CN1885039A - 小分子间接标记的双抗原夹心法测定丙型肝炎病毒总抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及测定丙型肝炎病毒(HCV)总抗体的方法，是一种基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定丙型肝炎病毒总抗体的方法，其特点在于：使用小分子物质为标记，采用双抗原夹心方式检测样本中抗HCV总抗体。方法包括的步骤是：用小分子物质标记HCV抗原；将HCV抗原包被固相材料；以信号生成物质标记抗小分子抗体或其他能与小分子结合的物质。样本中的抗HCV抗体可与固相材料表面的HCV抗原及小分子标记的HCV抗原反应，形成双抗原夹心复合物，然后通过小分子与信号报告分子反应，使形成的复合物带有可检测的信号生成物质。本发明结合小分子标记有利于保持抗原活性、具有信号放大作用以及双抗原夹心模式特异性好、可检测多类抗体等特点，显著地提高了HCV抗体检测的灵敏度和特异性。

Description

小分子间接标记的双抗原夹心法测定丙型肝炎病毒总抗体

一、技术领域：

本发明涉及体外免疫诊断领域，特别是一种基于小分子间接标记的双抗原夹心免疫测定丙型肝炎病毒(HCV)总抗体的方法。

二、背景技术：

丙型肝炎是一种世界范围的疾病，全球HCV感染率约3％(1.7亿人)；我国丙型肝炎流行率为3.2％，感染人数超过4100万。由于大多数HCV急性感染者没有症状或症状不明显，并且体内病毒难以清除，大约70～80％的病例将转为慢性HCV感染，慢性HCV感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)，对患者的健康和生命危害极大。HCV感染已成为严重的社会和公共卫生问题。

血液传染是HCV感染的主要途径；HCV抗体的检测有效地降低了HCV的输血感染，也为丙型肝炎的诊断提供了有价值的信息。目前国内各医院、血站检测HCV抗体均采用标记第二抗体的间接法，假阳性率很高；为降低间接法过多的假阳性，公开号CN1548958A的中国专利(李晨阳，李玉林。丙型肝炎病毒抗体桥式双抗原夹心ELISA检测法。公开日：2004年11月24日，公开号：CN1548958A)公开了一种利用基因重组技术标记HCV抗原的方法：通过基因表达获得一种融合蛋白，该融合蛋白除了含有HCV抗原外，还含有一“桥蛋白”如铁硫氧还蛋白，HCV抗原可通过“桥蛋白”与一酶标记的抗“桥蛋白”抗体连接，实现HCV抗原的酶标记。公开号CN1670532A的中国专利(王保君，冯长访，马晓辉。检测丙肝病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法、检测方法。公开日：2005年9月21日，公开号：CN1670532A)还公开了一种直接使用酶分子通过化学连接标记HCV抗原的方法，用于抗HCV抗体的ELISA检测。上述专利内容均采用分子量较大的蛋白质或多肽作为标记。

目前国内外尚未有以小分子为间接标记的双抗原夹心法测定HCV总抗体的技术用于检测人血清HCV总抗体的报道。

三、发明内容：

本发明的目的是，以小分子为间接标记建立一种测定丙型肝炎病毒(HCV)总抗体的双抗原夹心免疫检测方法。该检测方法克服了大分子(如：酶)标记HCV抗原的缺点，可同时检测样本中的IgG、IgM、IgA、IgE等多类HCV抗体，样本无需稀释，显著改善了HCV抗体检测的特异性和灵敏度。

本发明的技术方案：一种基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定丙型肝炎病毒(HCV)总抗体的方法，其特征在于方法包括以下步骤：

a)用小分子物质标记HCV抗原；

b)用HCV抗原包被固相材料；

c)以信号生成物质标记抗小分子抗体或其他能与小分子结合的物质，制备成信号报告分子；

d)利用固相材料表面的HCV抗原及小分子标记的HCV抗原与样本中HCV抗体发生免疫反应，形成双抗原夹心复合物：HCV抗原(1)-HCV抗体-HCV抗原(2)-小分子，然后利用信号报告分子与小分子的结合反应，使形成的复合物带有可检测的信号生成物质，用于检测样本中HCV总抗体的含量。

