CN101865917B - 三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及甲状腺疾病的辅助诊断试剂盒，公开了一种三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，包括：三碘甲腺原氨酸检测微粒、生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体和解离剂；其中三碘甲腺原氨酸检测微粒为二碘甲腺氨酸包被的发光微粒，解离剂为8-苯胺基-1-萘磺酸铵。本发明还公开了上述三碘甲腺原氨酸检测试剂盒的使用方法。本发明的试剂盒，可以与其它血清和临床信息联合用于甲状腺疾病的辅助诊断及相关病人治疗效果的监测。

Description

三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，具体涉及基于光激化学发光原理的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

甲状腺疾病是一组较常见的内分泌疾病，包括缺碘性甲状腺肿、其他原因引起的甲状腺肿、甲亢、甲状腺瘤、甲状腺炎、甲状腺功能减退等。甲状腺病的发生率比较高。

甲亢也就是甲状腺功能亢进症，它是一种临床上十分常见的内分泌疾病。是指由各种原因导致甲状腺功能增强，甲状腺激素分泌过多或因甲腺原氨酸（T3、T4）在血液中水平增高所导致的机体神经系统、循环系统、消化系统心血管系统等多系统的一系列高代谢症候群以及高兴奋症状和眼部症状。

甲状腺机能减退症系甲状腺激素TSH合成与分泌不足，或甲状腺激素生理效应不好、生物效应不足而致的全身性疾病。临床上可分为呆小病、幼年甲低、成人甲低。若功能减退始于胎儿或新生儿期，称为克汀病；始于性发育前儿童称幼年型甲减；始于成人称成年型甲减。

甲状腺瘤是临床常见病，其中绝大多数为良性病变，少数为癌，肉瘤、恶性淋巴瘤等。该病女性发病率明显高于男性，男女发病比例约1：2～3。

甲状腺炎是以炎症为主要表现的甲状腺疾病，包括感染性和非感染性。不少见。临床权威上所说的急性、亚急性及已经慢性甲状腺炎，只表明青年疾病过程的长短，它们之间无内在联系，也不互相转变，每种具有发表不同的病因、有着临床特点、病理过程及固有的结局。

三碘甲腺原氨酸（T3）是从甲状腺分泌出来的激素，与甲状腺素共同在甲状腺球蛋白分子中合成。血液中的T3绝大部分与甲状腺素结合球蛋白（thyroxine-binding globulin,TBG）结合，约0.4%的游离T3作用于靶细胞，维持正常的生理功能。测定血清中游离三碘原氨酸（T3）的水平可用于甲状腺疾病的辅助诊断及相关病人治疗效果的监测。

免疫学检测是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对被检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质，激素等微量生物活性物质。

我国免疫学检测基本经历了放射免疫检测（兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于县级以上医院）；酶联免疫检测（兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用）；以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术（20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长期）三个阶段。这一衍变过程主要是基于对检测方法的敏感性、准确性、以及操作简捷性的需求的不断提高而决定的。

化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay）是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术。检测原理是以发光物质作为信号放大系统并籍助其发光强度直接测定免疫结合。由于其高灵敏度，检测范围宽等优点，已成为放射性免疫分析与普通酶免疫分析的取代者，是免疫学检测重要的发展方向。

但目前国内自行研制的化学发光检测试剂，大多为非均相反应，采用化学底物直接标记，通过化学反应激发。其分析过程与传统酶标检测类似，需反复清洗与分离，检测耗时长，自动化程度不高。国外厂家检测试剂随发光基质与检测形式而各不相同。以Abbott，Bayer与Chiron等公司为代表的化学激发，即以化学发光底物直接标记抗原或抗体进行免疫测定。最常用的为吖啶酯，在碱性环境中可被过氧化氢氧化而发光。BD则以AKP,金钢脘为基质采用酶促化学发光。Roche为则采用电化学发光（electrochemiluminescence，ECL），发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧化的三丙胺失去一个H+而成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原为激发态的二价钌，随即释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子而常保持底物浓度的恒定。因反应过程中牵涉到分离清洗，自动化设计复杂，仪器相当昂贵。此外，发光基质的稳定性也是一大问题。

光激化学发光法通过引入激光技术与纳米微球技术，成功地解决了上述不足。因反应在均相中进行，既加快了反应速度，又避免了反复分离与清洗步骤，能有效降低检测背景值，减少反应时间，并可实现自动化操作。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于定量检测血清中三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒及其使用方法。

本发明的技术原理：

本发明的三碘甲腺原氨酸检测试剂及试剂盒与光激化学发光检测技术相关，光激化学发光免疫技术是一种利用化学发光物质发射的光波进行免疫测定的方法。该技术主要整合了高分子微粒技术，有机合成，蛋白质化学与临床检测相关领域的研究。

本发明之所以能检测血清中的三碘甲腺原氨酸的水平，首先是解离剂与样品中与甲状腺素结合球蛋白（thyroxine-binding globulin,TBG）结合的三碘甲腺原氨酸（T3）解离。常用的解离剂有8-苯胺-1-萘磺酸、柳硫汞、水杨酸钠、三氯醋酸钠等。本试剂使用8-苯胺基-1-萘磺酸铵（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，简称ANS）作为解离剂。然后在均相条件下，将内部带有染料的感光微粒(纳米级)以及包被有二碘甲腺氨酸（T2）并且内部带有发光化合物的发光微粒(纳米级)的混合物作为试剂和检测样品混合。

