CN114316016B - 一种Jo-1抗原生物素化的方法及抗Jo-1抗体检测试剂盒 - Google Patents
一种Jo-1抗原生物素化的方法及抗Jo-1抗体检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种Jo‑1抗原生物素化的方法及抗Jo‑1抗体检测试剂盒。为了解决现有技术中由于Jo‑1抗原生物素化效率低而导致的抗Jo‑1抗体检测试剂盒临床符合率较低的问题，本发明将Jo‑1抗原的巯基转化成氨基得到处理后的Jo‑1抗原，然后将所述的处理后的Jo‑1抗原与生物素偶联得到生物素标记的Jo‑1抗原。本发明首次提出将Jo‑1抗原的巯基转化成氨基的工艺，以此增加Jo‑1抗原表面氨基的数量，在Jo‑1抗原生物素化时，提高Jo‑1抗原与生物素反应的概率，增加生物素化效率，此方法原料易得，方法简单，成本低。
Description
技术领域
本发明属于抗体检测领域，具体涉及一种Jo-1抗原生物素化的方法及抗Jo-1抗体检测试剂盒。
背景技术
抗Jo-1抗体常见于多发性肌炎(Polymyositis；PM)，阳性检出率可达40％～50％；在PM于DM(皮肌炎)重叠的患者中，抗Jo-1抗体的阳性检出率为25％；在单独DM患者中，抗Jo-1抗体的检出率不足10％；在其他自身免疫性疾病中，抗Jo-1抗体为阴性，因而抗Jo-1抗体对诊断PM具有特异性。此外，在PM与硬皮病重叠的患者中，抗Jo-1抗体的阳性率检出率可高达85％；在进行性系统性硬化(PSS)与PM重叠的患者中，抗Jo-1抗体的阳性率检出率约为25％，在PM伴肺间质纤维化患者中，抗Jo-1抗体阳性率可达60％。
目前对于抗Jo-1抗体的检测方法已有报道，对于此病的检测方法主要为间接免疫荧光法和酶联免疫吸附法，但这些方法都存在着不足之处。间接免疫荧光法在分析结果时无法根据分子量的大小区分非特异性反应；操作相对复杂，需要价格较昂贵的荧光显微镜，在很多基层医院难以推广，同时，不适用于样本量较大的实验室和诊断医院；荧光测定中的本底较高，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难；结果判定需要有经验的专业人员，分析结果的客观性不足。酶联免疫吸附法检测范围和灵敏度都比较低；检测时间较长，完成一个测试一般需要2个小时以上，不能完全满足临床上的快速诊断的需求；不能随机进样检测，检测结果存在滞后性；仪器检测多数只能定性判断样本中被测抗体，检测结果不能监视病情。
为了解决上述问题，在之前的研究中，我们开发了一种测定抗Jo-1抗体的磁微粒化学发光检测试剂盒(CN109085343A)，通过在抗原中加入一定量的tRNA和RNA酶抑制剂，通过tRNA以及tRNA与Jo-1抗原结合形成的复合物，增加Jo-1抗体的检测灵敏度，相比之前的试剂盒，具有稳定性好、灵敏度高、重复性好等优点。但是，tRNA和RNA酶抑制剂成本较高且保存条件要求高，而专利CN109085343A和目前其他试剂盒中抗原生物化的过程，都是将已活化的生物素与抗原蛋白上的氨基反应，将生物素和蛋白质连接在一起，随着研究的深入，我们发现在Jo-1抗原的生物化过程中，直接对Jo-1抗原生物素化，效率较低，不能达到一个理想的水平，从而导致试剂盒的临床符合率还不够理想。因此，需要开发一种能够提高Jo-1抗原生物素化的方法，在不使用tRNA和RNA酶抑制剂时，也能提高试剂盒的临床符合率。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的Jo-1抗原生物素化方法。
本发明的另一目的是提供一种不使用tRNA和RNA酶抑制剂也能够具有高的临床符合率的抗Jo-1抗体检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种Jo-1抗原生物素化的方法，将Jo-1抗原的巯基转化成氨基得到处理后的Jo-1抗原，然后将所述的处理后的Jo-1抗原与生物素偶联得到生物素标记的Jo-1抗原。
发明人首次在Jo-1抗原生物素化方法中增加Jo-1抗原处理步骤，将Jo-1抗原的巯基转化成氨基，以此增加氨基的数量，提高Jo-1抗原与生物素接触反应的概率，从而提高Jo-1抗原生物素化效率。
