CN111693690A - 改善一步法双抗夹心反应中hook效应及平台期的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了改善一步法双抗夹心反应中HOOK效应及平台期的方法，其能解决HOOK效应及平台期对高值样本检测准确性的影响。改善一步法双抗夹心反应中HOOK效应及平台期的方法，一步法双抗夹心反应是将样本、捕获抗体溶液和酶结合物抗体溶液同时加入至反应孔中进行孵育反应，其特征在于，向捕获抗体溶液中添加0.2μg/mL‑2μg/mL未标记的同类型抗体或向酶标记抗体溶液中添加0.2μg/mL‑2μg/mL未标记的同类型抗体。该方法能降低或避免剂量曲线中HOOK效应及平台期，以提高高值样本检测结果的准确性。
Description
技术领域
本发明属于医疗器械生物类免疫体外诊断领域，具体涉改善一步法双抗夹心反应中HOOK效应及平台期的方法。
背景技术
HOOK效应又称为镰刀效应，通常用来描述特殊的一步法夹心免疫反应时的剂量反应曲线的性状。该线型不像ELISA的正常剂量反应的S型曲线，其特点是在抗原浓度不断增加时，线型上扬，达到峰值后，迅速向下弯落。对这种在高剂量区段的、钩或镰状的异常线型称为HOOK效应。
一步夹心法是将待测抗原标本与限量标记的抗体对（包括捕获抗体和酶结合物抗体）同时加入至反应孔中，孵育反应后洗涤去除杂质及多余的组分，加入适宜的底物后读取信号值。抗原与限量的抗体对进行竞争性的反应，当样本中抗原浓度远高于抗体能结合的抗原量时，抗原会分别与捕获抗体和酶结合物抗体结合，不能形成夹心形式，进而导致信号值下降，出现假阴性的情况。并且，当样本中抗原浓度较高且相差较大时，由于其曲线形态进入平台期，会导致样本的计算结果偏差较大，即表现出高值样本检测结果不准确。
在现发现的免疫标志物中，有大量标志物因病理浓度较高，存在高值检测不准确及假阴性的现象。单纯的提高标记抗体浓度，可能会导致本底信号值升高，导致低值检测结果不准确或假阳性的现象。为解决该情况，急需开发一种能降低或避免剂量曲线中HOOK效应及平台期的方法，以提高高值样本检测结果的准确性。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了改善一步法双抗夹心反应中HOOK效应及平台期的方法，其能降低或避免剂量曲线中HOOK效应及平台期，以提高高值样本检测结果的准确性。
其技术方案是这样的，改善一步法双抗夹心反应中HOOK效应及平台期的方法，所述一步法双抗夹心反应是将样本、捕获抗体溶液和酶结合物抗体溶液同时加入至反应孔中进行孵育反应，其特征在于，向捕获抗体溶液中添加0.2μg/mL-2μg/mL未标记的同类型抗体或向酶标记抗体溶液中添加0.2μg/mL-2μg/mL未标记的同类型抗体。
进一步的，所述捕获抗体溶液为向正常捕获抗体溶液中加入生物素标记抗体同货号的抗体，浓度为0.2μg/mL-2μg/mL。
进一步的，所述酶结合抗体溶液为向正常酶结合抗体溶液中加入酶标记抗体同货号的抗体，浓度为0.2μg/mL-2μg/mL。
本发明仅适用于一步法双抗夹心免疫反应，本发明的提供的方法，通过在捕获抗体溶液及酶标记抗体溶液中添加适当浓度的未标记抗体，可明显改善剂量反应曲线中的HOOK效应和平台期，会较大程度提高出现平台期或者HOOK效应对应的抗原浓度，减小高浓度情况下因平台期或者HOOK效应导致的检测误差，提高高值样本检测结果的准确性。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