T2的分子式为C₁₅H₁₃I₂NO₄结构如图所示，

1分子T2可以和1分子T1（一碘酪氨酸）缩合形成T3，两分子T2可缩合形成T4。

T3分子式为C₁₅H₁₂I₃NO₄，结构如图所示：

T3与T2的结构非常相似，因此T2能够和识别T3的抗体发生微弱的结合。当血清中存在T3时，这一结合即被破坏，被T3和T3抗体的结合所取代。

此时纳米感光微粒和包被有表面抗体的纳米发光微粒可迅速有效地捕捉三碘甲腺原氨酸（T3），在近距离内，三者形成免疫夹心复合物。激发光照射后，纳米感光微粒中的染料被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子（单线态氧）。该高能态的活性氧离子被近距离的纳米发光微粒俘获，从而传递能量以激活所述发光微粒中的发光化合物。数微秒后，发光微粒中的发光化合物将释放出高能级红光。用光子计数器测定这些高能级光子，并通过电脑将光子数换算为目标分子浓度，光子数的多少即精确地反映了目标分子的浓度。而当样本不含三碘甲腺原氨酸（T3）时，无法在近距离形成免疫夹心复合物，活性氧离子也无法传递至发光微粒表面。活性氧离子在液相中迅速衰减，检测时则无高能级红光产生。具体原理参见图1及图2。

据文献记载，8-苯胺基-1-萘磺酸铵（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammoniumsalt）能够通过与蛋白疏水区域之间的强有力的结合作用，从而使蛋白构象变化，解离蛋白之间的相互作用。（Yoshimura,T.,Monitoring protein conformational changes during membranefusion.Method Enzymol.,221,72-82）

基于上述原理，本发明第一方面提供了一种用于检测三碘甲腺原氨酸（T3）的检测试剂盒，包括：三碘甲腺原氨酸检测微粒、生物素化抗体试剂（包括标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体）和解离剂；其中三碘甲腺原氨酸检测微粒为二碘甲腺氨酸包被的发光微粒，解离剂为8-苯胺基-1-萘磺酸铵、柳硫汞、水杨酸钠或者三氯醋酸钠。试剂盒中，还可包括亲和素包被的感光微粒。

在试剂盒中，上述三碘甲腺原氨酸检测微粒、生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体和亲和素包被的感光微粒分别独立包装，解离剂可以与生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体混合包装或独立包装，且二碘甲腺氨酸（T2）包被的发光微粒、生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体（T3Ab）和亲和素包被的感光微粒均为混悬液。上述含有二碘甲腺氨酸（T2）包被的发光微粒、生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体（T3Ab）或亲和素包被的感光微粒的溶液的溶剂可以是常规的适合抗原抗体反应的溶剂体系，如HEPES缓冲体系、Tris缓冲体系。二碘甲腺氨酸（T2）包被的发光微粒的溶剂优选pH8.0的成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液，生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体（T3Ab）的溶剂优选pH8.0的成分为Tris、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的Tris缓冲液，亲和素包被的感光微粒的溶剂优选HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液，上述各种溶剂中还可添加起封闭和蛋白保护作用的物质如BSA以及防止微粒聚集的稳定试剂如Tween20，出于对试剂防腐以及长期储存的考虑还可在溶剂中添加防腐剂，防腐剂优选100U/ml庆大霉素和质量百分比为万分之五的Proclin300作为防腐剂。

在用于定量检测三碘甲腺原氨酸（T3）时，上述试剂盒中还可包括含有多种已知三碘甲腺原氨酸浓度的溶液。上述不同三碘甲腺原氨酸浓度的溶液分别独立包装。

上述解离剂选自8-苯胺基-1-萘磺酸铵、柳硫汞、水杨酸钠或者三氯醋酸钠，优选为8-苯胺基-1-萘磺酸铵（ANS）。解离剂的缓冲液可以为Tris缓冲液、PBS缓冲液或者双蒸水，较佳为双蒸水。

上述发光微粒是指填充有发光化合物和镧系元素化合物的高分子微粒。发光化合物可以是Dioxene（二氧杂环己烯）或thioxene（二甲基噻吩）的衍生物等，镧系元素化合物可以是Eu（TTA）₃/TOPO或Eu（TTA）₃/Phen等，该微粒可由市场上购得。

研究发现，由于最终的检测反应是均相反应，发光微粒的粒径（微粒的平均直径）太大（＞400nm）会自然沉降，影响检测效果，微粒的粒径太小（＜100nm)，会使制备过程中的清洗工作比较困难,对抗体连接工作不利，因此发光微粒的粒径范围应在100-400nm之间，较好为150-300nm之间，优选250nm。

发光微粒的表面官能团可以是任何能联接蛋白质的基团，但最常用的主要有羧基和醛基表面官能团的微粒。使用不同的微粒表面官能团，连接抗体的反应方式和条件也不相同。

鉴于获得更好的二碘甲腺氨酸（T2）的连接效率，试剂稳定性和连接重复性，经试验优选醛基表面官能团的微粒，并应用了NaBH₃CN的还原胺化反应作为抗体的连接方法。

发光微粒的发光量会直接影响最终检测的发光效果。市场提供的发光微粒发光量一般会在150，000——350,000光子数/100μg发光微粒范围内，优选中等强度偏上的水平（≥250,000光子数/100ug）发光微粒。