本发明中，4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐简称磺基SMCC；4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯简称SMCC。
优选地，Jo-1抗原与磺基SMCC和赖氨酸反应得到所述的处理后的Jo-1抗原。
进一步优选地，所述的磺基SMCC和所述的赖氨酸反应得到氨基标记的SMCC，然后所述的氨基标记的SMCC与Jo-1抗原反应得到所述的处理后的Jo-1抗原。
该Jo-1抗原处理方法所需原料易得，处理方法简单，条件温和。
再进一步优选地，所述的磺基SMCC以浓度为0.5～2mol/L的磺基SMCC溶液的形式投料，所述的磺基SMCC溶液的溶剂为二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、或pH为7～7.5的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中的一种或多种。
更进一步优选地，所述的磺基SMCC溶液的浓度为0.8～1.5mol/L。
再进一步优选地，所述的赖氨酸以浓度为0.5～2mol/L的赖氨酸溶液的形式进行投料，所述的赖氨酸溶液的溶剂为pH为7～7.5的磷酸盐缓冲液。
更进一步优选地，所述的赖氨酸溶液的浓度为0.8～1.5mol/L。
再进一步优选地，所述的磺基SMCC和赖氨酸的投料摩尔比为1:5～15。
更进一步优选地，所述的磺基SMCC和赖氨酸的投料摩尔比为1:8～12。
再进一步优选地，所述的Jo-1抗原以Jo-1抗原溶液的形式进行投料，所述的Jo-1抗原溶液的溶剂为pH为7～7.5的磷酸盐缓冲液。
再进一步优选地，所述的氨基标记的SMCC和所述的Jo-1抗原的投料比为1/(30～80)mol/g。
更进一步优选地，所述的氨基标记的SMCC和所述的Jo-1抗原的投料比为1/(40～70)mol/g。
再进一步优选地，所述的磺基SMCC和所述的赖氨酸反应的反应温度为20～30℃。
所述的磺基SMCC和所述的赖氨酸反应在室温下进行即可。
再进一步优选地，所述的磺基SMCC和所述的赖氨酸反应的反应时间为1～5h。
更进一步优选地，所述的磺基SMCC和所述的赖氨酸反应的反应时间为1～3h。
再进一步优选地，所述的氨基标记的SMCC和所述的Jo-1抗原反应的反应温度为于0～10℃。
更进一步优选地，所述的氨基标记的SMCC和所述的Jo-1抗原反应的反应温度为于2～8℃。
再进一步优选地，所述的氨基标记的SMCC和所述的Jo-1抗原反应的反应时间为20～30h。
更进一步优选地，所述的氨基标记的SMCC和所述的Jo-1抗原反应的反应时间为20～24h。
进一步优选地，所述的处理后的Jo-1抗原的制备方法包括以下具体步骤：
步骤1：将浓度为0.5～2mol/L磺基SMCC溶液和浓度为0.5～2mol/L赖氨酸溶液混合，于20～30℃下反应1～5h；
步骤2：加入质量浓度为0.15～0.5mg/mL的Jo-1抗原溶液，于0～10℃下反应20～30h；
步骤3：将反应后的反应液透析，去除未反应的磺基SMCC和未反应的氨基标记的SMCC，得到处理后的Jo-1抗原；
其中，所述的磺基SMCC溶液的溶剂为二甲基亚砜；所述的赖氨酸溶液和所述的Jo-1抗原溶液的溶剂均为pH为7～7.5的磷酸盐缓冲液；所述的磺基SMCC溶液、所述的赖氨酸溶液和所述的Jo-1抗原溶液的体积比为1:5～15:60～120。
更进一步优选地，所述的磺基SMCC溶液、所述的赖氨酸溶液和所述的Jo-1抗原溶液的体积比为1:8～12:80～110。
更进一步优选地，本发明中的所述的磷酸盐缓冲液包括0.08～0.2M的磷酸钠和0.01～0.2M的NaCl。
优选地，所述的生物素为经N-羟基琥珀酸亚胺活化的生物素。
一种抗Jo-1抗体检测试剂盒，所述的抗Jo-1抗体检测试剂盒包括第一试剂，所述的第一试剂为由所述的Jo-1抗原生物素化的方法制备的生物素标记的Jo-1抗原。
优选地，所述的试剂盒还包括第二试剂、磁微粒试剂、化学发光底物、校准品、质控品和清洗液，其中，所述的第二试剂包括碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体。
进一步优选地，所述的磁微粒的粒径为0.1～0.5μm，所述的磁微粒的表面含有链霉亲和素基团，所述的化学发光底物为金刚烷。
