CN103175963A - Tp抗体检测法及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种梅毒螺旋体(TP)抗体检测法及其检测试剂盒，该检测法，包括：a)用小分子物质标记第一TP抗原；b)用第二TP抗原包被固相材料；c)以信号生成物质标记抗小分子物质抗体或其他能与小分子结合的物质，制备成信号报告分子；d)利用固相材料表面的第二TP抗原及小分子物质标记的第一TP抗原与样本中TP抗体发生免疫反应后，再利用信号报告分子与小分子物质的结合反应，形成带有可检测的信号生成物质，用于检测样本中TP抗体的含量；该检测试剂盒，包括：a)小分子物质标记的第一TP抗原；b)第二TP抗原包被的固相材料；c)信号报告分子。本发明能有效改善TP抗体检测的灵敏度和特异性。

Description

TP抗体检测法及其检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种梅毒螺旋体(TP)抗体检测试剂盒及其检测方法，特别是涉及一种基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定梅毒螺旋体抗体的方法及其相应的检测试剂盒。

背景技术

梅毒与肺结核、麻风并列为世界三大慢性传染病，主要经由性行为所感染，此外也可能经由输血感染，而妇女怀孕时感染梅毒，会经由胎盘传染给胎儿，造成先天性梅毒。梅毒由病原体苍白螺旋体引起。要确实证明感染梅毒并不容易，因为并无临床症状，潜伏期10天至90天，只能靠检测梅毒血清来帮助诊断。目前病人血清中的标志物主要是检测TP抗体。检测方法中双抗原夹心法检测TP抗体灵敏度较高，特异性较好。

中国专利CN1185255C“检测梅毒密螺旋体的组合物和方法”，则公开了与血清中TP抗体结合的抗原决定簇。中国专利申请CN1405565A“梅毒螺旋体抗体酶诊断试剂”，则公开了用抗原包被，用酶标二抗来检测血清中TP抗体的ELISA方法。中国专利申请CN101738473A“梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法”，公开了用双抗原夹心法检测TP抗体的化学发光法，北京科美东雅生物技术有限公司的专利申请CN101363860A“梅毒螺旋体抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法”，也公开了相似的方法，标记抗原的是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

目前，国内外尚未有以小分子为间接标记的双抗原夹心法测定TP抗体的技术用于检测人血清TP抗体的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定梅毒螺旋体抗体(TP)的方法及其相应的检测试剂盒。该检测方法克服了大分子(如：酶)标记TP抗原的缺点，可同时检测样本中的IgG、IgM、IgA、IgE等多类TP抗体，样本无需稀释，显著改善了TP抗体检测的特异性和灵敏度。

为解决上述技术问题，本发明的基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定梅毒螺旋体(TP)抗体的方法，包括步骤：

a)用小分子物质标记第一TP抗原；

b)用第二TP抗原包被固相材料；

c)以信号生成物质标记抗小分子物质抗体或其他能与小分子结合的物质，制备成信号报告分子；

所述信号生成物质，包括：酶、荧光物质、稀土离子、化学发光物质、电化学发光物质；能与小分子结合的物质，包括：链亲和素。

其中，酶，包括：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶；

荧光物质，包括：异硫氰酸荧光素FITC、荧光素；

稀土离子，包括：Eu³⁺、Sm³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺及其螯合物配基；

化学发光物质，包括：丫啶酯及其衍生物；

电化学发光物质，包括：多环芳烃类、酰肼类、联吡啶类化合物以及三联吡啶钌[Ru(bpy)₃]²⁺。

该信号报告分子是由信号生成物质标记的、能表征特异性结合反应程度的分子，如稀土离子标记的抗小分子抗体、酶标记或发光物质标记的链亲合素；

本步骤中，制备成信号报告分子的方法可为：

将抗小分子物质抗体或其他能与小分子结合的物质，通过过碘酸钠法与酶结合在一起；将抗小分子物质抗体或其他能与小分子结合的物质与带有反应官能团的荧光物质或化学发光物质混合，使它们结合在一起。在双功能官能团存在下，将抗小分子物质抗体或其他能与小分子结合的物质与酶、荧光物质或化学发光物质混合，使它们结合在一起。

d)利用固相材料表面的第二TP抗原及小分子物质标记的第一TP抗原与样本中TP抗体发生免疫反应，形成双抗原夹心复合物：第一TP抗原-TP抗体-第二TP抗原-小分子物质，然后，利用信号报告分子与小分子物质的结合反应，使形成的复合物带有可检测的信号生成物质，用于检测样本中TP抗体的含量。