上述二碘甲腺氨酸（T2）包被的发光微粒中，发光微粒与二碘甲腺氨酸（T2）的质量比例较佳为（8-15）：0.02，优选10：0.02。

上述生物素标记的抗体（T3Ab）中，生物素与抗体的分子比例较佳为（10-50）：1，优选30：1。

上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在670-690nm光激发下，可以产生单线态氧离子，当其与发光微粒距离足够近的情况下，单线氧离子传递到发光微粒，与发光微粒中的发光化合物反应，产生紫外光，紫外光再进一步激发镧系元素化合物，产生520-620nm波长光子。感光化合物可以是酞菁染料等，该微粒也可由市场上购得。

上述亲和素包被的感光微粒中，亲和素与感光微粒的质量比例无特殊限制，较佳为1：（3-10），优选1：5。

市售感光微粒均适用于本发明，微粒粒径较佳为180-260nm，优选220nm。

二碘甲腺氨酸（T2）包被的发光微粒采用NaBH₃CN的还原胺化反应法制备，反应步骤如下：

1）混合：将发光微粒与二碘甲腺氨酸混合于缓冲液中；

2）反应：加入缓冲液配制的NaBH₃CN溶液混合并反应；

3）封闭：加入缓冲液配制的Gly及NaBH₃CN溶液，混匀反应后，再加入BSA溶液封闭；

4）清洗产物，获得二碘甲腺氨酸包被的发光微粒。

其中，混合步骤中，发光微粒与二碘甲腺氨酸（T2）的质量比例为10：（0.1-0.4），优选10：0.2。反应缓冲液可为MES缓冲液、磷酸缓冲液，优选MES缓冲液，浓度优选0.05M，反应步骤中，反应溶液中发光微粒的浓度可为10-40mg/ml，优选20mg/ml。

改进的，二碘甲腺氨酸（T2）包被的发光微粒可采用下述方法制得：

1）混合：将发光微粒与二碘甲腺氨酸（T2）混合于缓冲液中。较佳的，缓冲液为MES缓冲液，发光微粒与二碘甲腺氨酸（T2）的质量比例为（8-15）：0.02，优选10：0.02。

2）反应：加入缓冲液配制的EDAC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐）溶液混合并反应。较佳的，缓冲液为MES缓冲液，混合溶液中，发光微粒与EDAC的质量比为25：1混合。反应条件为37℃旋转反应。一般约48小时反应充分。

3）往步骤2获得的反应液中加入缓冲液配制的BSA溶液混匀并反应。较佳的，缓冲液为MES缓冲液。BSA溶液与步骤2获得的反应液体积比较佳为5：8。反应条件为37℃旋转反应。一般约16小时反应充分。

4）清洗产物，获得二碘甲腺氨酸包被的发光微粒。

清洗的方式可以为离心法清洗或透析法清洗。

透析法清洗步骤：采用反应缓冲液透析，每次4-5小时，更换缓冲液4次。透析清洗操作时间较长，且微粒损失较多，造成收率降低。

离心法清洗步骤包括离心去上清，加入反应缓冲液洗涤，超声处理打开沉淀，如此反复3－5次。离心法清洗时离心力会使发光微粒暂时聚集在一起，但经过超声处理可以很容易再次分散打开，此法操作时间短，且收率较高。因此优选采用此种清洗方式。

上述改进的制备方法与NaBH₃CN的还原胺化反应法的主要差别在于主要反应试剂NaBH₃CN替换成了EDAC，该试剂的替换，不仅使得反应时间与NaBH₃CN的还原胺化反应法相比缩短了10个多小时，而且发光微粒与二碘甲腺氨酸的交联效率获得了提高，节省了二碘甲腺氨酸用量，此外，试验表明，该方法制得的检测微粒与NaBH₃CN的还原胺化反应法制得的检测微粒相比，在相同条件下反应信号更强，灵敏度更高，检测范围也更广。

亲和素包被的感光微粒可采用NaBH₃CN的还原胺化反应法制备。

本发明第二方面，公开了上述三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒的使用方法，三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒利用光激化学发光原理，采用双抗体夹心法，可定量检测血清中的三碘甲腺原氨酸。

三碘甲腺原氨酸（T3）的检测试剂盒的使用方法包括下列步骤：

将样品与试剂盒中用于检测三碘甲腺原氨酸的检测微粒、生物素标记的游离抗三碘甲腺原氨酸抗体（T3Ab）、解离剂和亲和素包被的感光微粒混合反应，然后用激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。

具体包括下列步骤：

1）在反应孔中加入样品、试剂盒中用于检测三碘甲腺原氨酸的检测微粒和生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体（T3Ab）、解离剂，获得初始反应溶液，混合反应；

2）再加入亲和素包被的感光微粒获得最终反应溶液进行反应；

3）激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光光子量获得光信号值。

上述激发光光源波长范围为600-700nm，优选640-680nm；反应孔发光的发射光光源波长范围为600-680nm，优选610-620nm；发射光延迟时间范围为100ms-1000ms；激发光光源的功率范围为5-100mw，优选40-60w。