所述的“小分子”指：

(1)生物素分子；

(2)其它分子量小于10000的小分子半抗原，如地高辛、荧光素、甲状腺素、雌二醇、雌三醇、三碘甲腺原氨酸、睾酮、孕酮等。

所述的信号生成物质是指酶、荧光物质、稀土离子如Eu³⁺、Sm³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺及其螯合物配基、化学发光物质如丫啶酯及其衍生物、三联吡啶钌。

所述的信号报告分子是指由信号生成物质标记的、能表征特异性结合反应程度的分子，如稀土离子标记的抗小分子抗体、酶标记或发光物质标记的链亲合素。

所述的免疫反应指抗原或半抗原与针对它们的抗体之间的特异性结合，如本发明中的小分子半抗原与针对它们的抗体之间的特异性结合。

所述的双抗原夹心复合物是以HCV抗体为“桥”，通过桥连而形成的HCV抗原(1)-HCV抗体-HCV抗原(2)-小分子复合物；

本发明中以小分子为间接标记测定HCV总抗体的双抗原夹心免疫的方法，其特征在于：

(1)用小分子物质标记HCV抗原的方法：

直接使用连接有反应活性官能团的小分子与HCV抗原反应；或通过活化方式在小分子或HCV抗原引入反应活性官能团，再与HCV抗原或小分子反应；也可以通过酶化学和基因重组技术直接在重组HCV抗原上引入小分子，完成重组HCV抗原的标记；

(2)将HCV抗原包被固相材料的方法：

将HCV抗原溶解于缓冲液，与固相材料接触并静置5～24小时；用含表面活性剂的缓冲液洗涤固相材料；加入含酪蛋白的缓冲液，静置3～12小时；弃去含酪蛋白的缓冲液，干燥固相材料。完成HCV抗原包被固相材料的制备。

(3)信号报告分子的制备方法，即：以酶、荧光物质、化学发光物质或其它信号生成物质标记抗小分子抗体或其他能与小分子结合的物质的方法：

将抗小分子抗体或其他能与小分子结合的物质通过过碘酸钠法与酶结合在一起；将抗小分子抗体或其他能与小分子结合的物质与带有反应官能团的荧光物质或化学发光物质混合，使它们结合在一起。在双功能官能团存在下，将抗小分子抗体或其他能与小分子结合的物质与酶、荧光物质或化学发光物质混合，使它们结合在一起。

本发明中以小分子为间接标记测定HCV总抗体的双抗原夹心免疫的方法，其特征在于步骤d)所述的检测样本中HCV总抗体的检测包括以下步骤：

(1)在固相材料中加入未经稀释的样本；

(2)加入小分子标记HCV抗原；利用固相材料表面的HCV抗原及小分子标记的HCV抗原与样本中HCV抗体的免疫反应，形成双抗原夹心复合物：HCV抗原(1)-HCV抗体-HCV抗原(2)-小分子；