以下描述中，肌酸激酶同工酶校准品（苏械注准20192400538）、底物A（苏盐械备20150026）、底物B（苏盐械备20150027）、洗液（苏盐械备20170011）组分均由江苏拜明生物技术有限公司提供。
本实施例选用了肌酸激酶同工酶项目，考察了向捕获抗体溶液中添加不同量的未标记同类抗体对标准曲线及高值样本检测结果的影响。
1.试剂配制
捕获抗体工作溶液：称取4.49g磷酸二氢钾、15.29g 三水磷酸氢二钾、5g 2-氯乙酰胺，加入至1000g纯化水中，充分溶解混合均匀后，加入5g的牛血清白蛋白、1.2g 牛源γ免疫球蛋白、1.2g牛源α免疫球蛋白，充分搅拌使溶解并混合均匀，得到捕获抗体稀释液。向稀释液中加入生物素标记的捕获抗体，使浓度为2μg/mL。称取3份捕获抗体溶液，分别加入未标记的同类抗体，使其浓度为0.2μg/mL，0.8μg/mL,2μg/mL。
酶标记抗体工作溶液：称取4.49g磷酸二氢钾、15.29g 三水磷酸氢二钾、5g 2-氯乙酰胺，加入至1000g纯化水中，充分溶解混合均匀后，加入5g的牛血清白蛋白，充分搅拌使溶解并混合均匀，再加入酶标记抗体，使浓度为2μg/mL。
2.样本检测
向链霉亲和素包被板中加入50μL的标准品或样本，再依次加入50μL的酶标记抗体和50μL的生物素标记抗体，于37℃反应10分钟，300μL/孔洗涤5次，加入100μL底物，反应1分钟后，读取光信号值。
结果表明，捕获抗体工作溶液中加入的未标记抗体浓度越大，检测信号值越低，HOOK效应及平台期越不明显，标准曲线信号值对比见表1，高值样本检测结果见表2。
表1. 捕获抗体工作液中不同未标记同类抗体添加量对CK-MB项目标准曲线的影响
检测结果表明：未标记生物素捕获抗体浓度添加量为0的情况，即体现了背景技术中指出的，随着抗原浓度提高，光信号值会出现平台期；当抗原浓度过高时，会导致信号值出现下降现象，进而出现假阴性。未标记抗原加入后，校准曲线各样本信号值会整体下降，但是会较大程度提高出现平台期或者HOOK效应对应的抗原浓度。
表2. 捕获抗体工作液中不同未标记同类抗体添加量对CK-MB高值样本检测结果的影响
检测结果表明：随着未标记生物素捕获抗体浓度的提升，高值样本检测提升值与贝克曼的检测值偏差越小。
肌酸激酶同工酶是心梗疾病的重要检测指标之一，肌酸激酶同工酶的正常含量范围为0.6-6.3ng/ml，而某些心梗患者的肌酸激酶同工酶指标高达20-300 ng/ml，如果用药前检测是200 ng/ml，当用药后，由于高浓度下出现平台期，存在检测偏差，检测值若还是200 ng/ml，将会给医生判断给药造成很大的影响。
实施例2
以下描述中，校准品（苏械注准20192400538）、底物A（苏盐械备20150026）、底物B（苏盐械备20150027）、洗液（苏盐械备20170011）组分均由江苏拜明生物技术有限公司提供。
本实施例选用了肌酸激酶同工酶项目，考察了向酶标记抗体溶液中添加不同量的未标记同类抗体对标准曲线及高值样本检测结果的影响。
1.试剂配制
捕获抗体工作溶液：称取4.49g磷酸二氢钾、15.29g 三水磷酸氢二钾、5g 2-氯乙酰胺，加入至1000g纯化水中，充分溶解混合均匀后，加入5g的牛血清白蛋白、1.2g 牛源γ免疫球蛋白、1.2g牛源α免疫球蛋白，充分搅拌使溶解并混合均匀，得到捕获抗体稀释液。向稀释液中加入生物素标记的捕获抗体，使浓度为2μg/mL。