步骤d)中的免疫反应，是指抗原或半抗原与针对它们的抗体之间的特异性结合，如本发明中的小分子半抗原与针对它们的抗体之间的特异性结合；其中，双抗原夹心复合物是以TP抗体为“桥”，通过桥连而形成的：第一TP抗原-TP抗体-第二TP抗原-小分子物质复合物。

所述步骤a)中的小分子物质包括：

(1)生物素分子；

(2)其他分子量小于10000的小分子半抗原，包括：地高辛、荧光素、甲状腺素、雌二醇、雌三醇、三碘甲腺原氨酸、睾酮、孕酮。

所述步骤a)中，标记的方法，包括：

(1)基于有机化学原理的小分子物质与蛋白质或多肽之间的连结方法；

如直接使用连接有反应活性官能团的小分子物质与TP抗原反应；或通过活化方式(如活化羰基为羧基)在小分子物质或TP抗原引入反应活性官能团，再与TP抗原或小分子物质反应；

(2)基于酶化学和基因重组技术的小分子物质与蛋白质或多肽之间的连结方法。如通过酶化学和基因重组技术直接在重组TP抗原上引入小分子物质，完成重组TP抗原的标记。

所述步骤a)、b)中，第一、第二TP抗原，包括：通过基因工程技术制备的梅毒螺旋体重组抗原，或通过合成方法制备的梅毒螺旋体特异性多肽。

所述步骤b)中，固相材料，包括：微孔反应板、试管、塑料颗粒或塑料微粒、磁微粒、或其它不同大小、形状的塑料制品。

所述步骤b)中，具体步骤包括：

(1)将TP抗原溶解于包被缓冲液后，浸泡固相材料，静置12～36小时；

其中，包被缓冲液是50mM pH7.8TSA缓冲液，其中，该缓冲液中含有：50mM Tris、150mMNaCl、1％(质量/体积)BSA、16％(质量/体积)的蔗糖；

(2)用含表面活性剂的缓冲液洗涤步骤(1)制备的TP抗原包被的固相材料后，加入含酪蛋白的缓冲液，静置8～24小时；

含表面活性剂的缓冲液，是含0.1％(体积/体积)Tween-20的50mM pH7.8TSA缓冲液；含酪蛋白的缓冲液，是含2％(质量/体积)酪蛋白的0.1％(体积/体积)Tween-20的50mMpH7.8TSA缓冲液。

(3)弃去缓冲液，干燥固相材料，从而完成TP抗原包被固相材料的制备。

所述步骤d)中，样本，包括：全血、血清、血浆、尿液、唾液；TP抗体，包括：由侵入人体的TP所引发的各种IgG、IgM、IgE、IgA等类型抗体。

所述步骤d)中，具体检测样本中TP抗体的步骤包括：

(1)直接在容器中加入未经稀释的样本；

(2)加入小分子物质标记的TP抗原，利用固相材料表面的TP抗原以及小分子物质标记的TP抗原与样本中的TP抗体反应；

(3)用缓冲液【如含0.1％(体积/体积)Tween-20的50mM TSA缓冲液(pH7.8)】；洗涤固相材料后，加入信号报告分子，使其与固相材料表面的小分子物质结合，形成带有信号生成物质的可检测复合物；

(4)用缓冲液【如含0.1％(体积/体积)Tween-20的50mM TSA缓冲液(pH7.8)】洗涤固相材料后，加入酶底物测量信号，或直接引发并测量信号，如闪烁光、电化学发光、荧光检测；然后，根据信号报告分子所产生的信号强弱确定样本中TP抗体的阴阳性或抗体滴度。