(3)加入信号报告分子，信号报告分子与小分子结合，形成带有信号生成物质的可检测复合物；

(4)根据信号报告分子所产生的信号强弱确定样本中HCV总抗体的阴阳性或抗体滴度。

本发明采用小分子间接标记，结合双抗原夹心法检测抗HCV抗体，同蛋白质或多肽标记HCV抗原相比，小分子间接标记模式将显著改善HCV抗体检测的灵敏度和特异性。

以小分子标记HCV抗原检测HCV抗体，有助于充分保留HCV抗原的免疫反应活性。在用于HCV抗体检测的各种HCV抗原中，由多个优势抗原表位嵌合而成的HCV基因重组抗原在使用上优势明显：它既浓缩了HCV蛋白中高度保守、强免疫原性、抗体出现早的各优势抗原表位，又去除了与抗体结合不相关的氨基酸序列，因此有很好的灵敏度和特异性；但对于这种浓缩了优势抗原表位的氨基酸序列，只有使用小分子为标记，才能有效避免空间位阻、覆盖等原因引起的抗原表位活性的下降与丧失，更好地展示HCV抗原的免疫反应活性，有利于HCV抗体的高灵敏检测。另外，以小分子为间接标记，通过HCV抗原上的多个小分子与信号报告分子的结合，可引入一信号放大系统，可有效改善抗HCV抗体的检测灵敏度。

以小分子为间接标记的双抗原夹心法还可以显著改善HCV抗体检测的特异性。除了固相抗原对抗体的特异识别能力外，以小分子标记抗原代替间接法中的标记第二抗体增加了二个重要的特异性因素：1)非特异吸附或非特异结合的人源抗体不被小分子标记抗原识别；2)即使包被抗原存在与非特异抗体一定程度的结合，也可通过选择另一种缺乏这种非特异结合的标记抗原与之配对，从而消除该抗体同时结合包被抗原和标记抗原的能力。

由于以小分子为间接标记的双抗原夹心法具有优良的检测特异性，因而可以使用未经稀释的血清或血浆作为标本(标本中的抗HCV抗体未被稀释)，有利于样本中多类抗HCV抗体(如：IgG、IgM、IgA、IgE等)的检出。

基于上述因素，以小分子为间接标记的双抗原夹心法测定HCV总抗体可以有效改善HCV抗体检测的灵敏度和特异性。

本发明的优点或效果如下：

(1)以小分子标记HCV抗原检测HCV抗体，有助于充分保留HCV抗原的免疫反应活性，有效改善HCV抗体的检测灵敏度。

(2)以小分子标记HCV抗原可以使一个HCV抗原上带有多个小分子标记，从而可与多个信号报告分子结合，产生有效的信号放大作用，进一步提高了HCV抗体检测的灵敏度。

(3)在双抗原夹心法中，非特异吸附或与固相试剂非特异结合的人源抗体不会被小分子标记的抗原识别，从而显著地改善了HCV抗体检测的特异性；

(4)本方法特异性好，因而本发明所涉及检测方法无须稀释样本，样本直接用于检测，有利于抗HCV抗体的检出；

除了检测HCV IgG类型的抗体外，双抗原夹心法还可检测IgM、IgE、IgA等多个类型的抗体；尤其是IgM抗体的检测，有利于缩短HCV抗体检测的窗口期。

四、具体实施方式：

实施例1生物素标记HCV抗原的制备

步骤如下：

(1)将HCV重组抗原在室温(+20～+25℃)对pH 7.4 100mM PBS(含3M尿素)透析24小时，换液2次，每次2,000mL。调整浓度至约1mg/mL。

(2)取所需量的Biotin-cap-NHS，用DMF溶解成40mg/mL，按Biotin-cap-NHS与抗原质量比为1∶2的比例，马上加入到透析后的HCV重组抗原溶液中，快速混匀。室温(+20～+25℃)静置1小时。

(3)室温(+20～+25℃)对pH 7.8，50mM TSA(含3M尿素)充分搅拌透析24小时，换液2次，每次1,000mL。得到纯化的生物素标记HCV抗原。

实施例2Eu标记链亲和素的制备

步骤如下：

(1)将链亲和素1mg溶于2,000μL纯水，室温(+20～+25℃)对pH 9.6 100mM CBS透析24小时，换液两次，每次2,000mL。

(2)取1mg Eu-DTTA，用1000μL pH 9.5 100mM CBS溶解。将溶解完全的Eu-DTTA加入透析后的链亲和素溶液中(约1mg/mL)，边加边振荡，室温(+20～+25℃)静置72小时。Eu-DTTA与链亲和素的质量比约为1∶1。

