JP2000146967A - 感作金属コロイド試薬溶液の安定化方法及び該安定化試薬溶液 - Google Patents
感作金属コロイド試薬溶液の安定化方法及び該安定化試薬溶液Info
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Abstract
定に用いられる抗体等を感作した金属コロイド試薬を溶
液中で安定化する方法及び試薬として安定な金属コロイ
ド試薬含有溶液を提供する。それによって、感作金属コ
ロイド試薬溶液が長期間にわたりその試薬性能が保持さ
れ、使用期間の延長及び測定精度の向上に寄与すること
ができる。 【解決手段】 感作金属コロイド試薬溶液に、鉄イオ
ン、銅イオンおよび鉛イオンから選ばれる金属イオンと
キレ−ト剤からなる物質の1種または2種以上を配合し
て感作金属コロイド試薬溶液を安定化する。
Description
薬の溶液中での安定化に関する。さらに詳しくは、主と
して臨床検査の分野で、抗原抗体反応を利用した免疫学
的測定に用いられる抗体等を感作した感作金属コロイド
試薬溶液に鉄イオン、銅イオンおよび鉛イオンから選ば
れる金属イオンとキレート剤からなる物質を配合するこ
とを特徴とする感作金属コロイド試薬溶液の安定化法と
その安定化した感作金属コロイド試薬溶液に関する。
おいて金属コロイドが広く用いられている。例えば、抗
体を感作した金属コロイドを抗原と反応させて、抗原・
抗体−金属コロイド複合体を形成させ、この複合体を抗
体が固定化された判定紙(膜)上で泳動させると、固定
化された抗体に複合体が捕捉され、その結果、金属コロ
イドによる着色が生じる。この着色を判定することによ
り抗原の有無を調べるイムノクロマトグラフィ法があ
る。また、溶液中で抗体感作金コロイドと抗原を反応さ
せると、金コロイドが凝集することによって、色調が変
化する。この色調を吸光度変化として捉え測定すること
により抗原の有無または量を調べるという凝集比色法が
ある。これらの測定方法においては、測定対象に特異的
に結合する物質が金属コロイドに感作された感作金属コ
ロイドが利用され、金属コロイドとしては金コロイドが
用いられる場合が多い。
液の組成について、多くの報告がある。例えば、0.0
5%ポリエチレングリコ−ル(分子量約20000)/
PBS溶液(特開平9−5327号公報、実施例1)、
0.05Mリン酸ナトリウム−0.15M食塩−0.0
5%カ−ボワックス20M(pH7.2)(特開平2−
141665号公報、4頁、実施例3)、10mMHE
PES(pH7.1)、0.3MD−マンニト−ル、
0.05%ポリエチレングリコ−ル(分子量2000
0)、0.1%BSA(特開平8−278305号公
報、3頁右カラム、41−47行、実施例:金コロイド
標識抗ヒトヘモグロビンモノクロ−ナル抗体の調
製、)、20mMトリス緩衝液(pH8.2)、150
mM塩化ナトリウム、1%BSA(特公平7−4610
7号公報、10頁右カラム、42−43行、実施例
5)、0.1Mトリス緩衝液(pH7.6)、0.3%
BSA、0.25%ポリエチレングリコ−ル(600
0)、4%シュ−クロ−ス、0.1%アジ化ナトリウム
(特開平7−318560号公報、、7頁右カラム、1
1−15行、実施例)、10mMリン酸緩衝液(pH
6.4)、1%BSA、0.05%アジ化ナトリウム
(特開平6−94718号公報、5頁左カラム、9−1
3行、実施例1)等がある。また、PBS(リン酸緩衝
生理的食塩水)/1%BSA/0.02%アジ化ナトリ
ウムで懸濁し、4℃保存で4週間は反応の低下はなかっ
たとの報告もなされている(Biochem.Biop
hys.Res.Commun.Vol.121、N
o.1(1984)284頁−289頁、特に285
頁)。また、金コロイド免疫測定時にナトリウム、カリ
