CN108982850A - 一种用于检测胃蛋白酶原ⅱ的试剂盒 - Google Patents

一种用于检测胃蛋白酶原ⅱ的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，属于生物检测技术领域，该试剂盒包含试剂R1和试剂R2，试剂R1包含以下浓度的组分：缓冲液10～200mmoL/L、表面活性剂0.01～5g/L、促凝剂5～20g/L、防腐剂0.05～2g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；试剂R2包含以下浓度的组分：缓冲液80～160mmoL/L、稳定剂10～120g/L、封闭剂5～30g/L、抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液0.5～3.0g/L、防腐剂0.05～2g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度；稳定剂至少为甘油、蔗糖、海藻糖和葡萄糖中的一种。本发明试剂盒具有灵敏度高、精密度高、试剂稳定等优点。

Description

一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒。
背景技术
胃蛋白酶原(Pepsinogen，PG)是胃液中胃蛋白酶的无活性前体，是分子量为42000Da的单链多肽，其在胃内可转变为具有活性的胃蛋白酶。根据生化性质、免疫原性、细胞来源及组织分布，胃蛋白酶原可分成胃蛋白酶原Ⅰ(PGⅠ)、胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)两个亚群：其中1～5组分免疫原性近似，称为PGⅠ(PGA)，主要由胃底腺的主细胞和颈粘液细胞分泌；6～7组分被称为PGⅡ(PGC)，除由上述两种细胞分泌外，幽门腺的黏液细胞、贲门腺以及十二指肠上段的Brunner腺也能产生PGⅡ，胃粘膜合成的PGⅡ约为总量的25％。
正常情况下，胃粘膜产生的胃蛋白酶原大部分进入胃腔，遇酸后肽链分解活化为胃蛋白酶，发挥其消化蛋白质的作用；小部分胃蛋白酶原则透过胃粘膜毛细血管进入血循环。血清胃蛋白酶原浓度可反映胃粘膜的分泌水平，不同胃蛋白酶原浓度水平也可反映不同部位胃粘膜的功能和形态变化。PGⅡ与胃底粘膜病变的相关性较大(相对于胃窦粘膜)，其升高与胃底腺管萎缩、胃上皮化生、假幽门腺化生或异型增值有关。
目前现有技术中，胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)的检测方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)和胶乳免疫比浊法等。在酶联免疫吸附测定中，其检测灵敏度高，但操作过程略显复杂、测定时间较长、影响因素多，且不适合急诊样本的检测；在化学发光免疫分析法测定中，其自动化操作速度快、准确度高，但是成本高、设备昂贵、稳定性较差，无法普及中基层医院及医疗机构；在胶乳免疫比浊法测定中，其检测快速、精准、灵敏度高、特异性强、精密度好、成本较低，且检测样本量少，可进行少量样本和急诊样本的测定。
然而，现有的胶乳免疫比浊法存在一些不足：稳定性较差、灵敏度差。因此，有必要设计出一种新型的检测试剂盒，该试剂盒检测的稳定性较好、灵敏度高。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，其具有稳定性好、灵敏度高的优点。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，其包含试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包含以下浓度的组分：缓冲液10～200mmoL/L、表面活性剂0.01～5g/L、促凝剂5～20g/L、防腐剂0.05～2g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；所述试剂R2包含以下浓度的组分：缓冲液80～160mmoL/L、稳定剂10～120g/L、封闭剂5～30g/L、抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液0.5～3g/L、防腐剂0.05～2g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度；所述稳定剂至少为甘油、蔗糖、海藻糖和葡萄糖中的一种。
在本发明的试剂R2中加入稳定剂，当稳定剂为甘油、蔗糖、海藻糖或葡萄糖时，可以提高样本检测的稳定性和灵敏度；适量的稳定剂可以在取得较好的效果前提下减少稳定剂的用量。试剂R1中添加适量的促凝剂，避免了因聚合物过多造成的非特异性反应和因聚合物太少导致的灵敏度过低，合适的聚合物用量有利于提高灵敏度和特异性。试剂R1中添加适量的表面活性剂，有效提高了检测的精密度。
作为上述技术方案的改进，所述稳定剂为甘油。
作为上述技术方案的改进，在试剂R1中，所述缓冲液至少为MES-NaOH缓冲液(MES，吗啉乙磺酸)、MOPS-NaOH缓冲液(MOPS，3-(N-吗啉基)丙磺酸)、HEPPS-NaOH缓冲液(HEPPS，4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液中的一种，所述表面活性剂至少为曲拉通X-100、吐温20、司盘40中的一种，所述促凝剂至少为聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇12000中的一种，所述防腐剂至少为叠氮钠、Proclin-300、硫柳汞中的一种；