(3)用Sephacryl S-200 HR(1.6×50cm)分离Eu-SA与游离的Eu-DTTA，用pH 7.850mM TSA洗脱。分离过程以核酸蛋白检测仪监控。得到纯化的Eu标记链亲和素。

实施例3HCV抗原包被微孔板的制备

步骤如下：

(1)移取适量HCV重组抗原于所需体积的包被缓冲液中，充分混匀，避免产生气泡，配制成HCV抗原包被液；

(2)取微孔板每孔加入HCV抗原包被工作液100μL，室温(+20～+25℃)静置24小时；

(3)洗涤2次；每孔注入封闭缓冲液300μL，室温(+20～+25℃)静置过夜(约16小时)；

(4)吸干封闭缓冲液，每孔加入4％(w/v)蔗糖溶液300μL，吸干，将板子放入甩干机甩干5分钟；打开冻干机，使真空度＜50Pa，保持3小时，停机，将干燥后反应板装入锡铂袋并热封置2～8℃保存。

实施例4HCV总抗体的检测

步骤如下：

(1)将样品对应微孔按序编号，每板应设抗-HCV阴性对照、阳性对照(或线性参比品A～F)各2孔。

(2)吸取25μL的样品或校准品按顺序加入相应微孔。

(3)在各微孔内加入100μL生物素标记抗原工作液，室温(+20～+25℃)慢速振荡45分钟。

(4)配制Eu标记链亲和素工作液：对每一条12孔板，取75μL Eu标记链亲和素(21×)，加1.5mL分析缓冲液，充分混匀(1∶21稀释)。第二步温育前45分钟内配制。

(5)洗板5次，将板条在洁净的吸水纸上拍干。

(6)在每个微孔内加入100μL Eu标记链亲和素工作液，室温(+20～+25℃)慢速振荡15分钟。

(7)洗板6次，将板条在洁净的吸水纸上拍干。

(8)在每个微孔内加入100μL的增强液，室温(+20～+25℃)慢速振荡5分钟。

(9)选择相应程序测荧光强度。

三批基于小分子生物素间接标记的双抗原夹心HCV总抗体诊断试剂盒对国家Panel(批号0401)的测定：

	20040510批		20040610批		20040710批
							4℃	37℃ 7天	4℃	37℃ 7天	4℃	37℃ 7天
	阳性参比品符合率(30份)	29/30	29/30	29/30	29/30	29/30							29/30
阴性参比品符合率(30份)							30/30	30/30	30/30	30/30	30/30	30/30
	灵敏度参考品符合率	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4							4/4
精密度参考品荧光强度(CPS)							121274	108859	121135	108577	121997	109903
	CV(n＝10)	3.34％	3.47％	4.20％	2.62％	3.30％							5.51％
阴性对照(荧光强度，CPS)							1365	1282	1510	1126	1536	1166
	阳性对照(荧光强度，CPS)	242820	216760	242937	220798	245319							219966
Cut-off值(荧光强度，CPS)							13506	12120	13656	12165	13801	12164

特异性：中国药品生物制品检定所提供的30份阴性参比品，假阳性0份，特异性为100％，完全符合要求。

灵敏度：中国药品生物制品检定所提供的30份阳性参比品，检出29份，灵敏度为96.7％，符合要求。4份灵敏度参考品，L1、L2和L3检为阳性，L4检为阴性，完全符合要求。

精密性：抗-HCV精密性质控品1份，平行测定10孔，CV＜10％，完全符合要求。

试剂通过37℃ 7天烘烤，仍能达到国家规定的灵敏度和特异性。

基于小分子生物素间接标记的双抗原夹心HCV总抗体诊断试剂盒对上海血液中心Panel的测定：

抗-HCV诊断试剂盒	上海血液中心Panel结果
				阳性	阴性	合计
	阳性	15	0				15
阴性				0	15	15
	总数	15	15				30

