CN112285359A - 一种涎液化糖链抗原测定试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，尤其涉及一种涎液化糖链抗原测定试剂盒及其检测方法。本发明的涎液化糖链抗原检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2；试剂R1包括：稳定剂5～50g/L、防腐剂0.05～2g/L，并利用缓冲液调节pH为2～9；试剂R2包括：表面活性剂5～30g/L、稳定剂5～30g/L、抗人涎液化糖链抗原抗体乳胶颗粒结合物0.1～2g/L、防腐剂0.05～2g/L，并利用缓冲液调节pH为2～9。本发明试剂盒灵敏度高，最低检测能够达到50.0U/mL，且线性范围广，可达50～10000U/mL，可实现对涎液化糖链抗原的准确检测。

Description

一种涎液化糖链抗原测定试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，尤其涉及一种涎液化糖链抗原测定试剂盒及其检测方法。
背景技术
涎液化糖链抗原(Krebs Von Den Lungen-6，KL-6)是一种跨膜高分子量黏蛋白，含有分子量约为200KD的唾液酸化糖链，该糖链主要是由20个氨基酸残基组成的串联重复序列，具有被特异性抗体识别的空间结构表位。KL-6在肺支气管上皮的膜表面二硫键处形成肺支气管上皮被覆液，主要表达于Ⅱ型肺泡细胞和支气管上皮细胞的细胞质和胞膜。有研究指出，KL-6不仅是构成肺组织间质的蛋白质，还可作为肺组织高度特异性的标志。
间质性肺炎(IP)是以肺间质为主要病变部位的疾病。正常肺泡壁出现炎症或损伤后，肺间质逐渐变厚、变硬，随着病情恶化肺部会出现纤维化，从而引起肺部通气功能障碍，导致供氧不足，表现出呼吸困难等症状。间质性肺炎已知的病因包括自身免疫疾病引起、长期吸入粉尘颗粒物、以及使用药物(抗癌药、免疫抑制剂等)。患者表现为活动后气嘴、日常干咳，药物副作用加重等症状。
KL-6可以对肺间质状态进行检测，帮助选择治疗药物，也可用于判断停药时间。当发生间质性肺炎等情况时，肺泡上皮细胞受到损伤后会向血液中释放KL-6，使血液中KL-6蛋白的浓度升高。活动期的间质性肺炎患者血液中存在高浓度的KL-6，有效的治疗可以降低测定值。
近年来，随着医学各种检查技术的不断发展，尤其是肺部影像学如高分辨CT在临床中的广泛应用，提高了间质性肺炎患者早期诊断准确率，但间质性肺炎治疗并未取得实质性进展，部分患者的预后差，死亡率高。早期诊断和治疗可改善患者预后，故目前除临床已用于间质性肺炎诊断的肺CT、肺功能、血气分析、支气管镜及肺活检等手段外，与间质性肺炎疾病发展及转归有关的血清学检测亦成为研究热点，目前，有许多研究者认为KL-6在间质性肺炎的早期诊断及病变程度、发生、进展、药物疗效及预后评价均有重要价值。
目前现有技术中，涎液化糖链抗原的检测方法有酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)和免疫浊度法(INA、ITA)。在酶联免疫吸附测定中，其检测灵敏度高，但操作过程略显复杂、测定时间较长、影响因素多，且此法主要应用于科学研究，不能用于临床诊断；在化学发光免疫分析法测定中，其自动化操作速度快、准确度高，但是成本高、设备昂贵、稳定性较差，无法普及中基层医院及医疗机构；免疫浊度法又可分为散射比浊(INA)和透射比浊(ITA)，这类方法的优点是快速简便，精密度高、易于自动化，适于大批量标本的同时检测，也可进行少量样本和急诊样本的测定，具有很强的适用性。散射比浊(INA)法由于其光波接收方式的特点，通常测试结果的灵敏度与测速要优于透射比浊，但需要专门仪器的散射比浊仪或特种蛋白仪，与专用配套试剂，测定成本较高，不易于在基层医院中推广使用。透射比浊(ITA)法，操作简便适用性强，普通自动生化分析仪和分光光度计均可使用，更易于被常规分析所采用，几乎所有的各实验室、基层医院均能开展，不足的是灵敏度和精密度均不够理想。
因此，亟待在现有的涎液化糖链抗原胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒的制备基础上进行改良，提高涎液化糖链抗原检测试剂盒的灵敏度、精密度、适用性是目前的市场需求。
发明内容
因此，针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种涎液化糖链抗原测定试剂盒及其检测方法，可以实现对涎液化糖链抗原的准确检测。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种涎液化糖链抗原检测试剂盒，所述检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2；
所述试剂R1包括：稳定剂5～50g/L、防腐剂0.05～2g/L，并利用缓冲液调节pH为2～9；
所述试剂R2包括：表面活性剂5～30g/L、稳定剂5～30g/L、抗人涎液化糖链抗原抗体乳胶颗粒结合物0.1～2g/L、防腐剂0.05～2g/L，并利用缓冲液调节pH为2～9。