在试剂R2中，所述缓冲液至少为MES-NaOH缓冲液、MOPS-NaOH缓冲液、HEPPS-NaOH缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液中的一种，所述封闭剂至少为小牛血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白中的一种，所述防腐剂至少为叠氮钠、Proclin-300、硫柳汞中的一种。
作为上述技术方案的进一步改进，在试剂R1中，所述缓冲液至少为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的一种，所述表面活性剂为曲拉通X-100，所述促凝剂为聚乙二醇6000，所述防腐剂为Proclin-300；
在试剂R2中，所述缓冲液至少为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的一种，所述封闭剂为小牛血清白蛋白，所述防腐剂为Proclin-300。
作为上述技术方案的改进，所述抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液是由羧基化胶乳微球进行制备，所述羧基化胶乳微球的粒径是相同的，羧基化胶乳微球的粒径为80～200nm。
作为上述技术方案的进一步改进，所述抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液是通过以下方法进行制备：
S1)取羧基化胶乳微球溶液，用磷酸盐缓冲液稀释；羧基化胶乳微球为聚苯乙烯胶乳微球；
S2)加入N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基化胶乳微球，搅拌均匀后孵育；
S3)再加入磷酸盐缓冲液，室温下搅拌；
S4)加入抗人胃蛋白酶原II抗体后，进行孵育；抗人胃蛋白酶原II抗体与羧基化胶乳微球的质量比为0.2：1；优选地，所述抗人胃蛋白酶原II抗体为抗人胃蛋白酶原II(小鼠)单克隆抗体、抗人胃蛋白酶原II(兔)多克隆抗体或抗人胃蛋白酶原II(羊)多克隆抗体，更优选为抗人胃蛋白酶原II(小鼠)单克隆抗体；
S5)加入终止液终止反应，室温下搅拌后保存备用；所述终止液是含有质量体积浓度为20％BSA的磷酸盐缓冲液。
作为上述技术方案的更进一步改进，羧基化胶乳微球的粒径为145nm，羧基化胶乳微球溶液中羧基化胶乳微球的质量百分数为5％。
现有胶乳免疫比浊法，采用化学偶联法将特异性抗体结合于多种粒径组合的复合胶乳上，虽可兼顾检测灵敏度和线性范围，但胶乳试剂制备操作繁琐，易导致复合胶乳重复性差、稳定性差等；且胶乳试剂制备过程中，多采用超声波处理、离心与重悬，操作繁琐，制备时间较长，试剂均一性和稳定性较难控制。
鉴于此，本发明采用化学偶联法将特异性抗体结合于单一粒径的胶乳颗粒表面，通过特定的制备方法以及添加多种表面活性剂、稳定剂、促凝剂等优化反应体系，无需多次离心和重悬，无需超声波分散仪处理，即可获得稳定的胶乳试剂，标本与胶乳试剂在缓冲液中混合，标本中PGⅡ与胶乳颗粒表面的抗体结合，与相邻的胶乳颗粒彼此交联，同时兼顾了检测灵敏度和线性范围，显著提高了测定试剂的灵敏度和稳定性，可适用于各类全自动生化分析仪进行分析，该试剂稳定的同时其检测时间短、灵敏度高、特异性强、精密度好、成本较低，可以实现对胃蛋白酶原Ⅱ的准确检测。
作为上述技术方案的改进，所述试剂R1由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、Tris-HCl缓冲液50mmol/L、曲拉通X-100 1g/L、聚乙二醇6000 8g/L和Proclinc300 0.5g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；所述R2由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、甘油80g/L、小牛血清白蛋白20g/L、抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液1.5g/L和Proclinc-3000.5g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度。
作为上述技术方案的改进，所述试剂R1由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、Tris-HCl缓冲液50mmol/L、曲拉通X-100 1g/L、聚乙二醇6000 8g/L和Proclinc300 0.5g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；所述R2由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、海藻糖80g/L、小牛血清白蛋白20g/L、抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液1.5g/L和Proclinc-300 0.5g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度。