根据上述方法，本发明还公开了一种基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定TP抗体的检测试剂盒，包括：

a)小分子物质标记的第一TP抗原；

b)第二TP抗原包被的固相材料；

c)信号报告分子，包括：以信号生成物质标记的抗小分子物质抗体，或以信号生成物质标记的其他能与小分子结合的物质。

本发明采用小分子物质间接标记，结合双抗原夹心法检测抗TP抗体，同蛋白质或多肽标记TP抗原相比，小分子物质间接标记模式将显著改善TP抗体检测的灵敏度和特异性。

以小分子物质标记TP抗原检测TP抗体，有助于充分保留TP抗原的免疫反应活性。在用于TP抗体检测的各种TP抗原中，由多个优势抗原表位嵌合而成的TP基因重组抗原在使用上优势明显：它既浓缩了TP蛋白中高度保守、强免疫原性、抗体出现早的各优势抗原表位，又去除了与抗体结合不相关的氨基酸序列，因此，有很好的灵敏度和特异性；但对于这种浓缩了优势抗原表位的氨基酸序列，只有使用小分子为标记，才能有效避免空间位阻、覆盖等原因引起的抗原表位活性的下降与丧失，更好地展示TP抗原的免疫反应活性，有利于TP抗体的高灵敏检测。另外，以小分子物质为间接标记，通过TP抗原上的多个小分子与信号报告分子的结合，可引入一信号放大系统，可有效改善抗TP抗体的检测灵敏度。

以小分子物质为间接标记的双抗原夹心法，还可以显著改善TP抗体检测的特异性。除了固相抗原对抗体的特异识别能力外，以小分子物质标记抗原代替间接法中的标记第二抗体增加了二个重要的特异性因素：1)非特异吸附或非特异结合的人源抗体不被小分子标记抗原识别；2)即使包被抗原存在与非特异抗体一定程度的结合，也可通过选择另一种缺乏这种非特异结合的标记抗原与之配对，从而消除该抗体同时结合包被抗原和标记抗原的能力。

由于以小分子物质为间接标记的双抗原夹心法具有优良的检测特异性，因而，可以使用未经稀释的血清或血浆作为标本(标本中的抗TP抗体未被稀释)，有利于样本中多类抗TP抗体(如：IgG、IgM、IgA、IgE等)的检出。

基于上述因素，以小分子物质为间接标记的双抗原夹心法测定TP抗体可以有效改善TP抗体检测的灵敏度和特异性。

本发明的有益效果如下：

(1)以小分子物质标记TP抗原检测TP抗体，有助于充分保留TP抗原的免疫反应活性，有效改善TP抗体的检测灵敏度；

(2)以小分子物质标记TP抗原可以使一个TP抗原上带有多个小分子标记，从而可与多个信号报告分子结合，产生有效的信号放大作用，进一步提高了TP抗体检测的灵敏度；

(3)在双抗原夹心法中，非特异吸附或与固相试剂非特异结合的人源抗体不会被小分子标记的抗原识别，从而显著地改善了TP抗体检测的特异性；

(4)本方法特异性好，因而本发明所涉及检测方法无须稀释样本，样本直接用于检测，有利于抗TP抗体的检出；除了检测TP IgG类型的抗体外，双抗原夹心法还可检测IgM、IgE、IgA等多个类型的抗体；尤其是IgM抗体的检测，有利于缩短TP抗体检测的窗口期。

具体实施方式

实施例1生物素标记TP抗原的制备

步骤如下：

(1)将购买的TP重组抗原(N15、N17和N47)在室温(20～25℃)对pH 7.4100mMPBS透析24小时，换液2次，每次2000mL。调整浓度至约1mg/mL。

(2)取所需量的Biotin-cap-NHS，用二甲基甲酰胺(DMF)溶解成10mg/mL，按Biotin-cap-NHS与抗原质量比为1∶2的比例，马上加入到透析后的TP重组抗原溶液中，快速混匀。室温(20～25℃)静置1小时。

(3)室温(20～25℃)对pH 7.8、50mM TSA【50mM Tris，含150mM NaCl、1％(质量/体积)BSA、16％(质量/体积)的蔗糖】充分搅拌透析24小时，换液2次，每次1000mL。得到纯化的生物素标记TP抗原。