上述三碘甲腺原氨酸（T3）的检测试剂盒在应用在定量检测三碘甲腺原氨酸（T3）时，需根据标准曲线计算待测样品中T3含量。

上述步骤1）的反应条件为37℃温育10-30分钟，优选20分钟，步骤2）的反应条件也为37℃温育10-30分钟，优选15分钟。

上述初始反应溶液中，二碘甲腺氨酸（T2）包被的发光微粒的浓度无特殊限制，可以为50-200μg/ml，优选150μg/ml。

初始反应溶液中，生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体的浓度无特殊限制，可以为0.05-0.2μg/ml，较佳为0.15μg/ml。

初始反应溶液中，解离剂8-苯胺基-1-萘磺酸铵的浓度范围为0.5-2mg/ml，优选2mg/mL。

在最终反应溶液中，亲和素包被的感光微粒的浓度一般控制在10-100μg/ml，可以为30-60μg/ml，优选40μg/ml。

上述方法中，初始反应溶液的体积无特殊限制，可以为30－75μl，优选75μl；最终反应溶液的体积也无特殊限制，可以为100－250μl，优选250μl。

上述样品包括血清、血浆、全血或标准品。

当本发明的检测试剂盒用于定量检测三碘甲腺原氨酸（T3）时，还需根据标准曲线计算待测样品中三碘甲腺原氨酸的含量。

本发明是采用光激化学发光检测技术，配合光激化学发光分析系统测定人血清样品中三碘甲腺原氨酸（T3）的定量体外诊断试剂盒，可以与其它血清和临床信息联合用于甲状腺疾病的辅助诊断及相关病人治疗效果的监测。本发明的三碘甲腺原氨酸（T3）光激化学发光检测试剂盒灵敏度高、精密性好、检测范围宽、而且操作简便、快速、成本低、稳定性好、无环境污染和放射危害，在临床上具有广泛的应用前景。

附图说明

图1：光激化学发光免疫技术原理图:微粒结合形成二聚体，产生光子信号

图2：光激化学发光免疫技术原理图:未结合微粒，无光子信号产生

图3：单线态氧随微粒间距离衰减，在大概600nm的距离，基本没有单线氧的存在，因此也不发光

FG BEAD：发光微粒，内含发光分子；

GG BEAD：感光微粒，内含感光分子；

Singlet Oxygen：单线态氧，活性氧离子；

A/B：两者可直接或间接特异结合的活性分子。如在双抗夹心检测中，A,B为针对靶分子C不同的表位的单克隆抗体

图4：比较试验测试结果示意图

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册（New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989）中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实验中仪器原料来源及试剂配方：

实施例1T2包被的发光微粒的制备

1）发光微粒混悬液处理：吸取一定量的羧基发光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声破碎至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节发光微粒浓度至100mg/ml。

2）二碘甲腺氨酸处理：T2于0.05M pH6.0的MES缓冲液（以下简称MES缓冲液）透析，透析完成后测定浓度，并调节浓度至2mg/ml。

3）MES缓冲液、100mg/ml的发光微粒混悬液（MES缓冲液）和2mg/ml的T2（MES缓冲液），以1:10：1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。

4）用MES缓冲液配制40mg/ml的EDAC溶液，按照与发光微粒100mg/100uL EDAC的比加入，迅速混匀，37℃旋转反应48小时。

5）加入200mg/ml的BSA溶液（MES缓冲液），其与反应液体积比为5：8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。

6）用MES缓冲液离心清洗四次，最后用发光试剂缓冲液进行悬浮，测定粒径和固含量，调节浓度至10mg/ml。

将上述方法与采用NaBH₃CN的还原胺化反应法制得的检测微粒进行比较。

NaBH₃CN还原胺化反应法的制备方法：

1）发光微粒混悬液处理：量取发光微粒悬浮液12.5mg，加MES缓冲液至约2.5g，离心半小时；重复2次后待用。

2）二碘甲腺氨酸处理及混合：精密称取T2，用NaOH配制成1mg/ml的溶液。按照10mg发光微粒：0.2mg T2加入T2溶液，补加0.05M MES缓冲液至发光微粒固含量为25mg/ml，振荡混匀得到反应液。

3）反应：NaBH3CN用MES缓冲液配制成25mg/ml的溶液。按照3：250的体积比将配制的NaBH3CN溶液立即加入到反应液中，37℃振荡反应68-70小时。

4）封闭：甘氨酸Gly用MES缓冲液配制成75mg/ml的甘氨酸溶液；NaBH3CN，用MES缓冲液配制成25mg/ml的溶液；将二溶液加入反应液中，其中反应液：Gly溶液：NaBH3CN溶液得体积比为10：2：1；37℃振荡反应2小时。

5）清洗：将离心管中反应液用MES缓冲液平衡约2.5g，离心半小时；向沉淀加入0.2mlMES缓冲液后超声15次；重复操作4次。

6）将清洗完毕的溶液吸出转移至干净容器中，取样测定固含量和粒径。用pH8.00发光试剂缓冲液调节浓度至10mg/ml。

两者制备结果的比较：

1.节省了制备时间：

	原有制备工艺	新制备工艺
			制备100mg交联T2的发光微粒	74h	64h

2.提高了T2交联效率，节省了T2用量：

	原有制备工艺	新制备工艺
			1mgT2交联微粒	50mg	500mg

3.增强了反应信号：

4.提高了灵敏度：

5.扩大了检测范围：

参照上述的制备方法制备T2包被的发光微粒，并通过各项性能测试比较从以下几方面进行了具体工艺条件的选择研究：

本实施例中涉及的各个参数的检测方法如下：

1.光信号检测方法：

在反应孔中分别加入25μl样品，再依次加入25μl发光试剂（150μg/ml）和25μl生物素化抗体试剂（0.15μg/ml）。然后放入仪器（光激化学发光分析系统），由仪器自动按以下步骤操作：振动，37℃温育20分钟，再自动加入175μl亲和素包被的感光微粒试剂（40μg/ml）后37℃温育15分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。