本发明试剂盒的检测方法，包括如下步骤：分离血清样品，向血清样品中加入试剂R1，混匀，孵育3～5min；再加入试剂R2，混匀孵育30s后，于700nm波长下检测吸光度值A1，5min后，于700nm波长下检测吸光度值A2，通过血清标准品数据计算胃蛋白酶原Ⅱ的含量。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，本试剂盒采用胶乳免疫比浊法进行胃蛋白酶原Ⅱ的测定；在抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液的制备过程中，用化学偶联法将特异性抗体结合于单一粒径的胶乳微球颗粒表面，通过特定的制备方法和优化反应体系，无需多次离心和重悬，无需超声波处理，即可获得稳定的胶乳试剂，同时兼顾了检测灵敏度和线性范围，显著提高了测定试剂的灵敏度和稳定性；在本发明的试剂R2中加入稳定剂，当稳定剂为甘油、蔗糖、海藻糖或葡萄糖时，可以提高样本检测的稳定性和灵敏度；适量的稳定剂可以在取得较好的效果前提下减少稳定剂的用量；在试剂R1中，添加适量的促凝剂，避免了因聚合物过多造成的非特异性反应和因聚合物太少导致的灵敏度过低，合适的聚合物用量有利于提高灵敏度和特异性；在试剂R1中，添加适量的表面活性剂，有效提高了检测的精密度。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，包含试剂R1和试剂R2；试剂R1由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、Tris-HCl缓冲液50mmol/L、曲拉通X-100 1g/L、聚乙二醇6000 8g/L和Proclinc 300 0.5g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；试剂R2由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、甘油80g/L、小牛血清白蛋白20g/L、抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液1.5g/L和Proclinc-300 0.5g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度。
上述抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液是通过以下方法进行制备：
S1)取3mL羧基化胶乳微球溶液，用磷酸盐缓冲液稀释至6mL；羧基化胶乳微球为聚苯乙烯胶乳微球，羧基化微球的粒径为145nm，羧基化胶乳微球溶液中羧基化胶乳微球的质量百分数为5％；
S2)加入5mL 2.5g/L N-羟基丁二酰亚胺和5mL 1.5g/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基化胶乳微球，搅拌均匀后37℃孵育20min；
S3)再加入3mL磷酸盐缓冲液，室温下搅拌10min；
S4)加入抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体后，37℃孵育4h；抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体与羧基化胶乳微球的质量比为0.2：1，抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体为抗人胃蛋白酶原Ⅱ(小鼠)单克隆抗体；
S5)加入3mL终止液终止反应，室温下搅拌3h后4℃保存备用；所述终止液是含有质量体积浓度为20％BSA的磷酸盐缓冲液。
实施例2
本实施例提供一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，包含试剂R1和试剂R2；试剂R1由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、Tris-HCl缓冲液50mmol/L、曲拉通X-100 1g/L、聚乙二醇6000 8g/L和Proclinc 300 0.5g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；试剂R2由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、海藻糖80g/L、小牛血清白蛋白20g/L、抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液1.5g/L和Proclinc-300 0.5g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度。
上述抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液是通过以下方法进行制备：
S1)取3mL羧基化胶乳微球溶液，用磷酸盐缓冲液稀释至6mL；羧基化胶乳微球为聚苯乙烯胶乳微球，羧基化微球的粒径为145nm，羧基化胶乳微球溶液中羧基化胶乳微球的质量百分数为5％；
S2)加入5mL 2.5g/L N-羟基丁二酰亚胺和5mL 1.5g/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基化胶乳微球，搅拌均匀后37℃孵育20min；
S3)再加入3mL磷酸盐缓冲液，室温下搅拌10min；