酶标记抗体工作溶液：称取4.49g磷酸二氢钾、15.29g 三水磷酸氢二钾、5g 2-氯乙酰胺，加入至1000g纯化水中，充分溶解混合均匀后，加入5g的牛血清白蛋白，充分搅拌使溶解并混合均匀，再加入酶标记抗体，使浓度为2μg/mL。称取3份酶标记抗体溶液，分别加入未标记的同类抗体，使其浓度为0.2μg/mL，0.8μg/mL,2μg/mL。
2.样本检测
检测方法如实施例1中所述，将标准品浓度值及对应的光信号值进行四参数回归拟合，将样本的信号值带入四参数回归方程计算样本的浓度值。
结果表明，酶标记抗体工作溶液中加入的未标记抗体浓度越大，检测信号值越低，HOOK效应及平台期越不明显，标准曲线信号值对比见表3，高值样本检测结果见表4。
表3. 酶标抗体工作液中不同未标记同类抗体添加量对CK-MB项目标准曲线的影响
检测结果表明：未标记酶标抗体浓度添加量为0的情况，即体现了背景技术中指出的，随着抗原浓度提高，光信号值会出现平台期；当抗原浓度过高时，会导致信号值出现下降现象，进而出现假阴性。未标记抗原加入后，校准曲线各样本信号值会整体下降，但是会较大程度提高出现平台期或者HOOK效应对应的抗原浓度。
表4. 酶标抗体工作液中不同未标记同类抗体添加量对CK-MB高值样本检测结果的影响
检测结果表明：随着未标记酶标抗体浓度的提升，高值样本检测提升值与贝克曼的检测值偏差越小。
实施例3
以下描述中，肌红蛋白校准品（苏械注准20192400540）、底物A（苏盐械备20150026）、底物B（苏盐械备20150027）、洗液（苏盐械备20170011）组分均由江苏拜明生物技术有限公司提供。
本实施例选用了肌红蛋白项目，考察了向捕获抗体溶液中添加不同量的未标记同类抗体对标准曲线及高值样本检测结果的影响。
1.试剂配制
捕获抗体工作溶液：称取4.49g磷酸二氢钾、15.29g 三水磷酸氢二钾、5g 2-氯乙酰胺，加入至1000g纯化水中，充分溶解混合均匀后，加入5g的牛血清白蛋白、1.2g 牛源γ免疫球蛋白、1.2g牛源α免疫球蛋白，充分搅拌使溶解并混合均匀，得到捕获抗体稀释液。向稀释液中加入生物素标记的捕获抗体，使浓度为1μg/mL。称取3份捕获抗体溶液，分别加入未标记的同类抗体，使其浓度为0.2μg/mL，0.8μg/mL,2μg/mL。
酶标记抗体工作溶液：称取4.49g磷酸二氢钾、15.29g 三水磷酸氢二钾、5g 2-氯乙酰胺，加入至1000g纯化水中，充分溶解混合均匀后，加入5g的牛血清白蛋白，充分搅拌使溶解并混合均匀，再加入酶标记抗体，使浓度为1μg/mL。
2.样本检测
向链霉亲和素包被板中加入25μL的标准品或样本，再依次加入50μL的酶标记抗体和50μL的生物素标记抗体，于37℃反应10分钟，300μL/孔洗涤5次，加入100μL底物，反应1分钟后，读取光信号值。
结果表明，捕获抗体工作溶液中加入的未标记抗体浓度越大，检测信号值越低，HOOK效应及平台期越不明显，标准曲线信号值对比见表5，高值样本检测结果见表6。
表5. 捕获抗体工作液中不同未标记同类抗体添加量对MYO项目标准曲线的影响
检测结果表明：未标记生物素捕获抗体浓度添加量为0的情况，即体现了背景技术中指出的，随着抗原浓度提高（校准品浓度为625、1300 ng/mL时），光信号值会出现平台期；当抗原浓度过高时，会导致信号值出现下降现象，进而出现假阴性。未标记抗原加入后，校准曲线各样本信号值会整体下降，但是会较大程度提高出现平台期或者HOOK效应对应的抗原浓度。
表6. 捕获抗体工作液中不同未标记同类抗体添加量对MYO高值样本检测结果的影响
检测结果表明：随着未标记生物素捕获抗体浓度的提升，高值样本检测提升值与贝克曼的检测值偏差越小。