本发明的涎液化糖链抗原测定试剂盒，通过放大抗体抗原反应以及添加稳定剂、表面活性剂等优化反应体系，增加了免疫复合物的直径，提高了检测敏感性和测定试剂的分析灵敏度及精密度，可实现对涎液化糖链抗原的准确检测，同时适用于多种全自动生化分析仪，适于大批量标本的同时检测，也可进行少量样本和急诊样本的测定，具有广泛的通用性，且未提高试剂研发成本，更易适应现代化临床检验医学的发展。
本发明涎液化糖链抗原(KL-6)测定试剂盒，基于胶乳增强免疫比浊法(PETIA)，其原理是采用化学偶联法将特异性抗体结合于一定粒径的胶乳颗粒表面，当交联有抗体的微球与抗原结合后，短时间内迅速聚集在一起，从而改变反应液的吸光度。根据吸光度增加量，即可在特定波长处测定免疫复合物浊度，定量检测血清中的涎液化糖链抗原含量。
作为本发明所述的检测试剂盒的优选实施方式，所述缓冲液为甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Hepes缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Good's缓冲液中的任意一种。
作为本发明所述的检测试剂盒的优选实施方式，所述稳定剂为蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、甘油、明胶、小牛血清白蛋白、酪蛋白中的任意一种或多种。更优选的，所述稳定剂为小牛血清白蛋白(BSA)，浓度为10g/L。
适量的稳定剂可以提供良好稳定的反应环境，使抗原抗体保持天然构象。
作为本发明所述的检测试剂盒的优选实施方式，所述表面活性剂为吐温80、PEG6000、PEG 12000、十二烷基硫酸钠、曲拉通X-100中的任意一种或多种。更优选的，所述表面活性剂为PEG 6000，浓度为10g/L。
表面活性剂能够在试剂加入到反应体系时，降低表面张力，提高分散性和稳定性。本发明试剂盒特地添加了PGE 6000作为表面活性剂，并调整其用量为10g/L。
作为本发明所述的检测试剂盒的优选实施方式，所述涎液化糖链抗原抗体为单克隆抗体。
单克隆抗体特异性强、灵敏度高，同时可大量制备。
作为本发明所述的检测试剂盒的优选实施方式，所述涎液化糖链抗原抗体为羊抗人涎液化糖链抗原抗体、兔抗人涎液化糖链抗原抗体、鼠抗人涎液化糖链抗原抗体中的任意一种。
作为本发明所述的检测试剂盒的优选实施方式，所述抗人涎液化糖链抗原抗体乳胶颗粒结合物是由涎液化糖链抗原抗体和胶乳微球采用化学偶联法得到。
作为本发明所述的检测试剂盒的优选实施方式，所述抗人涎液化糖链抗原抗体乳胶颗粒结合物的胶乳微球粒径为80～150nm，优选为120nm。
作为本发明所述的检测试剂盒的优选实施方式，所述防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin 300、异噻唑啉酮中的任意一种或多种。
作为本发明所述的检测试剂盒的优选实施方式，所述检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2；
所述试剂R1包括：甘油5g/L、Proclin 300 0.5g/L，并利用50mmol/L的甘氨酸缓冲液调节pH为2～9；
所述试剂R2包括：聚乙二醇6000 10g/L、小牛血清白蛋白10g/L、乳胶颗粒抗人涎液化糖链抗原抗体结合物1.5g/L、Proclin 300 0.5g/L，并利用150mmol/L的磷酸盐缓冲液调节pH为2～9。
本发明的有益效果：
(1)胶乳增强免疫比浊检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等繁琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。胶乳增强免疫比浊法由于其适用性强、测试方便等特性，已广泛应用于临床检测中。
(2)本发明试剂盒灵敏度高，最低检测能够达到50.0U/mL，且线性范围广，可达50～10000U/mL，可实现对涎液化糖链抗原的准确检测。
(3)本发明试剂盒可在具备有400-800nm波长的全自动生化分析仪上检测血液中涎液化糖链抗原的含量，直接上机使用，快速精准，自动化程度高，大大提高工作效率。且检测样本量少，可进行少量样本和急诊样本的测定。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
(1)本发明实施例的一种涎液化糖链抗原检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2；其中：
试剂R1：甘油5g/L、Proclin 300 0.5g/L，并利用50mmol/L的甘氨酸缓冲液调节pH为6。
试剂R2：聚乙二醇6000(PEG 6000)10g/L、小牛血清白蛋白(BSA)10g/L、乳胶颗粒抗人涎液化糖链抗原抗体结合物1.5g/L、Proclin 300 0.5g/L，并利用150mmol/L的磷酸盐缓冲液调节pH为7。
