CN112051401A - 一种胃蛋白酶原的测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明阐述了一种胃蛋白酶原的测定试剂盒,包括独立包装的试剂R1和试剂R2;试剂R1包含以下浓度的组分:缓冲液30‑100mmol/L、离子分散剂;试剂R2包含以下浓度的组分:缓冲液30‑100mmol/L、葡萄糖20g/L、乙二醇20g/L、牛血清白蛋白0.05‑2g/L和抗体乳胶悬浮液2‑15mg/L;离子分散剂中的离子浓度为0.15~0.4mmol/L;离子分散剂包含有镁离子、锌离子和钙离子。本发明在实施过程中在试剂R1中加入离子分散剂,离子分散剂中包含有镁离子、锌离子和钙离子,提高了试剂盒的稳定性和精密性,提高了试剂盒的稳定性和精密性。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种胃蛋白酶原的测定试剂盒。
背景技术
现有技术中,胃蛋白酶原的检测方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)和胶乳免疫比浊法等。其中,酶联免疫吸附测定检测准确度高,但操作过程略显复杂、测定时间较长、影响因素多,且不适合急诊样本的检测;化学发光免疫分析法测定其自动化操作速度快、准确度高,但是成本高、设备昂贵、稳定性较差,无法普及中基层医院及医疗机构;胶乳免疫比浊法测定中,其检测快速、精准、准确度高、特异性强、精密度好、成本较低,且检测样本量少,可进行少量样本和急诊样本的测定。但是,现有的胃蛋白酶原检测试剂盒的稳定性不高,且其往往仅能够检测一种酶原,具有一定的局限性。
发明内容
本发明提供了一种准确度、精密度和稳定性更佳的胃蛋白酶原检测试剂盒。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
本发明的一方面,提供一种胃蛋白酶原的测定试剂盒,包括独立包装的试剂R1和试剂R2;
所述试剂R1包含以下浓度的组分:
缓冲液30-100mmol/L;
离子分散剂;
所述试剂R2包含以下浓度的组分:
缓冲液30-100mmol/L;
牛血清白蛋白0.05-2g/L;
抗体乳胶2-15mg/L;
其中,所述离子分散剂中的离子浓度为0.15~0.4mmol/L;所述离子分散剂包含有镁离子、锌离子和钙离子。
具体的,所述镁离子、锌离子和钙离子的浓度为0.05~0.1mmol/L。
进一步的,所述离子分散剂还包含有亚铁离子和铜离子。所述亚铁离子和铜离子的浓度为0.01~0.05mmol/L。
进一步的,所述R2试剂中还包括葡萄糖10~20g/L、乙二醇10~20g/L。
具体的,所述缓冲液为Tris或HEPES。
进一步的,所述R1试剂还包括0.01-2g/L的表面活性剂;所述表面活性剂选自Tritox-100、Emulgen A90、Emulgen A60、GENAPOLX-080,吐温-20和吐温-80中的一种。
进一步的,所述R2试剂还包括防腐剂0.05-1g/L。
本发明的另一方面,提供一种抗体乳胶的悬浮液制备方法包括以下步骤:
(1)用缓冲液复溶胶乳颗粒,超声分散,得到混合均匀的胶乳溶液,活化;
(2)活化后的胶乳溶液中,添加鼠抗人胃蛋白酶原Ⅰ抗体和鼠抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体,并充分混合,37℃,搅拌,连接反应2h;
(3)封闭,离心,复溶,即所述抗体乳胶悬浮液。
具体的,在步骤(1)中的缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
本发明在实施过程中在试剂R1中添加适量的离子分散剂,离子分散剂中包含有镁离子、锌离子和钙离子,提高了试剂盒的稳定性和精密性;本发明在实施过程中在试剂R2中加入葡萄糖和乙二醇配合使用作为稳定剂,可以提高精密度和特异性。
本发明的胃蛋白酶原检测试剂盒,可在具备有400-800nm波长的全自动生化分析仪上同时检测血液中胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原Ⅱ的含量,快速精准,大大提高工作效率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
胃蛋白酶原试剂盒
本发明的目的在于提供一种检测胃蛋白酶原Ⅰ或胃蛋白酶原Ⅱ的测定试剂盒,通过特定的制备方法和优化反应体系显著提高了测定试剂的精密度和稳定性,具有精密度高、精密度高、线性、较宽试剂稳定等优点。