本发明中，第二试剂、校准品和质控品的制备方法以及试剂盒的检测方法参考专利CN109085343A。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明首次提出将Jo-1抗原的巯基转化成氨基的工艺，以此增加Jo-1抗原表面氨基的数量，在Jo-1抗原生物素化时，提高Jo-1抗原与生物素反应的概率，增加生物素化效率，此方法原料易得，方法简单，成本低。
附图说明
附图1为化学发光检测原理。
附图2为实施例1的试剂盒的线性回归曲线。
附图3为实施例1的试剂盒的稳定性结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
现有Jo-1抗原的生物化过程中，直接对Jo-1抗原生物素化，效率较低，导致试剂盒的临床符合率还不够理想，因此需要提高Jo-1抗原生物素化的效率。
随着研究的深入，我们分析Jo-1抗原生物素化效率较低的原因可能是暴露的氨基数量不够多，进而Jo-1抗原不能与活化生物素充分反应。因此，我们设计了一种Jo-1抗原生物素化的方法，将Jo-1抗原表面的巯基转化成氨基得到处理后的Jo-1抗原，增加Jo-1抗原的氨基数量，增加Jo-1抗原与生物素结合反应的效率，然后将所述的处理后的Jo-1抗原与生物素偶联得到生物素标记的Jo-1抗原。
具体地，Jo-1抗原与磺基SMCC和赖氨酸反应得到所述的处理后的Jo-1抗原。
进一步地，所述的磺基SMCC和所述的赖氨酸反应得到氨基标记的SMCC，然后所述的氨基标记的SMCC与Jo-1抗原反应得到所述的处理后的Jo-1抗原。
根据一些实施例，Jo-1抗原生物素化的具体步骤为：
步骤1：将浓度为0.5～2mol/L磺基SMCC溶液和浓度为0.5～2mol/L赖氨酸溶液混合，于20～30℃下反应1～5h；
步骤2：加入质量浓度为0.15～0.5mg/mL的Jo-1抗原溶液，于0～10℃下反应20～30h；
步骤3：将反应后的反应液透析，去除未反应的磺基SMCC和未反应的氨基标记的SMCC，得到处理后的Jo-1抗原；
其中，所述的磺基SMCC溶液的溶剂为二甲基亚砜；所述的赖氨酸溶液和所述的Jo-1抗原溶液的溶剂均为pH为7～7.5的磷酸盐缓冲液；所述的磺基SMCC溶液、所述的赖氨酸溶液和所述的Jo-1抗原溶液的体积比为1:5～15:60～120。
本发明中，生物素为经N-羟基琥珀酸亚胺活化的生物素。
根据一些实施例，抗Jo-1抗体检测试剂盒包括第一试剂、第二试剂、磁微粒试剂、化学发光底物、校准品、质控品和清洗液，其中，所述的第一试剂为由所述的Jo-1抗原生物素化的方法制备的生物素标记的Jo-1抗原；所述的第二试剂包括碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体；所述的磁微粒的粒径为0.1～0.5μm，所述的磁微粒的表面含有链霉亲和素基团，所述的化学发光底物为金刚烷。
本发明可采用全自动纳米磁微粒化学发光检测平台，属于定量检测。碱性磷酸酶(AP)-金刚烷(AMPPD)体系，具有稳定性好，灵敏度高，重复性好等优点。同时完成一个测试所需的总时间近在50分钟以内，大大缩短了检测时间，而且操作简易方便，真正实现了检测全自动化。
本发明的试剂盒可帮助评估多发性肌炎，特别的用于体外的多发性肌炎的差异诊断。通过分析生物化学标记物来实现诊断，包括测定样品中抗Jo-1的浓度，将测定的浓度与多发性肌炎的诊断相关联，从而准确诊断出疾病的严重程度，指导医生用药，为病人早期诊断治疗提供保障。
以下实施例中，未注明的实施条件为本行业中的常规条件，试剂均可市购获得。磺基SMCC购自Thermo。
实施例1
抗Jo-1抗体检测试剂盒的主要成分如下：
表1：抗Jo-1抗体检测试剂盒主要成分
Jo-1抗原生物素化方法如下：
1)在1ml 0.1M磷酸钠，0.15M NaCl，pH为7.2的磷酸盐缓冲液中溶解1mmol赖氨酸(146.19mg)，得到1mol/L赖氨酸溶液。
2)用1ml DMSO溶解1mmol磺基SMCC(436.37mg)，1mol/L磺基SMCC溶液。
3)向1ml 1mol/L赖氨酸溶液中加入0.1ml 1mol/L磺基SMCC溶液，加入后立即混匀。室温混匀反应2小时，得到氨基标记后的SMCC溶液。
4)取3mg Jo-1抗原溶解于9ml 0.1M磷酸钠，0.15M NaCl，pH为7.2的磷酸盐缓冲液中。5)在9ml Jo-1抗原溶液中加入1ml上述氨基标记后的SMCC溶液，2～8℃反应24小时。