肌红蛋白是心梗疾病的重要检测指标之一，肌红蛋白的正常含量范围为男性20-80ng/mL，女性10-70ng/mL。而某些心梗患者的肌红蛋白指标高达500-1000ng/ml，如果用药前检测是500ng/ml，当用药后，由于高浓度下出现平台期，存在检测偏差，检测值若还是500ng/ml，将会给医生判断给药造成很大的影响。
实施例4
以下描述中，肌红蛋白校准品（苏械注准20192400540）、底物A（苏盐械备20150026）、底物B（苏盐械备20150027）、洗液（苏盐械备20170011）组分均由江苏拜明生物技术有限公司提供。
本实施例选用了肌红蛋白项目，考察了向酶标记抗体溶液中添加不同量的未标记同类抗体对标准曲线及高值样本检测结果的影响。
1.试剂配制
捕获抗体工作溶液：称取4.49g磷酸二氢钾、15.29g 三水磷酸氢二钾、5g 2-氯乙酰胺，加入至1000g纯化水中，充分溶解混合均匀后，加入5g的牛血清白蛋白、1.2g 牛源γ免疫球蛋白、1.2g牛源α免疫球蛋白，充分搅拌使溶解并混合均匀，得到捕获抗体稀释液。向稀释液中加入生物素标记的捕获抗体，使浓度为1μg/mL。
酶标记抗体工作溶液：称取4.49g磷酸二氢钾、15.29g 三水磷酸氢二钾、5g 2-氯乙酰胺，加入至1000g纯化水中，充分溶解混合均匀后，加入5g的牛血清白蛋白，充分搅拌使溶解并混合均匀，再加入酶标记抗体，使浓度为1μg/mL。称取3份酶标记抗体溶液，分别加入未标记的同类抗体，使其浓度为0.2μg/mL，0.8μg/mL,2μg/mL。
2.样本检测
检测方法如实施例3中所述，将标准品浓度值及对应的光信号值进行四参数回归拟合，将样本的信号值带入四参数回归方程计算样本的浓度值。
结果表明，酶标记抗体工作溶液中加入的未标记抗体浓度越大，检测信号值越低，HOOK效应及平台期越不明显，标准曲线信号值对比见表7，高值样本检测结果见表8。
表7. 酶标抗体工作液中不同未标记同类抗体添加量对MYO项目标准曲线的影响
检测结果表明：未标记酶标抗体浓度添加量为0的情况，即体现了背景技术中指出的，随着抗原浓度提高（校准品浓度为13、85、240ng/mL），光信号值会出现平台期；当抗原浓度过高时，会导致信号值出现下降现象，进而出现假阴性。未标记抗原加入后，校准曲线各样本信号值会整体下降，但是会较大程度提高出现平台期或者HOOK效应对应的抗原浓度。
表8. 酶标抗体工作液中不同未标记同类抗体添加量对MYO高值样本检测结果的影响
检测结果表明：随着未标记酶标抗体浓度的提升，高值样本检测提升值与贝克曼的检测值偏差越小。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (3)
1.改善一步法双抗夹心反应中HOOK效应及平台期的方法，所述一步法双抗夹心反应是将样本、捕获抗体溶液和酶结合物抗体溶液同时加入至反应孔中进行孵育反应，其特征在于，向捕获抗体溶液中添加0.2μg/mL-2μg/mL未标记的同类型抗体或向酶标记抗体溶液中添加0.2μg/mL-2μg/mL未标记的同类型抗体。
2.根据权利要求1所述的改善一步法双抗夹心反应中HOOK效应及平台期的方法，其特征在于，所述捕获抗体溶液为向正常捕获抗体溶液中加入生物素标记抗体同货号的抗体，浓度为0.2μg/mL-2μg/mL。
3.根据权利要求1所述的改善一步法双抗夹心反应中HOOK效应及平台期的方法，所述酶结合抗体溶液为向正常酶结合抗体溶液中加入酶标记抗体同货号的抗体，浓度为0.2μg/mL-2μg/mL。
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