本发明采用化学偶联法将特异性抗体结合于单一粒径的胶乳颗粒表面,通过在试剂的制备过程中添加离子分散剂来优化反应体系,可获得稳定的胶乳试剂,标本与胶乳试剂在缓冲液中混合,待测样本中的胃蛋白酶原Ⅰ或胃蛋白酶原Ⅱ与胶乳颗粒表面的抗体结合,与相邻的胶乳颗粒彼此交联,同时兼顾了检测精密度和线性范围,显著提高了测定试剂的精密度和稳定性,可适用于各类全自动生化分析仪进行分析,该试剂稳定的同时其检测时间短、精密度高、特异性强、精密度好、成本较低,可以同时实现对胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ的准确检测。
在本发明在试剂R1中添加适量的离子分散剂,分别作为蛋白质凝固剂,在促进生化免疫抗原抗体凝集反应中起到重要作用,体现在可以优化抗原抗体形成复合物,可以提高精密度和准确度;还在试剂R2中加入葡萄糖和乙二醇配合使用作为稳定剂时,可以提高样本检测的稳定性。
具体的,本发明提供一种胃蛋白酶原的测定试剂盒,包括独立包装的试剂R1和试剂R2;
所述试剂R1包含以下浓度的组分:
缓冲液30-100mmol/L;
离子分散剂;
所述试剂R2包含以下浓度的组分:
缓冲液30-100mmol/L;
牛血清白蛋白0.05-2g/L;
抗体乳胶悬浮液2-15mg/L;
其中,所述离子分散剂中的离子浓度为0.15~0.4mmol/L;所述离子分散剂包含有镁离子、锌离子和钙离子。
优选的,离子分散剂包含有镁离子、锌离子和钙离子,具体的可添加氯化镁、氯化锌和氯化钙,且镁离子、锌离子和钙离子的浓度为0.05~0.1mmol/L。更进一步的,离子分散剂还包含有亚铁离子和铜离子,亚铁离子和铜离子的浓度为0.01~0.05mmol/L。
具体的,缓冲液为Tris或HEPES。
进一步的,R2试剂还包含有葡萄糖10~20g/L、乙二醇10~20g/L。
具体的,R1试剂还包括0.01-2g/L的表面活性剂;所述表面活性剂选自Tritox-100、Emulgen A90、Emulgen A60、GENAPOLX-080,吐温-20和吐温-80中的一种。
进一步的,R2试剂还包括防腐剂0.05-1g/L。
抗体乳胶悬浮液的制备方法具体包括以下步骤:
(1)用缓冲液复溶胶乳颗粒,超声分散,得到混合均匀的胶乳溶液,活化;具体采用的胶乳颗粒粒径为150nm,可以用缓冲液反复复溶多次,每次间隔用15000rpm离心40min以得到胶乳颗粒。超声分散的条件为超声波破碎功率50Hz、时间5min、间隔30S。
(2)活化后的胶乳溶液中,添加鼠抗人胃蛋白酶原Ⅰ抗体和鼠抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体,并充分混合,37℃,200rpm,连接反应2h;活化剂可采用NHS和EDC。
(3)用含20%BSA的HEPES溶液封闭,离心,用HEPES溶液复溶,即所述抗体乳胶悬浮液。
具体的,步骤(1)中的缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液,经复溶、分散后得到胶乳溶液pH值为8.6~8.8。
对于本发明提供的胃蛋白酶原的测定试剂盒,其具体组成和配比可见表1。另外,表1中还列举了抗体乳胶悬浮液制备过程步骤(1)中的缓冲液,巴比妥钠-盐酸缓冲液作为对比。
表1
对胃蛋白酶原的检测评价
胃蛋白酶原的测定原理:样品中的胃蛋白酶原Ⅰ或胃蛋白酶原Ⅱ和被乳状液粒吸附的抗体引起抗原抗体反应,形成免疫复合物,在700nm波长处检测其浊度的变化,其变化程度与样本中的胃蛋白酶原Ⅰ或胃蛋白酶原Ⅱ含量成正比;试剂盒所涉及的试剂组分或仪器均为常规市售产品,或可通过本领域的常规技术手段获得。
为便于评价各实施例和对比例的精密度、准确性和稳定性,进行以下试验。
1、材料、仪器与方法
本发明所提供的所有试剂均来源与
实验仪器:HITACHI7180/7100
实验参数:
方法:终点法;温度:37℃;检测波长:700nm;
样本量:6μL,R1:162μL,R2:30μL;反应方向:正向;
反应时间:10min;定标方式:多点定标。
开瓶性能评价方法:
分别对以上实施例和对比例进行如下检测:
(1)准确度:测第三方质控品(朗道生化标准品,包括不同浓度的PGI和PGII);具体的,表2中的,对于第三方指控品分别采用实施例1-10和对比例1-4对应的试剂盒,按照胃蛋白酶原的检测方法,分别计算出每一种试剂盒测定的胃蛋白酶原I(PGI)浓度和胃蛋白酶原II(PGII)的浓度,通过与其对应的吸光值制作酶原标准曲线,并分别计算PGI和PGII的测定平均值与靶值的偏差,再将二者的偏差平均值作为每一种实施例或对比例对应的试剂盒的准确度。
(2)精密度:共测定8个临床样本,采用实施例1-10和对比例1-4对应的试剂盒分别重复测定同一待测样本10次,根据PGI和PGII各自对应的标准曲线,计算同一待测样本中PGI和PGII各自对应的偏差,二者的偏差平均值作为每一种实施例或对比例对应的试剂盒的精密度。
(3)浊度:利用浊度检测实施例1-10和对比例1-4对应的试剂盒反应体系的浊度。
(4)反应过程中的凝集状态:用于光镜观察实施例1-10和对比例1-4对应的试剂盒体系反应过程中的凝集状态。
(5)稳定性:将试剂在37度放置7天,再评价以上指标:精密度、准确度和抗凝状态。
胃蛋白酶原的检测方法,包括如下步骤:分离血清样品,向血清样品中加入试剂R1,混匀,孵育5min后,加入R2混匀孵育30s后,于700nm波长下检测吸光度值A1,4.5min后,于700nm波长下检测吸光度值A2,计算ΔA=A2-A1。全自动生化分析仪通过血清标准品定标数据计算胃蛋白酶原I或胃蛋白酶原II的含量。不同浓度标准品的组分为:S1:20.0ng/mLPGI+5.0ng/mL PGII,S2:70.0ng/mL PGI+15.0ng/mL PGII,S3:130.0ng/mL PGI+30.0ng/mL,S4:190.0ng/mL PGI+60.0ng/mL PGII,S5:250.0ng/mL PGI+100.0ng/mL PGII。具体的,需要分别将胃蛋白酶原I的标准品和胃蛋白酶原Ⅱ校准品对应的浓度梯度标准品混合后作为标准待测样本,通过本发明提供的试剂盒检测以制作标准曲线,如S1对应的标准待测样本为20.0ng/mL的胃蛋白酶原Ⅱ和5.0ng/mL的胃蛋白酶原Ⅱ的混合物。
具体的,为评价检测过程中的R1试剂中的离子分散剂对于检测过程中的反应体系的抗凝效果,还将反应体系置于光镜下观察凝集状态,并通过浊度仪比较其浊度。具体,采用上述实施例、对比例的各自试剂盒,分别单独检测10个不同的待测样本。另外,将实施例、对比例的试剂盒的分别经过37℃处理7天,采用相同的方法对8个待测样本进行检测,验证其稳定性。
2、实验结果和讨论
表2同时测定PGI和PGII的准确度
由表2可知:
1)相对于对比例1、2和3,实施例1、2在R1中添加了离子分散剂,而使得其同时检测PGI和PGII的绝对平均偏差显著升高,具体将至5%以内,符合检验的标准。这说明,在R1试剂中添加离子分散剂有助于降低检测偏差。
2)对比例1相对于实施例1,其抗体乳胶的缓冲液(1)使用了巴比妥钠-盐酸缓冲液,其其同时检测PGI和PGII的绝对平均偏差显著升高。这表明,对比例1的R1试剂中即使添加了离子分散剂,但是由于其抗体乳胶的缓冲液(1)未限定,使得其抗体偶联过程中产生了变化,导致其检测误差显著增加。
3)比较实施例1、2和3,实施例3在实施例1、2的基础上,R1中增加了表面活性剂,其同时检测PGI和PGII的绝对平均偏差略有减低。
4)实施例4、5在实施例3的基础上,R1试剂中增加了铁离子和铜离子,进一步显著降低其同时检测PGI和PGII的绝对平均偏差,这说明在R1在中添加镁离子、锌离子、钙离子、铁离子和铜离子,能够进一步改善检测的精密度。
5)实施例6在实施例3的基础上,在R2试剂中添加了葡萄糖和乙二醇,其进一步显著降低其同时检测PGI和PGII的绝对平均偏差。这说明在R2在中添加葡萄糖和乙二醇,能够进一步改善检测的精密度。
6)实施例7、8在实施例6基础上,在R1试剂中添加了铁离子和铜离子,进一步显著降低其同时检测PGI和PGII的绝对平均偏差,绝对平均偏差甚至达到1%以内。
7)实施例9、10相对于实施例8,变换了表面活性剂的种类,葡萄糖的浓度和乙二醇的浓度,其同时检测PGI和PGII的绝对平均偏差无明显变化。
表3实施例1-10、对比例1-4试剂盒评价结果汇总表
表3中,++表示反应体系有肉眼可见的凝集,+++表示反应体系凝集较严重,++++表示反应体系凝集非常严重,-表示反应体系无肉眼可见的凝集。
由表3可知:
1)相对于对比例1、2和3,实施例1、2在R1中添加了离子分散剂,其凝集状态变成肉眼不可见,浊度也显著降低,这说明,添加离子分散剂有助于缓解其试剂的凝集,对反应体系有分散作用。而对比实施例1、2和对比例1在热破前后的凝集状态和浊度,可发现,对比例的凝集状态变差,浊度也显著升高,而实施例1、2浊度虽有升高,但无明显凝集。对比例4即使其添加了离子分散剂,而由于其抗体胶乳的制备过程中使用的缓冲液无在本发明限定的范围内,使得其浊度显著升高,凝集现象严重,这说明在抗体胶乳制备过程中其抗体结合不牢固,在后期检测时出现偶联体解散,进而出现凝集现象。
2)实施例3在实施例1、2的基础上,R1中增加了表面活性剂,其精密度虽有降低,但其准确性有降低,其热稳定性有所提升。实施例4、5相对实施例3,其精密度提高,其热稳定性有所提升。
3)实施例1-10的浊度、精密度、和准确度在热处理前后的变化显著低于对比例,这说明本发明提供的胃蛋白酶原的检测试剂盒的的热稳定性显著提升。
综上所述,与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1、本发明公开的试剂盒可用于检测两种胃蛋白酶原,解决了试剂盒检测单一组分的局限定,扩大了应用范围,更有利于在生产过程中的推广。
2、本发明的试剂盒在试剂R1中添加适量的离子分散剂,其作为蛋白质抗凝剂,能够促进反应体系分散均匀,减少其在检测过程中发生的蛋白凝集和偶联体的分解,在促进胃蛋白酶原与抗体的免疫结合过程中起到重要作用,可以提高精密度和准确度。另外,在抗体乳胶的制备过程中,选择甘氨酸-氢氧化钠能够提高其制备过程中的稳定性,使得抗体能够稳定偶联至乳胶颗粒上,防止其在制备过程或胃蛋白酶原的检测过程中出现凝集。
3、本发明在实施过程中在试剂R2中加入葡萄糖和乙二醇配合使用作为稳定剂,提高了试剂盒的稳定性和精密性。
4、本发明的胃蛋白酶原检测试剂盒及其检测方法,可在具备有400-800nm波长的全自动生化分析仪上同时检测血液中胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原Ⅱ的含量,直接上机使用,快速精准,大大提高工作效率。
以上所述本发明的具体实施方式,并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形,均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.一种胃蛋白酶原的测定试剂盒,其特征在于,包括独立包装的试剂R1和试剂R2;
所述试剂R1包含以下浓度的组分:
缓冲液30-100mmol/L;
离子分散剂;
所述试剂R2包含以下浓度的组分:
缓冲液30-100mmol/L;
牛血清白蛋白0.05-2g/L;
抗体乳胶2-15mg/L;
其中,所述离子分散剂中的离子浓度为0.15~0.4mmol/L;所述离子分散剂包含有镁离子、锌离子和钙离子。
2.如权利要求1所述的胃蛋白酶原的测定试剂盒,其特征在于,所述镁离子、锌离子和钙离子的浓度为0.05~0.1mmol/L。
3.如权利要求1所述的胃蛋白酶原的测定试剂盒,其特征在于,所述离子分散剂还包含有亚铁离子和铜离子,所述亚铁离子和铜离子的浓度为0.01~0.05mmol/L。
4.如权利要求1所述的胃蛋白酶原的测定试剂盒,其特征在于,所述R2试剂还包括葡萄糖10~20g/L、乙二醇10~20g/L。
5.如权利要求1所述的胃蛋白酶原的测定试剂盒,其特征在于,所述缓冲液为Tris或HEPES。
6.如权利要求1所述的胃蛋白酶原的测定试剂盒,其特征在于,所述R1试剂还包括0.01-2g/L的表面活性剂;所述表面活性剂选自Tritox-100、Emulgen A90、Emulgen A60、GENAPOLX-080,吐温-20和吐温-80中的一种。
7.如权利要求1所述的胃蛋白酶原的测定试剂盒,其特征在于,所述R2试剂还包括防腐剂0.05-1g/L。
8.一种权利要求1中所述的抗体乳胶的悬浮液制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)用缓冲液复溶胶乳颗粒,超声分散,得到混合均匀的胶乳溶液,活化;
(2)活化后的胶乳溶液中,添加鼠抗人胃蛋白酶原Ⅰ抗体和鼠抗人胃蛋白酶原Ⅱ抗体,并充分混合,37℃,搅拌,连接反应;
(3)封闭,离心,复溶,即所述抗体乳胶悬浮液。
9.如权利要求8所述的胃蛋白酶原的测定试剂盒,其特征在于,在步骤(1)中的缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
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