CN114878840A - 磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，且公开了磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒，包括链霉亲和素包被的磁微粒试剂、生物素包被的三碘甲状腺原氨酸抗体、碱性磷酸酶标记的3,5‑二碘‑L酪氨酸、三碘甲状腺原氨酸校准品、三碘甲状腺原氨酸质控品、全反式维甲酸，所述链霉亲和素包被的磁微粒试剂的浓度为0.3～1.0mg/ml，磁微粒包被试剂缓冲液为含20mM～100 mM的Tris碱，0.01%～0.1%的Tween20。本发明可以降低甲状腺球蛋白中含有结合的三碘甲状腺原氨酸对检测产生的影响，并且T3类似物（3,5‑二碘‑L酪氨酸）与碱性磷酸酶的直接标记，不需要制备TT3抗原或TT3抗原衍生物，制备工艺更简单，成本更低，准确度高，稳定性好，能够有效的避免交叉反应。

Description

磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体为磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒及检测方法。

背景技术

甲状腺激素由甲状腺滤泡的上皮细胞分泌，包括甲状腺素（thyroxine, T4）和三碘甲状腺原氨酸（3,5,3'-triiodthyronine,T3）两种激素，两者均属于酪氨酸的碘化物。主要是调节机体的物质代谢和能量代谢、生长发育，特别是对中枢系统的发育和功能有着尤为重要的影响。T3有两种存在形式，即总T3（total thyroxine，TT3）和游离T3（freethyroxine,FT3）。只有约0.4%的T3是游离的，但游离T3（FT3）才真正具备激素的生物活性。体内TT3的浓度受甲状腺激素结合蛋白的浓度的影响，而FT3不受影响，TT3和FT3保持动态平衡，维持正常的甲状腺功能，所以TT3的定量检测对早期的甲状腺疾病诊断非常有价值。

目前市场上测定TT3的主要方法有酶联免疫吸附分析法、磁微粒化学发光分析法等，其中酶联免疫吸附分析法存在检测灵敏度低，线性范围窄以及自动化程度低等特点正逐步被有着高灵敏度、宽线性范围、自动化程度高的磁微粒化学发光分析法所取代。TT3属于小分子项目，尤其在抗原标记、准确度、交叉反应物等方面技术难度较大，其次现有试剂盒检测过程中，由于甲状腺球蛋白中含有结合的三碘甲状腺原氨酸，容易对检测结果产生影响。因此，发明一款既能够解决标记过程繁琐，又能提高试剂准确度的试剂盒是关键。

发明内容

（一）解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒及检测方法，可以降低甲状腺球蛋白中含有结合的三碘甲状腺原氨酸对检测产生的影响，并且实现了3,5-二碘-L酪氨酸与碱性磷酸酶的直接标记，不需要使用TT3或TT3抗原衍生物进行标记，制备工艺更简单，成本更低，准确度高，稳定性好，能有效的避免交叉反应。

（二）技术方案

为实现上述制备工艺更简单，成本更低，准确度高，稳定性好，本发明提供如下技术方案：磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒，包括链霉亲和素包被的磁微粒试剂、生物素包被的三碘甲状腺原氨酸抗体、碱性磷酸酶标记的3,5-二碘-L酪氨酸、三碘甲状腺原氨酸校准品、三碘甲状腺原氨酸质控品、全反式维甲酸以及γ-干扰素试剂。

优选的，所述链霉亲和素包被的磁微粒试剂的浓度为0.3～1.0mg/ml，磁微粒包被试剂缓冲液为含20mM～100 mM的Tris碱，0.01%～0.1%的Tween20，pH值为6.0～8.0。

优选的，所述生物素包被的三碘甲状腺原氨酸抗体为suflo-NHS-Lc-生物素和小鼠单克隆抗体的标记物，使用时用工作液进行1:100～1:2000倍稀释，所述工作液包含20mM～100mM的吗啉乙磺酸，0.3%～5%的重组人血清白蛋白。

优选的，所述碱性磷酸酶标记的3,5-二碘-L酪氨酸为碱性磷酸酶和3,5-二碘-L酪氨酸的标记物，使用时用工作缓冲液进行1:5000～1:15000倍稀释，所述工作缓冲液包含20mM～100mM的吗啉乙磺酸，0.3%～5%的重组人血清白蛋白，pH6.0～8.0。