S4)加入抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体后，37℃孵育4h；抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体与羧基化胶乳微球的质量比为0.2：1，抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体为抗人胃蛋白酶原Ⅱ(小鼠)单克隆抗体；
S5)加入3mL终止液终止反应，室温下搅拌3h后4℃保存备用；所述终止液是含有质量体积浓度为20％BSA的磷酸盐缓冲液。
实施例3
本实施例提供一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，包含试剂R1和试剂R2；试剂R1由以下浓度的组分构成：MOPS-NaOH缓冲液10mmoL/L、吐温20 0.01g/L、聚乙二醇80005g/L和叠氮钠0.05g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；试剂R2由以下浓度的组分构成：MOPS-NaOH缓冲液160mmoL/L、蔗糖10g/L、酪蛋白5g/L、抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液0.5g/L和叠氮钠0.05g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度。
上述抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液是通过以下方法进行制备：
S1)取3mL羧基化胶乳微球溶液，用磷酸盐缓冲液稀释至6mL；羧基化胶乳微球为聚苯乙烯胶乳微球，羧基化微球的粒径为80nm，羧基化胶乳微球溶液中羧基化胶乳微球的质量百分数为5％；
S2)加入5mL 2.5g/L N-羟基丁二酰亚胺和5mL 1.5g/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基化胶乳微球，搅拌均匀后37℃孵育20min；
S3)再加入3mL磷酸盐缓冲液，室温下搅拌10min；
S4)加入抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体后，37℃孵育4h；抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体与羧基化胶乳微球的质量比为0.2：1，抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体为抗人胃蛋白酶原Ⅱ(小鼠)单克隆抗体；
S5)加入3mL终止液终止反应，室温下搅拌3h后4℃保存备用；所述终止液是含有质量体积浓度为20％BSA的磷酸盐缓冲液。
实施例4
本实施例提供一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，包含试剂R1和试剂R2；试剂R1由以下浓度的组分构成：MES-NaOH缓冲液140mmoL/L、司盘405g/L、聚乙二醇12000 20g/L和硫柳汞2g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；试剂R2由以下浓度的组分构成：MES-NaOH缓冲液80mmoL/L、葡萄糖120g/L、卵清蛋白30g/L、抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液2g/L和硫柳汞2g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度。
上述抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液是通过以下方法进行制备：
S1)取3mL羧基化胶乳微球溶液，用磷酸盐缓冲液稀释至6mL；羧基化胶乳微球为聚苯乙烯胶乳微球，羧基化微球的粒径为200nm，羧基化胶乳微球溶液中羧基化胶乳微球的质量百分数为5％；
S2)加入5mL 2.5g/L N-羟基丁二酰亚胺和5mL 1.5g/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基化胶乳微球，搅拌均匀后37℃孵育20min；
S3)再加入3mL磷酸盐缓冲液，室温下搅拌10min；
S4)加入抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体后，37℃孵育4h；抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体与羧基化胶乳微球的质量比为0.2：1，抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体为抗人胃蛋白酶原Ⅱ(小鼠)单克隆抗体；
S5)加入3mL终止液终止反应，室温下搅拌3h后4℃保存备用；所述终止液是含有质量体积浓度为20％BSA的磷酸盐缓冲液。
实施例5
本实施例提供一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，包含试剂R1和试剂R2；试剂R1由以下浓度的组分构成：缓冲液200mmoL/L、表面活性剂4g/L、促凝剂13g/L、防腐剂2g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；试剂R2由以下浓度的组分构成：缓冲液140mmoL/L、稳定剂100g/L、封闭剂20g/L、抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液3g/L、防腐剂1g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度；