2.精密性检测方法：

检测T3浓度分别为1.08ng/ml和4.12ng/ml的质控品光信号，每个浓度做10孔重复测定，代入公式，计算CV值(Coefficient of Variance，离散系数，为标准差与均值的比率)。低浓度的精密性测定表示为QC L，高浓度的精密性测定表示为QC H。

3.灵敏度检测方法：

检测10孔T3浓度为0ng/ml的校准品光信号，计算其RLU均值（AVE）和二个标准偏差（SD），以AVE－2SD反代入标准曲线，得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度，不高于0.4ng/ml。

4.工艺条件选择：

1)防腐剂的考察

出于对试剂防腐以及长期储存的考虑，我们选择万分之五Proclin300作为防腐剂进行考察。

检测未添加防腐剂及添加万分之五Proclin300作为防腐剂的T3测定值≤0.4ng/ml的血清、正常人血清、T3测定值≥3ng/ml的血清、PBS缓冲液.每种条件检测两孔，取RLU（相对光单位）检测均值。结果见下表：

RLU均值	极低值血清	正常人血清	高值血清	PBS缓冲液
					未添加防腐剂	41242	37128	6021	35233
添加防腐剂	41440	38193	6035	36097

根据以上结果可以发现以万分之五Proclin300作为防腐剂对试验结果没有明显影响，故选用万分之五Proclin300作为防腐剂。

2)标准品稀释液的选择

为了得到长期稳定且较易获取的标准品稀释液来取代常规的不含T3的血清，使用20份T3测定值≤1pg/ml的临床血清作为参照来考察备选标准品稀释液，备选标准品稀释液分别有双蒸水、0.01M的pH7.4的PBS、添加1%BSA的0.01M pH7.4PBS、新生牛血清，20份T3测定值≤0.4ng/ml的临床血清每份测单孔，计算该20孔的RLU检测均值；备选标准品稀释液每种检测两孔，取RLU检测均值。检测结果如下：

	参照血清	双蒸水	PBS	1%BSA PBS	新生牛血清
						RLU（均值）	41440	38193	35265	42451	25148

根据以上结果可以发现添加1%BSA的0.01M pH7.4PBS的光信号水平与T3参照血清相当，因此选用添加1%BSA的0.01M pH7.4PBS作为标准品稀释液。

3)发光微粒与T2的反应比例

发光微粒:T2分别按10mg/0.01mg、10mg/0.02mg、10mg/0.05mg的比例包被，比较选取最佳的包被反应比例。

检测三种不同反应比例制备好的T2包被发光微粒，检测其灵敏度、精密性等。检测结果如下表：

发光微粒与T2反应比例的比较

T2加入量与发光微粒上包被的T2量基本呈正比关系，但T2继续增加时包被上的T2达到饱和。综合考虑QC结果及成本问题，选择10mg FG-bead与0.02mg T2反应条件。

4)发光试剂缓冲液

根据相应的文献资料，并结合本发明的特点，选择pH8.0的成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液，并在其中添加起封闭和蛋白保护作用的BSA以及防止微粒聚集稳定试剂的Tween20后作为发光试剂的缓冲液。

5)清洗方式的选择

透析法清洗步骤：100倍体积透析，每次4-5小时，更换缓冲液2次。透析清洗操作时间较长，且清洗不彻底。

离心法清洗步骤：12000rpm离心30分钟,清洗3次，沉淀以超声法重悬。这种方法清洗所用时间较短，效果好。综合考虑选用离心法清洗。

最终选择250nm的粒径，发光量为≥250,000光子数/100ug的发光微粒，1%BSA的0.01M pH7.4PBS作为稀释液，万分之五Proclin300作为防腐剂，20mg/ml的发光微粒反应浓度，10：0.02的FG-bead与T2的比例，离心法清洗作为最优制备条件。

实施例2生物素标记抗体的制备

制备方法：

1）抗体处理：用移液枪吸取一定量的抗-T3（标记），装入截流分子量14000D的透析袋中。置于100倍体积的0.1M NaHCO3溶液于层析冷柜2～8℃进行透析，更换0.1MNaHCO3溶液两次，每次透析4～5小时；将透析好的抗-T3（标记）吸出转移至干净离心管中，2～8℃，10000g，离心10min；转移上清至另一干净离心管，取样测定抗体浓度，并将其浓度调节至1mg/ml。

2）标记：取处理好的1mg/ml抗-T3（标记）与配制好的16.17mg/ml Biotin（DMSO）溶液，二者按照10000：54的体积比进行混合，迅速混匀。2～8℃静置反应12～16小时。

3）透析：将反应好的生物素标记抗体装入截流分子量14000D的透析袋中，置于大于100倍体积的生物素标记缓冲液于2～8℃进行透析。更换缓冲液2次，每次透析4～5小时。