6)将反应后的Jo-1溶液透析，除去未反应的SMCC，最终得到处理后的Jo-1抗原。
7)将Jo-1抗原与经N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素混合，在20～30℃下混匀反应20～40min；
8)加入物质的量浓度为0.04～0.06mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，在25～35℃下混匀反应20～40min，再加入甘油，获得生物素化的Jo-1抗原；
9)用pH为7～8、物质的量浓度为0.01～0.02mol/L的磷酸盐缓冲液将所述的生物素化的Jo-1抗原稀释成浓度为0.5～1ug/mL的混合溶液。
对比例1
与实施例1基本相同，不同之处在于：第一试剂制备时未进行Jo-1抗原巯基转氨基步骤。
使用专利CN109085343A公开的全自动化学发光测定仪测试步骤进行测试，检测结果如下：
实施例1和对比例1的样本比对
阴、阳性符合率：使用实施例1和对比例1的试剂盒分别检测328例临床血清抗Jo-1抗体的含量，并与国外知名公司同类产品进行临床比对。表2显示将抗原的巯基基团转化为氨基基团后，抗Jo-1抗体试剂盒阴性符合率为99.56％(226/227)，阳性符合率为100.00％(101/101)，表3显示未将抗原的巯基基团转化为氨基基团时，抗Jo-1抗体试剂盒阴性符合率为99.56％(226/227)，阳性符合率为90.00％(91/101)。实施例1的试剂盒临床符合率相比对比例1显著提高。
表2：实施例1的Anti-Jo-1IgG临床样本比对
表3：对比例1的Anti-Jo-1IgG临床样本比对
实施例1的试剂盒的其他性能测试
(1)灵敏度：本发明抗Jo-1抗体检测试剂盒LOD为0.013RU/mL，而酶联免疫法的灵敏度为2RU/mL。
(2)线性：将一份高值血清按照1/2、1/4、1/8、1/16、1/40、1/80、1/200、1/400用实施例1的抗Jo-1抗体试剂盒检测稀释样本，将理论浓度与实际检测浓度做线性回归，结果见图2。
(3)准确度：通过加样回收评估其准确度。以一份高值血清、一份中值血清、一份低值血清按照1：9添加到两份基础血清中，计算其浓度。结果见表4，血清加样回收率在98％-105％之间。
添加回收实验(加样回收率＝添加后样板值/(0.1*样本A+0.9样本B)*100％
表4
(4)精密度：对两种不同浓度的质控品进行检测，每天两次，分上下午检测，每次进行4个重复，共检测5天，每种浓度共测定40次，计算变异系数，结果见表5，结果表明变异系数在5％以内。
表5
(5)稳定性：将本发明抗Jo-1抗体检测试剂盒37℃放置1天、4天和7天后，分别测试信号保留率，结果见表6和图3。结果显示，37℃放置1天后，信号保留率为95.2％，放置4天后，信号保留率为92.8％，放置7天后，信号保留率为89.4％。可见抗Jo-1抗体检测试剂盒稳定好，符合临床要求。
表6
(6)特异性：对高、中、低不同浓度值的血清添加不同浓度的胆红素(表7)、血红蛋白(表8)、甘油三酯(表9)后检测，结果显示添加物质对本发明抗Jo-1抗体检测试剂盒检测结果没有影响。
表7
表8
表9
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种Jo-1抗原生物素化的方法，其特征在于，将4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐和赖氨酸反应得到氨基标记的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯，然后将所述的氨基标记的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯与Jo-1抗原反应得到处理后的Jo-1抗原，再将所述的处理后的Jo-1抗原与生物素偶联得到生物素标记的Jo-1抗原。