在试剂R1中，缓冲液为MES-NaOH缓冲液和甘氨酸-NaOH缓冲液的混合液，表面活性剂为曲拉通X-100和吐温20的混合物，促凝剂为聚乙二醇6000和聚乙二醇8000的混合物，防腐剂为叠氮钠和Proclin-300的混合物；
在试剂R2中，缓冲液为MES-NaOH缓冲液和甘氨酸-NaOH缓冲液的混合液，稳定剂为海藻糖和葡萄糖的混合物，封闭剂为小牛血清白蛋白，防腐剂为叠氮钠和Proclin-300的混合物。
上述抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液是通过以下方法进行制备：
S1)取3mL羧基化胶乳微球溶液，用磷酸盐缓冲液稀释至6mL；羧基化胶乳微球为聚苯乙烯胶乳微球，羧基化微球的粒径为80nm，羧基化胶乳微球溶液中羧基化胶乳微球的质量百分数为5％；
S2)加入5mL 2.5g/L N-羟基丁二酰亚胺和5mL 1.5g/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基化胶乳微球，搅拌均匀后37℃孵育20min；
S3)再加入3mL磷酸盐缓冲液，室温下搅拌10min；
S4)加入抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体后，37℃孵育4h；抗人类胃蛋白酶原Ⅱ抗体与羧基化胶乳微球的质量比为0.2：1，抗人类胃蛋白酶原Ⅱ抗体为抗人类胃蛋白酶原Ⅱ(小鼠)单克隆抗体；
S5)加入3mL终止液终止反应，室温下搅拌3h后4℃保存备用；所述终止液是含有质量体积浓度为20％BSA的磷酸盐缓冲液。
对比例1
本对比例提供一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，包含试剂R1和试剂R2；试剂R1由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、Tris-HCl缓冲液50mmol/L、曲拉通X-100 1g/L、聚乙二醇6000 8g/L和Proclinc 300 0.5g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；试剂R2由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、小牛血清白蛋白20g/L、抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液1.5g/L和Proclinc-300 0.5g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度。
上述抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液是通过以下方法进行制备：
S1)取3mL羧基化胶乳微球溶液，用磷酸盐缓冲液稀释至6mL；羧基化胶乳微球为聚苯乙烯胶乳微球，羧基化微球的粒径为145nm，羧基化胶乳微球溶液中羧基化胶乳微球的质量百分数为5％；
S2)加入5mL 2.5g/L N-羟基丁二酰亚胺和5mL 1.5g/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基化胶乳微球，搅拌均匀后37℃孵育20min；
S3)再加入3mL磷酸盐缓冲液，室温下搅拌10min；
S4)加入抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体后，37℃孵育4h；抗人类胃蛋白酶原Ⅱ抗体与羧基化胶乳微球的质量比为0.2：1，抗人类胃蛋白酶原Ⅱ抗体为抗人类胃蛋白酶原Ⅱ(小鼠)单克隆抗体；
S5)加入3mL终止液终止反应，室温下搅拌3h后4℃保存备用；所述终止液是含有质量体积浓度为20％BSA的磷酸盐缓冲液。
试剂盒的准确度分析
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪；
检测样本：40例随机血清样本和一份PGⅡ血清样本(靶值为35.00ng/mL)；
市场试剂盒：国家食品药品监督管理局已批准上市的某厂家胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)检测试剂盒(胶乳免疫比浊法)(包括试剂R1和试剂R2，但成分与本发明不同，以下简称为市场试剂盒)；
采用实施例1、2的试剂盒和市场试剂盒按各自的检测方法分别同时定标后同时测定40例血清样品和1份PGⅡ血清样本，结果如表1和表2所示。
表1不同检测试剂测定40例随机血清样品的结果(单位：ng/mL)
表2 PGⅡ血清样本检测结果(单位：ng/mL)
如表1和表2所示，采用本发明实施例1和2试剂盒进行检测，根据检测结果，计算出的R2值分别为0.9989、0.9975，计算出的相对偏差分别为0.23、0.84；这表明本发明检测试剂盒测定时线性关系良好，具有较高准确度(符合度)，相对偏差低于市场试剂盒，且实施例1试剂盒的检测效果更好。
试剂盒的灵敏度分析
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪；
检测样本：1份纯化水、1份浓度为3.52ng/mL的PGⅡ低值样本；