实施例2Eu标记链亲和素的制备

步骤如下：

(1)将链亲和素1mg溶于2000μL纯水，室温(20～25℃)对pH 9.5100mM CBS(100mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，含150mM NaCl)透析24小时，换液两次，每次2000mL。

(2)取1mg Eu-DTTA，用1000μL pH 9.5100mM CBS溶解。将溶解完全的Eu-DTTA加入透析后的链亲和素溶液中(约1mg/mL)，边加边振荡，室温(20～25℃)静置72小时。Eu-DTTA与链亲和素的质量比约为1∶1。

(3)用Sephacryl S-200HR(1.6×50cm)分离Eu-SA(Eu³⁺-标记链亲和素)与游离的Eu-DTTA，用pH 7.850mM TSA洗脱。分离过程以核酸蛋白检测仪监控。得到纯化的Eu³⁺标记链亲和素。标记效率是检测标记过程的指标，具体计算方式如下：

通过测量、对比已知Eu³⁺浓度的标准溶液与Eu-SA溶液的荧光强度(613nm)，确定Eu-SA溶液中的Eu³⁺浓度，单位为μmol/L。

按以下公式计算标记率：

SA(mg/mL)＝[A280-0.008×Eu³⁺(μmol/L)]/2.0

SA(μmol/L)＝SA(mg/mL)×106/66,000

标记率＝Eu³⁺浓度/SA浓度＝Eu³⁺(μmol/L)/SA(μmol/L)

其中，A280＝纯化的Eu-SA溶液在280nm处的吸光度；

Eu³⁺(μmol/L)＝纯化的Eu-SA溶液中Eu³⁺的浓度。

SA的分子量是66kD，1mg/mL时的吸收值是2.0。

通过计算Eu标链亲和素溶液中Eu³⁺和链亲和素的摩尔数，得到链亲和素的Eu³⁺标记率，平均每个链亲和素的Eu³⁺标记率应大于4。

实施例3TP抗原包被微孔板的制备

步骤如下：

(1)移取适量TP重组抗原于所需体积的包被缓冲液(50mM TSA缓冲液，pH7.8)中，充分混匀，避免产生气泡，配制成终浓度2-8μg/ml的TP抗原包被液；

(2)取微孔板每孔加入TP抗原包被液100μL，室温(20～25℃)静置24小时；

(3)用含0.1％Tween-20的50mM pH7.8TSA缓冲液洗涤2次；每孔注入封闭缓冲液【含2％(质量/体积)酪蛋白，0.1％(体积/体积)Tween-20的50mM pH7.8TSA缓冲液】300μL，室温(20～25℃)静置过夜约16小时；

(4)吸干封闭缓冲液，将板子放入甩干机甩干5分钟；打开冻干机，使真空度＜50Pa，保持3小时，停机，将干燥后反应板装入锡铂袋并热封后，置于2～8℃保存。

实施例4TP抗体的检测

采用实施例3制备的TP抗原包被的微孔板进行TP抗体检测，具体步骤如下：

(1)将样品对应微孔按序编号，每板应设抗TP阴性对照、阳性对照(或浓度由低到高的线性参比品A～F)各2孔。

(2)吸取25μL的样品或校准品按顺序加入相应微孔。

(3)在各微孔内加入稀释的实施例1制备的100μL生物素标记抗原工作液(终浓度0.2-0.8μg/ml)，室温(20～25℃)慢速振荡45分钟。

(4)配制Eu标记链亲和素工作液：对每一条12孔板，取75μL实施例2制备的Eu标记链亲和素(21×)，加1.5mL分析缓冲液，充分混匀(1∶21稀释)。

(5)用含0.1％(体积/体积)Tween-20的50mM TSA缓冲液(pH7.8)洗板5次，将板条在洁净的吸水纸上拍干。

(6)在每个微孔内加入100μL步骤(4)制备的Eu³⁺标记链亲和素工作液，室温(20～25℃)慢速振荡15分钟。

(7)用含0.1％Tween-20的50mM TSA缓冲液(pH7.8)洗板6次，将板条在洁净的吸水纸上拍干。

(8)在每个微孔内加入100μL的增强液【1.0％(体积/体积)冰乙酸和2.0％(质量/体积)邻苯二甲酸氢钾缓冲液，含有0.4％(质量/体积)β-萘基甲酰三氟丙酮(β-NTA)，2％(质量/体积)三正辛基氧膦(TOPO)，0.1％(体积/体积)Triton X-100】，室温(20～25℃)慢速振荡5分钟。