2.根据权利要求1所述的Jo-1抗原生物素化的方法，其特征在于，所述的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐以浓度为0.5~2mol/L的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液的形式投料，所述的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液的溶剂为二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺或pH为7~7.5的磷酸盐缓冲液中的一种或多种；
和/或，所述的赖氨酸以浓度为0.5~2mol/L的赖氨酸溶液的形式进行投料，所述的赖氨酸溶液的溶剂为pH为7~7.5的磷酸盐缓冲液；
和/或，所述的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐和赖氨酸的投料摩尔比为1:5~15；
和/或，所述的Jo-1抗原以Jo-1抗原溶液的形式进行投料，所述的Jo-1抗原溶液的溶剂为pH为7~7.5的磷酸盐缓冲液；
和/或，所述的氨基标记的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和所述的Jo-1抗原的投料比为1/(30~80)mol/g。
3.根据权利要求1所述的Jo-1抗原生物素化的方法，其特征在于，
所述的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐和所述的赖氨酸反应的反应温度为20~30℃；
和/或，所述的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐和所述的赖氨酸反应的反应时间为1~5h；
和/或，所述的氨基标记的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和所述的Jo-1抗原反应的反应温度为于0~10℃；
和/或，所述的氨基标记的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和所述的Jo-1抗原反应的反应时间为20~30h。
4.根据权利要求1所述的Jo-1抗原生物素化的方法，其特征在于，所述的处理后的Jo-1抗原的制备方法包括以下具体步骤：
步骤1：将浓度为0.5~2mol/L4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液和浓度为0.5~2mol/L赖氨酸溶液混合，于20~30℃下反应1~5h；
步骤2：加入质量浓度为0.15~0.5mg/mL的Jo-1抗原溶液，于0~10℃下反应20~30h；
步骤3：将反应后的反应液透析，去除未反应的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐和未反应的氨基标记的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯，得到处理后的Jo-1抗原；
其中，所述的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液的溶剂为二甲基亚砜；所述的赖氨酸溶液和所述的Jo-1抗原溶液的溶剂均为pH为7~7.5的磷酸盐缓冲液；所述的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶液、所述的赖氨酸溶液和所述的Jo-1抗原溶液的体积比为1:5~15:60~120。
5.根据权利要求1所述的Jo-1抗原生物素化的方法，其特征在于，所述的生物素为经N-羟基琥珀酸亚胺活化的生物素。
6.一种抗Jo-1抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的抗Jo-1抗体检测试剂盒包括第一试剂，所述的第一试剂为由权利要求1至5中任一项所述的Jo-1抗原生物素化的方法制备的生物素标记的Jo-1抗原。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括第二试剂、磁微粒试剂、化学发光底物、校准品、质控品和清洗液，其中，所述的第二试剂包括碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒的粒径为0.1~0.5μm，所述的磁微粒的表面含有链霉亲和素基团，所述的化学发光底物为金刚烷。
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