优选的，所述工作缓冲液中含有5～50mg的ANS蛋白解离剂。

优选的，所述全反式维甲酸的浓度为0.2～0.4mg/ml，γ-干扰素的浓度为0.1～0.2mg/ml。

优选的，所述三碘甲状腺原氨酸校准品为包含5%～20%的去激素人血清，20mM～100 mM的磷酸盐缓冲液，pH7.4

优选的，所述碱性磷酸酶标记的3,5-二碘-L酪氨酸通过如下工艺制备：

S1、取3,5-二碘-L酪氨酸溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，加入(二（磺基琥珀酰亚胺）辛二酸酯)（BS3）,25℃条件下，反应30min；

S2、步骤S1反应结束后加入碱性磷酸酶，混匀，4℃反应16h，加入1mol/L的甘氨酸溶液室温静置10～30min，用PD-10层析柱纯化，即得碱性磷酸酶标记的3,5-二碘-L酪氨酸。

磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸检测方法，包括以下步骤：

S1、取样本30ul加入20ul的全反式维甲酸，混匀后，温育15min；

S2、向步骤S1中的混合液加入生物素包被的T3抗体工作液50ul、链霉亲和素包被的磁微粒工作液30ul到反应管中，混匀，37℃温育10min；

S3、取碱性磷酸酶标记的3,5-二碘-L酪氨酸工作液50ul，加入步骤S2的混合液中，混匀，37℃温育10min；

S4、清洗液清洗3次，每次300ul；

S5、加入140ul底物，混匀后测试。

（三）有益效果

与现有技术相比，本发明提供了磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒及检测方法，具备以下有益效果：

该磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒及检测方法，可以降低甲状腺球蛋白中含有结合的三碘甲状腺原氨酸对检测产生的影响，不需要使用TT3或TT3抗原衍生物进行标记，制备工艺更简单，成本更低，准确度高，稳定性好，能有效的避免交叉反应。

附图说明

图1为本发明最低检出限评价示意图；

图2为本发明相关性评价示意图；

图3为本发明37℃稳定性评价示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-3，本发明提供一种技术方案：磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒，包括浓度为0.3～1.0mg/ml的链霉亲和素包被的磁微粒试剂、含20mM～100 mM的Tris碱，0.01%～0.1%的Tween20，pH值为6.0～8.0的磁微粒包被试剂缓冲液，suflo-NHS-Lc-生物素和小鼠单克隆抗体的标记物的生物素包被的三碘甲状腺原氨酸抗体，使用时用工作液进行1:100～1:2000倍稀释，工作液包含20mM～100mM的吗啉乙磺酸，0.3%～5%的重组人血清白蛋白，碱性磷酸酶标记的3,5-二碘-L酪氨酸，碱性磷酸酶标记的3,5-二碘-L酪氨酸为碱性磷酸酶和3,5-二碘-L酪氨酸的标记物，使用时用工作缓冲液进行1:5000～1:15000倍稀释，工作缓冲液包含20mM～100mM的吗啉乙磺酸，工作缓冲液中含有5～50mg的ANS蛋白解离剂，0.3%～5%的重组人血清白蛋白，pH6.0～8.0，三碘甲状腺原氨酸校准品，三碘甲状腺原氨酸校准品为包含5%～20%的去激素人血清，20mM～100 mM的磷酸盐缓冲液，pH7.4，三碘甲状腺原氨酸质控品，全反式维甲酸以及γ-干扰素，全反式维甲酸的浓度为0.2～0.4mg/ml，γ-干扰素试剂的浓度为0.1～0.2mg/ml。

碱性磷酸酶标记的3,5-二碘-L酪氨酸通过如下工艺制备：

S1、取3,5-二碘-L酪氨酸溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，加入(二（磺基琥珀酰亚胺）辛二酸酯)（BS3）,25℃条件下，反应30min；

S2、步骤S1反应结束后加入碱性磷酸酶，混匀，4℃反应16h，加入1mol/L的甘氨酸溶液室温静置10～30min，用PD-10层析柱纯化，即得碱性磷酸酶标记的3,5-二碘-L酪氨酸溶液。