4）将透析好的生物素化抗体吸出转移至干净离心管中，取样测定抗体浓度。用生物素标记缓冲液将生物素标记抗体浓度调节至0.1mg/ml。

本实施例中涉及的各个参数的检测方法如下：

1、将抗体与Biotin按照不同比例进行反应并进行检测：

将Biotin-X-X-NHS:抗体按照20:1、30:1、40:1的不同比例进行标记，比较选取最佳的标记比例。检测三种不同标记比例制备好的生物素标记抗T3，检测其灵敏度、精密性。检测结果如下表：

根据以上实验结果可知，生物素:抗T3标记比例为30:1时，其灵敏度较好，成本也较低。故选择30:1的比例作为生物素:抗T3的标记比例。

实施例3亲和素包被的感光微粒的制备

感光微粒：采用粒径为220±40nm的感光微粒（美国PentaTek公司）

制备方法：

a、感光微粒混悬液处理：吸取一定量的感光微粒于高速冷冻离心机中离心，弃去上清，加入一定量MES缓冲液，超声细胞破碎仪上超声至微粒重新悬浮，加入MES缓冲液调节感光微粒浓度至100mg/ml。

b、亲和素溶液配制：称量一定量Avidin，加MES缓冲液溶解至8mg/ml。

c、混合：将处理好的感光微粒混悬液、8mg/ml的Avidin以及MES缓冲液，以2：5：1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。

d、反应：MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH₃CN溶液，按照与反应液1：25的体积比加入，迅速混匀。37℃旋转反应48小时。

e、封闭：MES缓冲液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH₃CN溶液，按照与反应液2：1：10的体积比加入上述溶液中，混匀，37℃旋转反应2小时。再加入200mg/ml的BSA溶液（MES缓冲液），其与反应液体积比为5：8，迅速混匀，37℃旋转反应16小时。

f、清洗：向反应好的溶液中加入MES缓冲液，高速冷冻离心机离心，弃上清，加入新鲜MES缓冲液超声法重新悬浮，再次离心，如此清洗3次，最后用少量的感光试剂缓冲液进行悬浮，测定固含量，用感光试剂缓冲液调节浓度至10mg/ml。

实施例4标准品的制备

标准品：使用卫生部临检中心出品的三碘甲腺原氨酸定量参考品，以PBS为稀释液，按照浓度0ng/ml，0.4ng/ml，0.8ng/ml，1.5ng/ml，3ng/ml，6ng/ml配制6个标准品。

实施例5三碘甲腺原氨酸定量检测

向反应孔中分别加入样品，再依次加入发光试剂（T2包被的发光微粒）、解离剂和生物素标记抗体。然后放入仪器（光激化学发光分析系统），由仪器自动按以下步骤操作：振动，37℃温育。再自动加入亲和素包被的感光微粒后37℃再次温育。温育结束后仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量。

按上述方法检测各个标准品的发光光子量，将测得的光信号值与相应的标准品浓度采用cubic spline拟和作图即得，标准曲线呈线性。根据标准曲线，按样本实测光信号值计算每一个样本的T3含量，单位是ng/ml。最后打印试验报告。

检测条件的优化试验：

1、温育时间的确定:

试验材料：采用150μg/ml的发光试剂、0.15μg/ml的生物素标记抗体试剂（包含了2mg/ml的解离剂ANS）、亲和素包被的感光微粒试剂（40μg/ml）。

检验样本：灵敏度参考品和质控品QCL,QCH。

初始反应条件：加样量为样品25μl，发光微粒试剂25μl，生物素标记抗体试剂25μl，亲和素包被的感光微粒试剂为175μl，两步温浴。

1.1第一步温育时间的确定

第一步温育时间分别为10min、15min、20min、30min，第二步温育时间为20min对检验样本进行检测，分别考察灵敏度、准确性、精密度等指标。结果见下表：

对上述结果进行分析比较，在其余条件相同的情况下，第一步温育时间为20min结果已经趋于稳定，延长第一步温育时间已经没有实际意义，所以我们将第一步温育时间确定为为20min。

1.2第二步温育时间的确定

第一步温育时间为20min，第二步温育时间分别为10min、15min、20min、30min对检验样本进行检测，分别考察灵敏度、特异性、准确性、精密度等指标。结果见下表：

对上述结果进行分析比较，在其余条件相同的情况下，第二步温育时间为15min结果已经趋于稳定，延长第二步温育时间已经没有实际意义，所以我们将第二步温育时间确定为为15min。

2、加样模式的考察

试验材料：采用T2包被的150μg/ml的发光微粒试剂（下简称发光试剂）和0.15μg/ml的生物素标记抗体试剂，及40μg/ml的亲和素包被的感光微粒试剂。

检验样本：灵敏度参考品和质控品QcL,QcH。

初始反应条件：依次添加样品、发光微粒试剂、生物素标记抗体试剂、亲和素包被的感光微粒，两步温浴，其中第一温浴时间为20min，第二温浴时间为15min。

设计了三种加样模式进行考察。

模式1：10μl样品+10μl发光试剂+10μl生物素化抗体试剂+70μl亲和素包被的感光微粒试剂；

模式2：15μl样品+15μl发光试剂+15μl生物素化抗体试剂+105μl亲和素包被的感光微粒试剂；

模式3：25μl样品+25μl发光试剂+25μl生物素化抗体试剂+175μl亲和素包被的感光微粒试剂。

对上述结果进行分析比较，在其余条件相同的情况下，并考虑到手工加样样品量过小会造成不便于操作的影响以及更容易产生误差，因此选择模式3为加样模式。

3、发光试剂和生物素化抗体浓度的筛选

试验材料：采用T2包被的发光微粒试剂（下简称发光试剂）和生物素标记抗体试剂，及亲和素包被的感光微粒试剂

检验样本：灵敏度参考品和质控品QcL,QcH。

初始反应条件：依次添加25μl样品、25μl发光微粒试剂、25μl生物素标记抗体试剂、175μl亲和素包被的感光微粒，两步温浴，其中第一温浴时间为20min，第二温浴时间为15min。