采用实施例1试剂盒和市场试剂盒同时定标同时对每份待测样本重复检测20次，记录吸光度数值，计算平均值和标准偏差(SD)；水的吸光度平均值加上2SD作为最低检出限对应的吸光度值，由于吸光度与浓度的关系基本为线性关系，可以通过和3.52ng/mL样本的吸光度平均值比较计算出最低检测限的浓度，即灵敏度；检测结果见表3，其中，灵敏度＝(水吸光度差值平均值+2SD)×样本浓度/样本吸光度差值平均值。
表3灵敏度分析结果(单位：ng/mL)
如表3所示，本发明实施例试剂盒1的灵敏度为0.036ng/mL，市场试剂盒的灵敏度为0.085ng/mL；这表明本发明试剂盒具有较高的灵敏度。
试剂盒的精密度分析
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪；
检测样本：1份临床血清样本(20.36ng/mL，低值样本)、1份PGⅡ血清样本(65.95ng/mL，高值样本)；
采用实施例1试剂盒和市场试剂盒对每份待测样本重复检测10次，检测结果见表4。
表4精密度分析结果(单位：ng/mL)
如表4所示，实施例1试剂盒检测结果的精密度：低值样本时的CV为0.64，高值样本时的CV为2.16，均小于等于10％；另外，与市场试剂盒相比，低值样本的CV相对偏差为-3.0％，高值样本CV的相对偏差为-2.3％，实施例1试剂盒具有较高的精密度。
线性分析
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪；
检测样本：高PGⅡ血清样本(70ng/mL)；
将高PGⅡ血清样本(70ng/mL)用校准品稀释液稀释成6个不同浓度，分别为0ng/mL、14.0ng/mL、28.0ng/mL、42.0ng/mL、56.0ng/mL、70.0ng/mL，采用实施例1试剂盒对上述样品的每个浓度进行检测，每个浓度检测三次，计算相关系数R2值，结果见表5。
表5线性分析结果(单位：ng/mL)
如表5所示，根据检测结果得到的回归方程为y＝0.9920x+0.2251，相关系数R2为0.9982，表明实施例1试剂盒在0～70ng/mL范围内具有良好的线性度。
稳定性分析
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪；
检测样本：40例随机血清样本；
对本发明实施例1、2和对照例1的试剂盒检进行37℃加速破坏性实验，以考察其组分的稳定性，结果如表6所示。
表6稳定性检测结果(单位：ng/mL)
如表6所示，未加速时，实施例1和2、对照例1的40例样品检测结果平均值分别为40.64、40.67、40.46ng/mL，三者检测结果基本相当；经37℃加速破坏性实验1周后，实施例1和2、对照例1的40例样品检测结果平均值分别为39.19、31.20、22.86ng/mL；由此可得出，1)对比例1试剂盒经破坏性实验1周后，样品检测结果均显著下降，平均下降幅度达到了43.50％；2)由于实施例2试剂盒含有一定量的稳定剂海藻糖，经破坏性实验1周后，样品检测结果平均下降幅度为23.28％，较对比例1试剂盒有所改善，但稳定效果仍不理想；3)实施例1试剂盒含有一定量的稳定剂甘油，经破坏性实验1周，样品检测结果并未发生明显变化，平均下降幅度仅为3.57％，属于合理范围。以上结果表明，本发明实施例1和实施例2的试剂盒严格限定各种组分种类和含量，具有较好的稳定性，尤其是实施例1中添加甘油的试剂盒。
以上准确度分析、灵敏度分析、精确度分析、线性分析和稳定分析时，采用本发明实施例1或实施例2中试剂盒进行测定，本发明其他试剂盒也可以取得类似于实施例1和实施例2试剂盒的技术效果：线性关系良好，较高的准确度、灵敏度和精密度，稳定性较好。
甘油的用量考察
实施例6
本实施例提供一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，其与实施例1类似，区别点在于：试剂R2中甘油的浓度为10g/L。
实施例7
本实施例提供一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，其与实施例1类似，区别点在于：试剂R2中甘油的浓度为40g/L。
实施例8
本实施例提供一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，其与实施例1类似，区别点在于：试剂R2中甘油的浓度为100g/L。
实施例9
本实施例提供一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，其与实施例1类似，区别点在于：试剂R2中甘油的浓度为120g/L。
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪；
检测样本：10例不同随机临床血清样本；
为考察保护剂甘油在试剂中的用量，分别采用实施例1、实施例6～9和对比例1的试剂盒在未加速和37℃加速1周时检测样本血清PGⅡ浓度，结果如表7所示。
表7样本血清的浓度(单位：ng/mL)
如表7所示，对比例1试剂盒用于检测时，加速处理后样本浓度明显下降，比例达到了45.82％；相对应，当试剂R2中加入的甘油浓度为10g/L、40g/L、80g/L、100g/L、120g/L时，加速处理后样本浓度下降比例分别为：33.14％、15.01％、1.00％、1.03％、1.05％；由此说明，甘油在试剂中的加样量为0～120g/L时能起到一定的稳定作用，但加样量小于80g/L时，稳定效果不是很理想；当甘油的加样量为100～120g/L时，稳定效果已达到饱和；甘油加入量为80g/L时，既能达到较好的稳定作用又能减少甘油用量。