(9)选择新波生物有限公司生产的Anytest2000荧光检测仪测荧光强度。

其中，根据上述检测方法，形成的三批基于小分子生物素间接标记的双抗原夹心TP抗体检测试剂盒(包括：生物素标记抗原工作液、Eu³⁺标记链亲和素工作液、TP抗原包被的微孔板)，对国家TP质控血清盘(批号240013-200901)，进行TP抗体检测，其检测结果见表1。

表1中20101210批，20101230批，20101020批代表试剂盒批号，弱阳性抗TP精密性质控品是根据收集的弱阳性血清，混合配制。阴性对照和阳性对照为根据收集的血清检测荧光值后，自行配制的两份参考血样，阴性对照由荧光值较低的血液混合配制，阳性对照由荧光值较高的血样混合配制。Cut-off值为区分阴阳性血液界限的荧光值，由检测大量的阴性血样荧光值后通过统计学方法计算得到。

表1

从表1中可看出：

1)特异性：中国药品生物制品检定所提供的20份阴性参比品，假阳性0份，特异性为100％，完全符合要求。

2)灵敏度：中国药品生物制品检定所提供的10份阳性参比品，检出10份，灵敏度为100％，符合要求。其中的4份灵敏度参考品L1、L2、L3及L4，L1、L2检为阳性，L3、L4检为阴性，完全符合要求。

3)精密性：抗TP精密性质控品1份，平行测定10孔，变化系数CV＜10％，完全符合要求。

4)试剂盒(包括：生物素标记抗原工作液、Eu³⁺标记链亲和素工作液、TP抗原包被的微孔板)通过37℃7天烘烤，仍能达到国家规定的灵敏度和特异性。

另外，采用本实施例的检测试剂盒，与国内市售K公司抗-TP ELISA诊断试剂盒(批号：20101205，效期：20110602)、W公司抗-TP ELISA诊断试剂盒(批号：20100404，效期：20101001)和X公司抗-TP ELISA诊断试剂盒(批号：20100428)比较，对中国生物制品检定所100份已确认的抗-TP质控参比品(45份阳性和55份阴性)的检测结果，见表2。

表2

由表2可见，本发明的基于小分子生物素间接标记的双抗原夹心TP抗体检测试剂盒，与K、W、X三公司的抗-TP ELISA间接法检测检定所抗-TP质控参比品的结果对比可知，本发明的基于小分子生物素间接标记的双抗原夹心TP抗体检测试剂盒灵敏度和特异性均明显优于国产抗-TP ELISA诊断试剂盒，尤其在特异性方面优势明显。

再者，本发明的基于小分子生物素间接标记的双抗原夹心TP抗体检测试剂盒，与上述K、W、X三公司的抗-TP ELISA间接法检测15份自行收集的TP-IgM抗体阳性、TP RNA阳性标本结果对比，如表3所示。

表3

由表3可知，对于TP-IgM抗体阳性、TP RNA阳性标本，本发明中基于小分子生物素间接标记的双抗原夹心TP抗体检测试剂盒的检出率明显优于国产ELISA试剂盒。

通过上述实验结果可看出：

(1)以小分子物质为间接标记检测TP抗体，有效地改善了TP抗体的检测灵敏度。

(2)以小分子物质为间接标记检测TP抗体，有效地改善了TP抗体的检测特异性。

(3)以小分子物质为间接标记的双抗原夹心法检测TP抗体，不仅能检测TP IgG类型的抗体，还有利于检测IgM、IgE、IgA等多个类型的抗体。

Claims (10)