工作液的制备：

1.磁珠工作缓冲液

2. 生物素包被三碘甲状腺原氨酸抗体工作缓冲液

3.碱性磷酸酶标记的三碘甲状腺原氨酸抗原工作缓冲液

4.校准品工作缓冲液

5、生物素包被的三碘甲状腺原氨酸抗体

1）配制0.1mol/L的NaHCO3；

2)用PD-10层析柱对T3抗体进行纯化，纯化缓冲液为0.1mol/L的NaHCO3

3）称取suflo-NHS-Lc-生物素并用DMSO进行溶解；

4）将纯化后的T3抗体和suflo-NHS-Lc-生物素按照18：1的量进行混合，室温反应4h。即得生物素包被的三碘甲状腺原氨酸抗体标记物；

5）用PD-10层析柱和0.1mol/L的NaHCO3缓冲液对生物素包被的三碘甲状腺原氨酸抗体标记物进行纯化；

6）将纯化后的生物素包被的三碘甲状腺原氨酸抗体标记物用工作缓冲液按照1:1000倍进行稀释，得到工作液。

6、碱性磷酸酶标记3,5-二碘-L酪氨酸

1）取3,5-二碘-L酪氨酸溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，1:1加入(二（磺基琥珀酰亚胺）辛二酸酯)（BS3）,25℃条件下，反应30min。

2）步骤1反应结束后15:1加入碱性磷酸酶，混匀，4℃反应16h。

3）加入1mol/L的甘氨酸溶液室温静置10～30min，用PD-10层析柱纯化。

4）将纯化后的碱性磷酸酶标记3,5-二碘-L酪氨酸用工作缓冲液按照1:6000倍进行稀释，得到工作液；

7、磁珠工作液的制备

将链霉亲和素磁珠（100mg/mL）用磁珠缓冲液稀释至0.5mg/mL；

8、校准品的制备

将三碘甲状腺原氨酸抗原用校准品工作缓冲液依次稀释为0.5ng/ml、1 ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8 ng/ml；

9、质控品的制备

将三碘甲状腺原氨酸抗原用校准品工作缓冲液依次稀释为0.5ng/ml、2ng/ml。

磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸检测方法，包括以下步骤：

S1、取样本30ul加入20ul的全反式维甲酸，混匀后温育15min；

S2、向步骤S1中的混合液加入生物素包被的T3抗体工作液50ul、链霉亲和素包被的磁微粒工作液30ul到反应管中，混匀，37℃温育10min；

S3、取碱性磷酸酶标记的T3类似物工作液50ul，加入步骤S2的混合液中，混匀，37℃温育10min；

S4、清洗液清洗3次，每次300ul；

S5、加入140ul底物，混匀后测试。

甲状腺球蛋白是甲状腺滤泡上皮分泌的660 ku糖蛋白，每个Tg约有2个甲状腺素（T4）和0.5个三碘甲腺原氨酸（T3）分子，而本检测方法主要对样本中游离的三碘甲腺原氨酸进行检测，而甲状腺球蛋白在分解过程中，产生的三碘甲腺原氨酸会增加游离三碘甲腺原氨酸的含量，使得检测出的数值偏高，因此，通过全反式维甲酸中的维甲酸抑制样本中甲状腺蛋白的活性，防止甲状腺蛋白发生分解产生三碘甲状腺原氨酸，并通过添加的γ-干扰素试剂中的γ-干扰素使甲状腺蛋白变性失活，从而降低甲状腺球蛋白分解产生的三碘甲腺原氨酸对检测结果的影响。

用TT3零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU 值（相对发光值），计算其平均值（

）和标准差（SD），得出

-2SD所对应的RLU值，根据试剂盒 所用校准品的定标曲线方程将

-2SD所对应的RLU值带入剂量-反应曲线，计算出为最低检 出限为0.11ng/ml；

将国家标准品配制成与试剂盒内校准品相应的浓度点，每个浓度点测量2次，用国家标准品做曲线拟合校准品各点的浓度，用校准品的实测浓度（X1）和标识浓度（X2）做效价比，用国家标准品曲线和校准品曲线按公式（1）做T检验，T=0.06。

式中：

用试剂盒和罗氏TT3检测试剂盒同时测28例临床样本，相关方程为：y = 0.9518x+ 0.1191，相关系数为R2=0.9479,统计学表面本试剂盒与国外其它厂家相比，相关性良好（其结果为附图1）。