综上所述：本发明用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，采用化学偶联法将特异性抗体结合于单一粒径的胶乳微球颗粒表面，标本与胶乳试剂在缓冲液中混合，标本中的PGⅡ与胶乳微球颗粒表面的抗体结合，与相邻的胶乳微球颗粒彼此交联，通过特定的制备方法和优化反应体系显著提高了测定试剂的灵敏度和稳定性，具有灵敏度高、精密度高、试剂稳定等特点。
最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种用于检测胃蛋白酶原Ⅱ的试剂盒，其特征在于，包含试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包含以下浓度的组分：缓冲液10～200mmoL/L、表面活性剂0.01～5g/L、促凝剂5～20g/L、防腐剂0.05～2g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；所述试剂R2包含以下浓度的组分：缓冲液80～160mmoL/L、稳定剂10～120g/L、封闭剂5～30g/L、抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液0.5～3.0g/L、防腐剂0.05～2g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度；所述稳定剂至少为甘油、蔗糖、海藻糖和葡萄糖中的一种。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为甘油。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，在试剂R1中，所述缓冲液至少为MES-NaOH缓冲液、MOPS-NaOH缓冲液、HEPPS-NaOH缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液中的一种，所述表面活性剂至少为曲拉通X-100、吐温20、司盘40中的一种，所述促凝剂至少为聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇12000中的一种，所述防腐剂至少为叠氮钠、Proclin-300、硫柳汞中的一种；
在试剂R2中，所述缓冲液至少为MES-NaOH缓冲液、MOPS-NaOH缓冲液、HEPPS-NaOH缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液中的一种，所述封闭剂至少为小牛血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白中的一种，所述防腐剂至少为叠氮钠、Proclin-300、硫柳汞中的一种。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，在试剂R1中，所述缓冲液至少为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的一种，所述表面活性剂为曲拉通X-100，所述促凝剂为聚乙二醇6000，所述防腐剂为Proclin-300；
在试剂R2中，所述缓冲液至少为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的一种，所述封闭剂为小牛血清白蛋白，所述防腐剂为Proclin-300。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液是由羧基化胶乳微球进行制备，所述羧基化胶乳微球的粒径是相同的，羧基化胶乳微球的粒径为80～200nm。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液是通过以下方法进行制备：
S1)取羧基化胶乳微球溶液，用磷酸盐缓冲液稀释；羧基化胶乳微球为聚苯乙烯胶乳微球；
S2)加入N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基化胶乳微球，搅拌均匀后孵育；
S3)再加入磷酸盐缓冲液，室温下搅拌；
S4)加入抗人胃蛋白酶原II抗体后，进行孵育；抗人胃蛋白酶原II抗体与羧基化胶乳微球的质量比为0.2：1；
S5)加入终止液终止反应，室温下搅拌后保存备用；所述终止液是含有质量体积浓度为20％BSA的磷酸盐缓冲液。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，羧基化胶乳微球的粒径为145nm，羧基化胶乳微球溶液中羧基化胶乳微球的质量百分数为5％。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、Tris-HCl缓冲液50mmoL/L、曲拉通X-100 1g/L、聚乙二醇6000 8g/L和Proclinc 300 0.5g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；所述R2由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、甘油80g/L、小牛血清白蛋白20g/L、抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液1.5g/L和Proclinc-300 0.5g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度。