灵敏度＝15/(15+0)×100％＝100％

特异性＝15/(15+0)×100％＝100％

符合率＝(15+15)/(15+0+15+0)＝100％

基于小分子生物素间接标记的双抗原夹心HCV总抗体诊断试剂盒对卫生部临床检验中心Panel的测定：

抗-HCV诊断试剂盒	卫生部临床检验中心Panel结果
				阳性	阴性	合计
	阳性	24	0				24
阴性				1	25	26
	总数	25	25				50

灵敏度＝24/(24+1)×100％＝96％

特异性＝25/(25+0)×100％＝100％

符合率＝(24+25)/(24+0+25+0)＝98％

以上结果显示，基于小分子生物素间接标记的HCV总抗体诊断试剂盒在灵敏度和特异性方面都可达到临床实验和血液筛查的要求。

对中国生物制品检定所100份已确认的抗-HCV质控参比品的检测，与国内抗-HCV ELISA诊断试剂盒的比较。

与国内市售K公司抗-HCV ELISA诊断试剂盒(批号：20031205，效期：20040602)、W公司抗-HCV ELISA诊断试剂盒(批号：C20040404，效期：20041001)和X公司抗-HCV ELISA诊断试剂盒(批号：SHJ020428)比较，对中国生物制品检定所100份已确认的抗-HCV质控参比品(45份阳性和55份阴性)的检测结果，见下表：

基于小分子生物素间接标记的双抗原夹心HCV总抗体诊断试剂盒与K、W、X三公司的抗-HCV ELISA间接法检测检定所抗-HCV质控参比品的结果对比：

	中国生物制品检定所抗-HCV质控参比品
						小分子间接标记的双抗原夹心法	K-ELISA	W-ELISA	X-ELISA
真阳性	42	39	36	37
					假阴性	3	6	9	8
灵敏度	93.33％	86.67％	86.67％	82.22％
					真阴性	50	44	43	45
假阳性	5	11	12	10
					特异性	90.91％	80％	78.18	81.82％
总符合率	92％	83％	79％	82％

由上表可见，基于小分子生物素间接标记的双抗原夹心HCV总抗体诊断试剂盒灵敏度和特异性均明显优于国产抗-HCV ELISA诊断试剂盒，尤其在特异性方面优势明显。

基于小分子生物素间接标记的双抗原夹心HCV总抗体诊断试剂盒与K、W、X三公司的抗-HCV ELISA间接法检测15份HCV-IgM抗体阳性、HCV RNA阳性标本结果对比：

	15份HCV-IgM抗体阳性、HCV RNA阳性标本
					小分子间接标记的双抗原夹心法	K-ELISA	W-ELISA	X-ELISA
	阳性	12	6	5					7
阳性率					80％	40％	33.3％	46.7％

由上表可见，对于HCV-IgM抗体阳性、HCV RNA阳性标本，本发明中基于小分子生物素间接标记的双抗原夹心HCV总抗体诊断试剂盒的检出率明显优于国产ELISA试剂。

通过上述实验结果可看出：

(1)以小分子为间接标记检测HCV抗体，有效地改善了HCV抗体的检测灵敏度。

(2)以小分子为间接标记检测HCV抗体，有效地改善了HCV抗体的检测特异性。

(3)以小分子为间接标记的双抗原夹心法检测HCV抗体，不仅能检测HCV IgG类型的抗体，还有利于检测IgM、IgE、IgA等多个类型的抗体。

Claims (10)