ウム、リチウム、マグネシウムの各塩を反応液中に存在
させる方法が開示されている(特開平9−5326号公
報)。しかし、この方法は、感作金コロイド試薬の安定
化ではなく、免疫反応の判定を容易にする目的のもので
ある。さらに、感作する前の金属コロイドの凝集防止方
法として、無機イオンを含まず、かつ有機系である緩衝
剤(トリスヒドロキシメチルアミノメタン、N−トリス
ヒドロキシメチル−2−アミノメタンスルホン酸等)を
組成として用いる方法が開示されている(特開平9−7
0527号公報)。
後の金属コロイド懸濁溶液には、一般に緩衝剤、BS
A、ポリエチレングリコ−ル、塩化ナトリウムが添加さ
れるが、これらの物質が添加された感作金属コロイド試
薬溶液では経時的に反応性が低下し、長期間の使用が困
難である。したがって、臨床検査用試薬として、長期使
用に耐えられる安定な感作金属コロイド試薬が望まれ
る。本発明の目的は、溶液中での感作金属コロイド試薬
を安定化する方法、長期保存可能な感作金属コロイド試
薬溶液を提供することである。
で感作した金属コロイド試薬溶液に、鉄イオン、銅イオ
ンおよび鉛イオンから選ばれる金属イオンとキレ−ト剤
からなる物質の1種または2種以上を配合することによ
り、感作金属コロイド試薬溶液を安定化することがで
き、かかる安定な感作金属コロイド試薬溶液を用いるこ
とにより、感作金属コロイド試薬溶液の反応性を長期に
維持することができる。本発明の安定化した試薬溶液
は、公知の方法に従って、例えば、ヘモグロビンの測定
試薬として好適に使用される。
属コロイド試薬溶液における金属コロイドとしては、
金、銀、セレン等の金属のコロイドがあるが、金コロイ
ドが一般的に利用され易く、好ましい。金属コロイドを
感作するものとしては、臨床検査などで抗原抗体反応に
よって測定する場合に利用される各種の抗体や抗原が含
まれるが、それ以外のものでも、測定対象に特異的に結
合するものであれば利用可能である。
ン、銅イオンおよび鉛イオンから選ばれる金属イオンと
キレ−ト剤からなる物質はそれら金属イオンの塩とキレ
ート剤とを安定化すべき感作金属コロイド試薬溶液に添
加混合して調製してもよく、あるいは予め金属塩とキレ
ート剤とを反応させて得られる金属キレート化合物とし
て用いることもできる。鉄イオンにはFe2+、Fe3+、
銅イオンにはCu+、Cu2+、鉛イオンにはPb2+、P
b4+が含まれるが、いずれも使用し得る。これらの金属
塩としては塩化物や硫酸物としての物質が利用できる。
例えば、鉄イオンには塩化鉄や硫酸第一鉄、銅イオンに
は塩化銅や硫酸銅、鉛イオンには塩化鉛、硫酸鉛等の塩
がある。キレ−ト剤としてはエチレンジアミン四酢酸
(EDTA)、エチレングリコ−ルビス(β−アミノエ
チルエ−テル)−N,N,N’,N’−四酢酸(EGT
A)、トランス−1,2−ジアミノシクロヘキサン−
N,N,N’,N’−四酢酸(CyDTA)、ジアミノ
プロパノ−ル四酢酸(DPTA−OH)、ジエチレント
リアミン−N,N,N’,N”,N”−五酢酸(DTP
A)、エチレンジアミン二酢酸(EDDA)、エチレン
ジアミン二プロピオン酸(EDDP)、ヒドロキシエチ
ルエチレンジアミン三酢酸(EDTA−OH)、N,
N’−ビス(2−ヒドロキシベンジル)エチレンジアミ
ン−N,N’−二酢酸(HBED)、1,6−ヘキサメ
チレンジアミン−N,N,N’,N’−四酢酸(HDT
A)、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HIDA)、イ
ミノ二酢酸(IDA)、ジアミノプロパン四酢酸(Me
thyl−EDTA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、ニ
トリロ三プロピオン酸(NTP)、トリエチレンテトラ
ミン六酢酸(TTHA)等が挙げられる。キレ−ト剤と