其中，乳胶颗粒抗人涎液化糖链抗原抗体结合物的制备方法为：
①取1mL羧基化的胶乳微球(120nm，10％固含量)用50mmol/L的甘氨酸缓冲液稀释至5ml。
②加入1.5ml 25g/L的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1.5ml 9.0g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)进行活化，搅拌均匀后37℃孵育20min。
③加入3mL 150mmol/L的磷酸盐缓冲液，室温搅拌均匀。
④加入2g羊抗人涎液化糖链抗原反应抗体，37℃孵育4小时。
⑤加入3mL终止液终止反应，室温下搅拌3小时后，4℃保存备用。终止液为含20％BSA的磷酸盐缓冲液。
(2)涎液化糖链抗原质控品的制备
将10000U/mL的高浓度涎液化糖链抗原样品用含有5g/L NaCl、0.5g/L叠氮钠的50～150mmol/L甘氨酸缓冲液进行稀释，得到涎液化糖链抗原质控品，使浓度分别控制在625U/mL和5000U/mL，其中，625U/mL作为低值质控品，5000U/mL作为高值质控品。涎液化糖链抗原质控品均为无色透明液体。
利用本实施例制备得到的试剂盒检测涎液化糖链抗原，包括如下步骤：
(1)制备涎液化糖链抗原标准品
将纯化好的涎液化糖链抗原用含有5g/L NaCl、0.5g/L叠氮钠的50～150mmol/L甘氨酸缓冲液进行稀释，使涎液化糖链抗原的浓度分别控制在0U/mL、625U/mL、1250U/mL、2500U/mL、5000U/mL、10000U/mL，得到涎液化糖链抗原标准品，涎液化糖链抗原标准品均为无色透明液体。
(2)绘制校准曲线
分别向步骤(1)中得到的涎液化糖链抗原标准品中加入试剂R1，混匀，孵育3～5min后，加入R2混匀孵育20s后，于570nm波长下检测吸光度值A1，5min后，于570nm波长下检测吸光度值A2(反应方法为终点法，主波长为570nm，反应方向为正反应，反应温度为37℃，比色杯光径为1.0cm条件下)。分别计算标准品的吸光度变化值△A＝A2-A1，并绘制校准曲线，校准曲线使用多点非线性拟合，得出吸光度变化值与涎液化糖链抗原浓度的线性关系公式。
(3)样本中涎液化糖链抗原浓度的测定
测定样本的吸光度变化值△B，代入步骤(1)中得到的公式，即可得出样本中涎液化糖链抗原的浓度。
实施例2
本发明实施例的一种涎液化糖链抗原检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2；其中：
试剂R1：甘油25g/L、PC300 2g/L，并利用150mmoL/L的Tris-HCl缓冲液调节pH为7。
试剂R2：PEG6000 30g/L、小牛血清白蛋白(BSA)30g/L、乳胶颗粒抗人涎液化糖链抗原抗体结合物2g/L、PC300 2g/L，并利用200mmoL/L的Tris-HCl缓冲液调节pH为8。
测试例1涎液化糖链抗原检测试剂盒的准确度分析
试验仪器：AU2700全自动生化分析仪。
检测样本：20例涎液化糖链抗原浓度较高的无溶血、黄疸、浑浊现象的血清样本(靶值为5450U/mL)。
对照试剂盒：国家食品药品监督管理局已批准上市的某厂家涎液化糖链抗原检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)(包括试剂R1和R2，但成分与本发明不同，以下简称为对照试剂)。
分别使用本发明实施例1-2中制备得到的试剂盒和对照试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)同时对涎液化糖链抗原浓度较高的无溶血、黄疸、浑浊现象的人血清样本进行测定，重复3遍，计算均值、CV和偏差。偏差范围在±10％以内视为无干扰，偏差范围超过±10％视为干扰。结果如表1所示；
表1实施例1的样品检测结果(单位：U/mL)
Figure BDA0002694000280000071
Figure BDA0002694000280000081
表2涎液化糖链抗原血清样本检测结果
Figure BDA0002694000280000082
结果显示，根据实施例1、实施例2检测结果计算出的20例样品检查结果平均值分别为1361.95、1367.20，计算出的相对偏差分别为0.13％、-0.20％，表明本发明涎液化糖链抗原检测试剂盒检测结果与对照试剂盒结果无明显差异，具有较高准确度(符合度)，而且实施例1为最优的选择。
测试例2涎液化糖链抗原检测试剂盒的灵敏度分析
试验仪器：AU2700全自动生化分析仪。
检测样本：1份纯化水、1份浓度为180U/mL的涎液化糖链抗原低值样本。
用实施例1制备得到的试剂盒和对照试剂盒(某厂家涎液化糖链抗原检测试剂盒)用各自的检测方法同时定标同时对每份待测样本重复检测20次，记录吸光度数值，计算平均值和标准偏差(SD)；水的吸光度平均值加上2SD作为最低检出限对应的吸光度值，由于吸光度与浓度的关系基本为线性关系，可以通过和180U/mL样本的吸光度平均值比较计算出最低检测限的浓度，即灵敏度。灵敏度＝(水吸光度差值平均值+2SD)*样本浓度/样本吸光度差值平均值。检测结果见表3。