1.一种基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定丙型肝炎病毒总抗体的方法，其特征在于方法包括以下步骤：

a)用小分子物质标记丙型肝炎病毒抗原；

b)用丙型肝炎病毒抗原包被固相材料；

c)以信号生成物质标记抗小分子抗体或其他能与小分子结合的物质，制备成信号报告分子；

d)利用固相材料表面的丙型肝炎病毒抗原及小分子标记的丙型肝炎病毒抗原与样本中丙型肝炎病毒抗体的免疫反应，形成双抗原夹心复合物：丙型肝炎病毒抗原(1)—丙型肝炎病毒抗体—丙型肝炎病毒抗原(2)-小分子；然后利用小分子与信号报告分子的结合反应，使形成的复合物带有可检测的信号生成物质，用于检测样本中丙型肝炎病毒总抗体的含量。

2.根据权利要求1所述的基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定丙型肝炎病毒总抗体的方法，其特征在于步骤a)所述的小分子物质包括：

(1)生物素分子；

(2)其它分子量小于10000的小分子半抗原，如地高辛、荧光素、甲状腺素、雌二醇、雌三醇、三碘甲腺原氨酸、睾酮、孕酮。

3.根据权利要求1所述的基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定丙型肝炎病毒总抗体的方法，其特征在于步骤a)所述的标记反应包括：

(1)基于有机化学原理的小分子与蛋白质或多肽之间的连结方法；

(2)基于酶化学和基因重组技术的小分子与蛋白质或多肽之间的连结方法。

4.根据权利要求1所述的基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定丙型肝炎病毒总抗体的方法，其特征在于：步骤a)、b)所述的丙型肝炎病毒抗原指通过基因工程技术制备的丙型肝炎病毒重组抗原或通过合成方法制备的丙型肝炎病毒特异性多肽。

5.根据权利要求1所述的基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定丙型肝炎病毒总抗体的方法，其特征在于：步骤b)所述的固相材料指微孔反应板、试管、塑料颗粒或塑料微粒、磁微粒、或其它不同大小、形状的塑料制品。

6.根据权利要求1所述的基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定丙型肝炎病毒总抗体的方法，其特征在于步骤b)所述的丙型肝炎病毒抗原包被固相材料的步骤是：

(1)将丙型肝炎病毒抗原溶解于包被缓冲液，以包被缓冲液浸泡固相材料；静置12～24小时；

(2)用含表面活性剂的缓冲液洗涤固相材料；加入含酪蛋白的缓冲液，静置3～12小时；

(3)弃去包被缓冲液，干燥固相材料，完成重组丙型肝炎病毒抗原包被固相材料的制备。

7.根据权利要求1所述的基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定丙型肝炎病毒总抗体的方法，其特征在于：步骤c)所述的信号生成物质指酶、荧光物质、稀土离子如Eu³⁺、Sm³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺及其螯合物配基、化学发光物质或电化学发光物质；信号报告分子指信号生成物质标记的抗小分子抗体或其它能与小分子结合的分子。

8.根据权利要求1所述的基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定丙型肝炎病毒总抗体的方法，其特征在于：步骤d)所述的丙型肝炎病毒总抗体指由侵入人体的丙型肝炎病毒所引发的各种IgG、IgM、IgE、IgA等类型抗体。

9.根据权利要求1所述的基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定丙型肝炎病毒总抗体的方法，其特征在于步骤d)所述的检测样本中丙型肝炎病毒总抗体的步骤是：

(1)直接在容器中加入未经稀释的样本；

(2)加入小分子标记的丙型肝炎病毒抗原；固相材料表面的丙型肝炎病毒抗原以及小分子标记的丙型肝炎病毒抗原与样本中的丙型肝炎病毒抗体反应；

(3)洗涤固相材料；加入信号报告分子，使其与固相材料表面的小分子标记物结合；

(4)洗涤固相材料；加入酶底物测量信号，或直接引发并测量信号，如闪烁光、电化学发光、荧光检测。

10.根据权利要求1所述的基于小分子间接标记的双抗原夹心法测定丙型肝炎病毒总抗体的方法，其特征在于：步骤d)所述的样本指全血、血清、血浆、尿液、唾液。