9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、Tris-HCl缓冲液50mmol/L、曲拉通X-100 1g/L、聚乙二醇6000 8g/L和Proclinc 300 0.5g/L，试剂R1中组分浓度为组分在试剂R1中最终浓度；所述R2由以下浓度的组分构成：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、海藻糖80g/L、小牛血清白蛋白20g/L、抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体胶乳溶液1.5g/L和Proclinc-300 0.5g/L，试剂R2中组分浓度为组分在试剂R2中最终浓度。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109490533A (zh) * 2018-12-29 2019-03-19 南京澳林生物科技有限公司 一种胃蛋白酶原ⅱ(pgⅱ)检测试剂盒及生产工艺
CN109975545A (zh) * 2019-03-22 2019-07-05 芜湖森爱驰生物科技有限公司 一种高准确性胃蛋白酶原ⅱ检测试剂盒
CN111272991A (zh) * 2020-01-21 2020-06-12 苏州德沃生物技术有限公司 抗原稳定剂
CN111896748A (zh) * 2020-08-05 2020-11-06 广州市伊川生物科技有限公司 一种抗链球菌溶血素o测定试剂盒
CN112051401A (zh) * 2020-08-28 2020-12-08 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种胃蛋白酶原的测定试剂盒
CN112198319A (zh) * 2020-10-23 2021-01-08 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 一种稳定性增强的人免疫球蛋白g4试剂盒
CN112285359A (zh) * 2020-09-22 2021-01-29 广州市伊川生物科技有限公司 一种涎液化糖链抗原测定试剂盒及其检测方法
CN114736948A (zh) * 2022-06-10 2022-07-12 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104111335A (zh) * 2013-11-13 2014-10-22 唐勇 胃蛋白酶原i／ii胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒
CN104655843A (zh) * 2014-05-19 2015-05-27 宁波普瑞柏生物技术有限公司 一种胃癌检测方法、试剂以及其试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104111335A (zh) * 2013-11-13 2014-10-22 唐勇 胃蛋白酶原i／ii胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒
CN104655843A (zh) * 2014-05-19 2015-05-27 宁波普瑞柏生物技术有限公司 一种胃癌检测方法、试剂以及其试剂盒

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109490533A (zh) * 2018-12-29 2019-03-19 南京澳林生物科技有限公司 一种胃蛋白酶原ⅱ(pgⅱ)检测试剂盒及生产工艺
CN109975545A (zh) * 2019-03-22 2019-07-05 芜湖森爱驰生物科技有限公司 一种高准确性胃蛋白酶原ⅱ检测试剂盒
CN111272991A (zh) * 2020-01-21 2020-06-12 苏州德沃生物技术有限公司 抗原稳定剂
CN111896748A (zh) * 2020-08-05 2020-11-06 广州市伊川生物科技有限公司 一种抗链球菌溶血素o测定试剂盒
CN112051401A (zh) * 2020-08-28 2020-12-08 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种胃蛋白酶原的测定试剂盒
CN112285359A (zh) * 2020-09-22 2021-01-29 广州市伊川生物科技有限公司 一种涎液化糖链抗原测定试剂盒及其检测方法
CN112198319A (zh) * 2020-10-23 2021-01-08 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 一种稳定性增强的人免疫球蛋白g4试剂盒
CN114736948A (zh) * 2022-06-10 2022-07-12 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒
CN114736948B (zh) * 2022-06-10 2022-11-08 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种α2-抗纤溶酶活性测定试剂盒

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