料，所述固相材料包括：孔状或管状固相，微球状固相，纤维膜；所述孔状或管状固相包括：微孔，试管；微球状固相包括：磁微球，乳胶微球；纤维膜包括：硝酸纤维素膜、尼龙膜；

(2)以信号生成物质标记示踪抗体；

所述信号生成物质包括：酶、荧光物质、稀土离子、化学发光物质、电化学发光物质；

(3)当校准品或样本中的待测抗原浓度过高，或者检测信号超出仪器的检测上限时，使用未标记的示踪抗体稀释已标记的示踪抗体；

(4)通过捕获抗体及示踪抗体，与校准品或样本中的待测抗原发生免疫反应，形成双抗体夹心复合物：捕获抗体—待测抗原—示踪抗体；检测信号生成物质产生的信号强度，用于检测样本中待测抗原的含量；

其中，步骤(1)中，包被的步骤，包括：

(a)将捕获抗体溶解于包被缓冲液，使抗体浓度为1.0～10.0μg/ml，将该溶液与固相材料接触并静置5～24小时；

(b)用含表面活性剂的缓冲液作为洗涤缓冲液，洗涤步骤(a)制备的捕获抗体包被的固相材料后，加入含封闭蛋白的缓冲液，静置3～12小时；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(a)中，包被缓冲液包括：50mMpH9.5CB缓冲液，其中，该缓冲液中含有：50mMNa₂CO₃-NaHCO₃、150mMNaCl、0.05％的NaN₃；

步骤(b)中，含表面活性剂的缓冲液，包括：含0.1％Tween-20的50mMpH7.8TSA缓冲液，其中，50mMpH7.8TSA缓冲液中含有：50mMTris、150mMNaCl、1％BSA、16％的蔗糖；

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶包括：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶；

荧光物质包括：异硫氰酸荧光素、荧光素；

稀土离子包括：Eu³⁺、Sm³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺及其螯合物配基；

化学发光物质包括：丫啶酯及其衍生物；

电化学发光物质包括：多环芳烃类、酰肼类、联吡啶类化合物以及三联吡啶钌。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)、(4)中，样本包括：血清、血浆、全血、尿液、唾液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，检测样本中待测抗原的步骤，包括：

I、包被有捕获抗体的固相材料中加入样本；

II、加入含信号生成物质标记的示踪抗体后，固相材料表面的捕获抗体及示踪抗体与样本待测抗原发生免疫反应，形成捕获抗体—待测抗原—示踪抗体复合物；

III、洗涤除去未结合的含信号生成物质标记的示踪抗体；

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤II中，含信号生成物质标记的示踪抗体，包括：含信号生成物质标记的示踪抗体与未标记的示踪抗体混合物。

7.利用如权利要求1所述方法的检测试剂盒，其特征在于：包括：包被有捕获抗体的固相材料，信号生成物质标记的示踪抗体，未以信号生成物质标记的示踪抗体。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：还包括：校准品，洗涤缓冲液，增强液；

其中，该增强液包括：含1.0％冰乙酸和2.0％邻苯二甲酸氢钾的缓冲液，pH3.0-4.5该缓冲液中同时含有0.4％β-萘基甲酰三氟丙酮、2％三正辛基氧膦、0.1％、TritonX-100。