根据相应的文献资料，并结合本方法的特点分别配制浓度为50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml的发光试剂以及浓度为0.05ug/ml、0.1ug/ml、0.15ug/ml、0.2ug/ml的生物素化抗体交叉配对进行检测，结果分别如下：

50ug/ml发光试剂

100ug/ml发光试剂

150ug/ml发光试剂

200ug/ml发光试剂

对上述结果进行分析比较，结合RLU值、灵敏度等指标发现发光试剂的浓度150ug/ml，生物素化抗体的浓度0.15ug/ml结果最为理想。

4、亲和素包被的感光微粒的浓度的筛选：

发光试剂浓度选用150μg/ml，生物素化抗体的浓度选用0.15μg/ml，亲和素包被的感光微粒浓度分别配制为30μg/ml,40μg/ml,60μg/ml，在初始反应条件下，结果如下：

根据灵敏度比较，Qc L和Qc H的测定浓度，亲和素包被的感光微粒浓度在40μg/ml时结果最为理想。

5、解离剂(ANS)的考察研究：

1）解离剂（ANS）添加方式的考察

选择ANS作为解离剂，工作浓度定为1mg/ml。

配制发光试剂与生物素化抗体，将两种试剂均分为添加解离剂及未添加解离剂两组，置于37℃7天，添加解离剂组备用，未添加解离剂组再次分为添加解离剂及未添加解离剂两组，将以上试剂组合为以下四种模式：

模式1：发光试剂（37℃7天前添加）+生物素化抗体（未添加）；

模式2：发光试剂（37℃7天后添加）+生物素化抗体（未添加）；

模式3：发光试剂（未添加）+生物素化抗体（37℃7天前添加）；

模式4：发光试剂（未添加）+生物素化抗体（37℃7天后添加）。

使用以上四种加样模式对标准品进行检测，结果见下表：

RLU	标准品1	标准品2	标准品3	标准品4	标准品5	标准品6
							模式1	52498	38258	26522	14241	5899	3125
模式2	75474	42574	29585	15878	5988	2878
							模式3	72454	42548	28853	16524	6211	3001
模式4	73898	41589	30012	15789	6087	2947

由以上结果可以发现将解离剂加入到生物素化抗体试剂中不会对试剂稳定性造成影响。

2）解离剂浓度的选择：

选择0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml三种添加浓度对样品进行检测，分别考察灵敏度、精密度等指标。结果见下表：

根据以上实验结果可知，解离剂ANS工作浓度为2mg/ml时，其灵敏度、线性更佳。

实施例6评价试验

试剂：采用150μg/ml的发光试剂、0.15μg/ml的生物素标记抗体试剂（包含了2mg/ml的解离剂ANS）、亲和素包被的感光微粒试剂（40μg/ml）。

检测方法如下：

首先在反应孔中分别加入25μl样品，再依次加入25μl发光试剂和25μl生物素化抗体试剂（其中包含了2mg/ml的解离剂ANS）。然后放入仪器，由仪器自动按以下步骤操作：振动，37℃温育20分钟，再自动加入亲和素包被的感光微粒试剂175μl后37℃温育15分钟。仪器自动产生激光照射微孔计算每孔发光光子量，根据标准曲线可以推算样品T3浓度，单位是ng/ml，最后打印试验报告。检测具体步骤如下：

1、检测范围

本试剂盒线性检测范围为0.4-6ng/ml，对其用双对数模型拟合，剂量-反应曲线相关系数（r）的绝对值不低于0.9900。如要准确的测定样品中T3浓度值，样品中T3浓度值应不超出0.4-6ng/ml标准品曲线的浓度范围，超出此范围的测定结果是通过标准品曲线外延得出的计算结果。经本试剂盒对大量的临床样本的检验结果可知道，大部分样本结果小于6ng/ml,因此，本试剂盒设定的检测范围为0.4-6ng/ml可满足临床应用要求。

2、灵敏度的检测

检测10孔校准品0ng/ml，计算其RLU均值（AVE）和二个标准偏差（SD），以AVE－2SD反代入标准曲线，得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度，经检测两个批号的试剂，其分析灵敏度分别为0.22ng/ml、0.23ng/ml，均不高于0.4ng/ml。

3、精密性检测

分别采用2个批号的T3试剂盒对质控品QC L、QC H进行1次检测，每次复测10孔，每份样品共检测20次。得到如下结果：

由上述结果可知，批内精密性、批间精密性小于10%。

4、线性的检测

对除0值外其他5点标准品用双对数或其他数学模型拟合，剂量-反应曲线相关系数（r）的绝对值应不低于0.9900。经检测两个批号的试剂盒，其线性r值分别为0.9952、0.9944。