将试剂盒分别在37℃条件下加速0、1、3、5、7天，降幅小于5%，由附图2可以看出：本发明的试剂盒与国外试剂盒相比，性能指标接近，本发明的磁微粒化学发光法测定总三碘甲状腺原氨酸（TT3）试剂盒及其检测方法在临床上具有很好的适用性。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒，其特征在于，包括链霉亲和素包被的磁微粒试剂、生物素包被的三碘甲状腺原氨酸抗体、碱性磷酸酶标记的3,5-二碘-L酪氨酸、三碘甲状腺原氨酸校准品、三碘甲状腺原氨酸质控品、全反式维甲酸。

2.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素包被的磁微粒试剂的浓度为0.3～1.0mg/ml，磁微粒包被试剂缓冲液为含20mM～100 mM的Tris碱，0.01%～0.1%的Tween20，pH值为6.0～8.0。

3.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒，其特征在于，所述生物素包被的三碘甲状腺原氨酸抗体为suflo-NHS-Lc-生物素和小鼠单克隆抗体的标记物，标记时使用DMF有机溶剂将生物素溶解为5～10mg/ml，取溶解后的生物素30ul加入0.5mg的三碘甲状腺原氨酸抗体，室温反应2h，用标记缓冲液1在PD-10层析柱上进行纯化，即得T3抗体-生物素标记物，使用时用工作液进行1:100～1:2000倍稀释，所述工作液包含20mM～100mM的吗啉乙磺酸，0.3%～5%的重组人血清白蛋白；

所述标记缓冲液1由1.2～3.0g/L的磷酸氢二钠、0.15～0.3g/L磷酸二氢钠、150～300mM/L的氯化钠、0.2～1g/L的氯化钾组成，Ph7.0～9.5。

4.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的3,5-二碘-L酪氨酸为碱性磷酸酶和3,5-二碘-L酪氨酸的标记物，使用时用工作缓冲液进行1:5000～1:15000倍稀释，所述工作缓冲液包含20mM～100mM的吗啉乙磺酸，0.3%～5%的重组人血清白蛋白，pH6.0～8.0。

5.根据权利要求4所述的磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒，其特征在于，所述工作缓冲液中含有5～50mg的蛋白解离剂，所述蛋白解离剂选自ANS-镁、水杨酸钠中的一种或两种。

6.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒，其特征在于，所述全反式维甲酸的浓度为0.2～0.4mg/ml，包含浓度为0.1～0.2mg/ml的γ-干扰素。

7.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒，其特征在于，所述三碘甲状腺原氨酸校准品为包含5%～20%的去激素人血清，20mM～100 mM的磷酸盐缓冲液，pH7.4。

8.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的3,5-二碘-L酪氨酸通过如下工艺制备：

S1、取3,5-二碘-L酪氨酸溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，加入(二（磺基琥珀酰亚胺）辛二酸酯)（BS3）,25℃条件下，反应30min；

S2、步骤S1反应结束后加入碱性磷酸酶和标记缓冲液2，混匀，4℃反应16h，加入1mol/L的甘氨酸溶液室温静置10～30min，用标记缓冲液3在PD-10层析柱纯化，即得碱性磷酸酶标记的3,5-二碘-L酪氨酸溶液。

9.根据权利要求8所述的磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸试剂盒，其特征在于，S2中所述标记缓冲液2为0.1M的碳酸氢钠缓冲液，pH 8.5～9.5，标记缓冲液3包括12～25ml/L的三乙醇胺、5～17g/L的氯化钠、1M/L氯化镁、0.1M/L氯化锌pH 6.5～8.5。

10.根据权利要求1所述的磁微粒化学发光测定三碘甲状腺原氨酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取样本30ul加入20ul的全反式维甲酸，混匀后，温育15min；

S2、向步骤S1中的混合液加入生物素包被的T3抗体工作液50ul、链霉亲和素包被的磁微粒工作液30ul到反应管中，混匀，37℃温育10min；

S3、取碱性磷酸酶标记的3,5-二碘-L酪氨酸工作液50ul，加入步骤S2的混合液中，混匀，37℃温育10min；

S4、清洗液清洗3次，每次300ul；

S5、加入140ul底物，混匀后测试。

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