1.一种基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定梅毒螺旋体抗体的方法，其特征在于，包括步骤：

a)用小分子物质标记第一梅毒螺旋体抗原；

b)用第二梅毒螺旋体抗原包被固相材料；

c)以信号生成物质标记抗小分子物质抗体或能与小分子结合的物质，制备成信号报告分子；

d)利用固相材料表面的第二梅毒螺旋体抗原及小分子物质标记的第一梅毒螺旋体抗原与样本中梅毒螺旋体抗体发生免疫反应，形成双抗原夹心复合物；

然后，利用信号报告分子与小分子物质的结合反应，使形成带有可检测的信号生成物质，用于检测样本中梅毒螺旋体抗体的含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤a)中，小分子物质包括：(1)生物素分子；(2)分子量小于10000的小分子半抗原；

标记的方法，包括：

(1)基于有机化学原理的小分子物质与蛋白质或多肽之间的连结方法；

(2)基于酶化学和基因重组技术的小分子物质与蛋白质或多肽之间的连结方法。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述小分子半抗原，包括：地高辛、荧光素、甲状腺素、雌二醇、雌三醇、三碘甲腺原氨酸、睾酮、孕酮。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤a)、b)中，第一、第二梅毒螺旋体抗原，包括：通过基因工程技术制备的梅毒螺旋体重组抗原，或通过合成方法制备的梅毒螺旋体特异性多肽。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤b)中，固相材料，包括：微孔反应板、试管、塑料颗粒或塑料微粒、磁微粒；

包被的步骤，包括：

(1)将梅毒螺旋体抗原溶解于包被缓冲液后，浸泡固相材料，静置12～36小时；

(2)用含表面活性剂的缓冲液洗涤步骤(1)制备的梅毒螺旋体抗原包被的固相材料后，加入含酪蛋白的缓冲液，静置8～24小时；

(3)弃去缓冲液，干燥固相材料，从而完成梅毒螺旋体抗原包被固相材料的制备。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，包被缓冲液是50mM pH7.8TSA缓冲液，其中，该缓冲液中含有：50mM Tris、150mM NaCl、1％BSA、16％的蔗糖；

步骤(2)中，含表面活性剂的缓冲液，是含0.1％Tween-20的50mM pH7.8TSA缓冲液；含酪蛋白的缓冲液，是含2％酪蛋白的0.1％Tween-20的50mM pH7.8TSA缓冲液。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤c)中，信号生成物质，包括：酶、荧光物质、稀土离子、化学发光物质、电化学发光物质；

能与小分子结合的物质，包括：链亲和素；

其中，酶，包括：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶；

荧光物质，包括：异硫氰酸荧光素、荧光素；稀土离子，包括：Eu³⁺、Sm³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺及其螯合物配基；化学发光物质，包括：丫啶酯及其衍生物；电化学发光物质，包括：多环芳烃类、酰肼类、联吡啶类化合物以及三联吡啶钌。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤d)中，样本，包括：全血、血清、血浆、尿液、唾液；

梅毒螺旋体抗体，包括：由侵入人体的梅毒螺旋体所引发的抗体；

步骤d)中，检测样本中梅毒螺旋体抗体的步骤，包括：

(1)直接在容器中加入未经稀释的样本；

(2)加入小分子物质标记的梅毒螺旋体抗原，利用固相材料表面的梅毒螺旋体抗原以及小分子物质标记的梅毒螺旋体抗原与样本中的梅毒螺旋体抗体反应；

(3)洗涤固相材料后，加入信号报告分子，使其与固相材料表面的小分子物质结合，形成带有信号生成物质的可检测复合物；

(4)洗涤固相材料后，加入酶底物测量信号，或直接引发并测量信号，根据信号报告分子所产生的信号强弱确定样本中梅毒螺旋体抗体的阴阳性或抗体滴度。

9.如权利要求1所述的基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定梅毒螺旋体抗体的检测试剂盒，其特征在于，包括：

a)小分子物质标记的第一梅毒螺旋体抗原；

b)第二梅毒螺旋体抗原包被的固相材料；

c)信号报告分子，包括：以信号生成物质标记的抗小分子物质抗体，或以信号生成物质标记的能与小分子结合的物质。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述小分子物质，包括：生物素分子、地高辛、荧光素、甲状腺素、雌二醇、雌三醇、三碘甲腺原氨酸、睾酮或孕酮。