5、干扰性试验

在已知浓度的临床标本1#、2#、3#中加入250mg/dL血红蛋白、500mg/dL甘油三酯、10mg/dL胆红素，以本试剂盒进行检测，结果如下表：

试剂盒1     (单位：ng/ml)

试剂盒2     (单位：ng/ml)

由上述结果可知，500mg/dL甘油三酯和10mg/dL胆红素对本产品无明显干拢，但250mg/dL血红蛋白对本产品检测结果有影响，因此尽量避免样本严重溶血。

实施例7比较试验

试剂：采用发光试剂（150μg/ml）、生物素标记抗体试剂（包含解离剂ANS：2mg/ml）（0.15μg/ml）及亲和素包被的感光微粒试剂（40μg/ml）。

以西门子公司T3试剂盒为参照进行了质量水平比较，所用样本为实施例6中的灵敏度参考品，结果如图4所示。

由图4所示的结果可知，本试剂盒检测结果与西门子结果相关性r=0.9608，且该试剂盒成本底、灵敏度高、精密性好、检测范围宽、操作简便、省时，适合于向临床推广。

实施例8试剂盒的组配

将实施例1-3中按照各种方法制备的的三种试剂以及解离剂ANS分别独立包装，组配后获得基本试剂盒。可用于定量检测样品中T3的浓度。

Claims (24)

1.一种三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，包括：三碘甲腺原氨酸检测微粒、生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体和解离剂；其中三碘甲腺原氨酸检测微粒为二碘甲腺氨酸包被的发光微粒，解离剂为8-苯胺基-1-萘磺酸铵溶液、柳硫汞溶液、水杨酸钠溶液或者三氯醋酸钠溶液；所述三碘甲腺原氨酸检测微粒中，发光微粒的表面官能团选自羧基或醛基；所述三碘甲腺原氨酸检测微粒由如下方法制得：

1)混合：将发光微粒与二碘甲腺氨酸混合于缓冲液中；

2)反应：加入缓冲液配制的EDAC溶液混合并反应；

3)往步骤2)获得的反应液中加入缓冲液配制的BSA溶液混匀并反应；

4)清洗产物，获得二碘甲腺氨酸包被的发光微粒。

2.如权利要求1所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述三碘甲腺原氨酸检测微粒中，发光微粒的粒径范围为100-400nm。

3.如权利要求2所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述发光微粒的粒径范围为150-300nm。

4.如权利要求1所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述三碘甲腺原氨酸检测微粒中，发光微粒的发光量为150,000-350,000光子数/100μg发光微粒。

5.如权利要求1权利要求所述三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述三碘甲腺原氨酸检测微粒中，发光微粒与二碘甲腺氨酸的质量比例为(8-15)∶0.02。

6.如权利要求5所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述发光微粒与二碘甲腺氨酸的质量比例为10∶0.02。

7.如权利要求1所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为MES缓冲液或磷酸缓冲液。

8.如权利要求1所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述步骤a的混合液中，发光微粒的浓度为10-40mg/ml。

9.如权利要求1所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述步骤d的清洗的方式为离心法清洗。

10.如权利要求1所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体中，生物素与抗三碘甲腺原氨酸抗体的分子比例为(10-50)∶1。

11.如权利要求10所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体中，生物素与抗三碘甲腺原氨酸抗体的分子比例为30∶1。

12.如权利要求1所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述解离剂为8-苯胺基-1-萘磺酸铵的水溶液。

13.如权利要求12所述的的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述8-苯胺基-1-萘磺酸铵的水溶液中，8-苯胺基-1-萘磺酸铵的质量体积浓度为0.5-2mg/ml。

14.如权利要求1-13中任一权利要求所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还包括亲和素包被的感光微粒。

15.如权利要求14所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述亲和素包被的感光微粒中，亲和素与感光微粒的质量比例为1∶(3-10)。

16.如权利要求15所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述亲和素包被的感光微粒中，亲和素与感光微粒的质量比例为1∶5。

17.如权利要求14所述三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述三碘甲腺原氨酸检测微粒、生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体和亲和素包被的感光微粒分别独立包装；解离剂与生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体混合包装或独立包装；二碘甲腺氨酸包被的发光微粒、生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体和亲和素包被的感光微粒均为混悬液。

18.如权利要求17所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述混悬液的溶剂选自HEPES缓冲体系或Tris缓冲体系。

19.如权利要求18所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，三碘甲腺原氨酸检测微粒混悬液的溶剂为pH8.0的成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液。

20.如权利要求18所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，生物素标记的抗三碘甲腺原氨酸抗体混悬液的溶剂为pH8.0的成分为Tris、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的Tris缓冲液。

21.如权利要求18所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，亲和素包被的感光微粒混悬液的溶剂为成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液。

22.如权利要求17所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述混悬液中还包括蛋白保护剂、防止微粒聚集的稳定试剂或防腐剂中的一种或多种。

23.如权利要求22所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述蛋白保护剂为BSA，防止微粒聚集的稳定试剂为Tween20，防腐剂为庆大霉素和Proclin 300。

24.如权利要求17所述的三碘甲腺原氨酸的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括多种浓度已知的三碘甲腺原氨酸溶液，不同浓度的三碘甲腺原氨酸溶液分别独立包装。

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