表3实施例1试剂盒与对照试剂盒灵敏度分析结果(单位：U/mL)
Figure BDA0002694000280000091
结果显示，本发明实施例1试剂盒检测涎液化糖链抗原的灵敏度为3.41mg/L，对照试剂的灵敏度为5.07mg/L，表明本发明试剂盒具有较高的灵敏度。
测试例3：涎液化糖链抗原检测试剂盒的精密度分析
试验仪器：AU2700全自动生化分析仪。
检测样本：1份临床血清样本(245U/mL)(低值样本)、1份涎液化糖链抗原血清样本(3515U/mL)(高值样本)。
用实施例1制备得到的试剂盒和对照试剂盒(某厂家涎液化糖链抗原检测试剂盒)对每份待测样本重复检测10次，检测结果见表4。
表4实施例1试剂盒精密度分析结果(单位：U/mL)
Figure BDA0002694000280000101
结果显示，实施例1试剂盒的精密度：CV低值为0.4、CV高值为0.02，均小于等于10％；而对照试剂盒CV低值为0.65、CV高值为0.03，表明本发明试剂盒比对照试剂盒具有更高的精密度。
测试例4：涎液化糖链抗原检测试剂盒的线性分析
试验仪器：AU2700全自动生化分析仪。
检测样本：高涎液化糖链抗原血清样本(10000U/mL)。
将高涎液化糖链抗原血清样本(10000U/mL)用校准品稀释液稀释成7个不同浓度，分别为0U/mL、50U/mL、2040U/mL、4030U/mL、6020U/mL、8010U/mL、10000U/mL，采用实施例1制备得到的试剂盒对上述样品的每个浓度进行检测，每个浓度检测三次，计算相关系数R值，检测结果见表5。
表5试剂盒线性分析结果
Figure BDA0002694000280000102
Figure BDA0002694000280000111
结果显示，实施例1制备得到的试剂盒检测结果得到的回归方程为y＝0.9965x+11.033，相关系数R2＝0.9998，表明本发明试剂盒在50U/mL～10000U/mL范围内具有良好的线性度。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种涎液化糖链抗原检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2；
所述试剂R1包括：稳定剂5～50g/L、防腐剂0.05～2g/L，并利用缓冲液调节pH为2～9；
所述试剂R2包括：表面活性剂5～30g/L、稳定剂5～30g/L、抗人涎液化糖链抗原抗体乳胶颗粒结合物0.1～2g/L、防腐剂0.05～2g/L，并利用缓冲液调节pH为2～9。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Hepes缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Good's缓冲液中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、甘油、明胶、小牛血清白蛋白、酪蛋白中的任意一种或多种。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为吐温80、PEG6000、PEG12000、十二烷基硫酸钠、曲拉通X-100中的任意一种或多种。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述涎液化糖链抗原抗体为单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述涎液化糖链抗原抗体为羊抗人涎液化糖链抗原抗体、兔抗人涎液化糖链抗原抗体、鼠抗人涎液化糖链抗原抗体中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗人涎液化糖链抗原抗体乳胶颗粒结合物是由涎液化糖链抗原抗体和胶乳微球采用化学偶联法得到。
8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗人涎液化糖链抗原抗体乳胶颗粒结合物的胶乳微球粒径为80～150nm。
9.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin 300、异噻唑啉酮中的任意一种或多种。
10.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括试剂R1、试剂R2；
所述试剂R1包括：甘油5g/L、Proclin 300 0.5g/L，并利用50mmoL/L的甘氨酸缓冲液调节pH为2～9；
所述试剂R2包括：聚乙二醇6000 10g/L、小牛血清白蛋白10g/L、乳胶颗粒抗人涎液化糖链抗原抗体结合物1.5g/L、Proclin 300 0.5g/L，并利用150mmoL/L的磷酸盐缓冲液调节pH为2～9。
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