してはEDTAが一般的に良く利用される。また、金属
キレ−ト化合物としては、エチレンジアミン四酢酸一ナ
トリウム鉄、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム銅、
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム鉛が市販されてお
り、これらを利用するのが好ましい。
ド試薬溶液中での濃度は、金属イオンやキレート剤の種
類により異なるが、通常0.0001〜2%(重量%、
以下同じ)の範囲から選ばれる。例えば、エチレンジア
ミン四酢酸一ナトリウム鉄(C10H12N2O8NaFe・
H2O)としては0.01−2%の範囲で用いられ、と
くに、0.1%付近が好ましい。エチレンジアミン四酢
酸二ナトリウム銅(C10H12N2O8Na2Cu・xH
2O)としては、0.0001−0.5%の範囲であ
り、とくに、0.01%付近が好ましい。エチレンジア
ミン四酢酸二ナトリウム鉛(C10H12N2O8Na2Pb
・2H2O)としては、0.0001−0.5%の範囲
であり、とくに、0.05%付近が好ましい。
中には、更に他の安定化剤としてカルシウムイオン、マ
グネシウムイオン、バリウムイオン、デキストラン硫
酸、コ−ル酸、デオキシコ−ル酸、キサンツレン酸から
選ばれる物質が適宜添加されてもよく、金属イオンおよ
びキレート剤からなる物質をこれら他の物質と組み合わ
せて用いるのが好ましい。また、感作金属コロイド試薬
溶液中には、従来用いられている緩衝剤、糖および糖ア
ルコ−ル、アルブミン、ポリエチレングリコ−ル、塩化
ナトリウム、防腐剤、その他の物質が適宜含まれる。
ム、硫酸カルシウム、酢酸カルシウム等の塩、マグネシ
ウムイオンとしては塩化マグネシウム、酢酸マグネシウ
ム、硫酸マグネシウム等の塩、バリウムイオンには塩化
バリウム、フッ化バリウム等の塩が含まれる。これらの
金属イオンは0.018−4.5mMの濃度範囲、好ま
しくは1mM付近の濃度が好ましい。デキストラン硫
酸、コ−ル酸、デオキシコ−ル酸、キサンツレン酸は遊
離酸としてまたはそれらの塩として用いられ、デキスト
ラン硫酸は0.0001−0.2%の濃度範囲、コ−ル
酸およびデオキシコ−ル酸は0.0001−0.5%の
濃度範囲、キサンツレン酸は0.005−0.1%の濃
度範囲が好ましい。
酸緩衝液、2−(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−
ピペラジニル)エタンスルフォン酸(HEPES)、
N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエ
タンスルフォン酸(BES)、2−モルフォリノエタン
スルフォン酸(MES)、N−トリス(ヒドロキシメチ
ル)メチル−2−アミノエタンスルフォン酸(TE
S)、3−(N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)ア
ミノ)−2−ヒドロキシプロパンスルフォン酸(DIP
SO)、2−ヒドロキシ−N−トリス(ヒドロキシメチ
ル)メチル−3−アミノプロパンスルフォン酸(TAP
SO)等のグッド緩衝液が挙げられ、pHは5−9が好
ましく、濃度は1−100mMが好ましい。
ス、マンノ−ス、サッカロ−ス、ラクト−ス、マルト−
ス、マンニト−ル、ソルビト−ル等が挙げられ、濃度と
しては0.01−10%が好ましい。アルブミンとして
は、ウシ血清アルブミン(BSA)が好ましく濃度とし
ては0.001−1%が好ましい。防腐剤としてはアジ
化ナトリウムが好ましく、濃度としては0.01−0.
5%が好ましい。その他の添加物質として、ツィ−ン2
0、ポリエチレングリコ−ル(分子量1,000−50
0,000)、ポリエチレングリコ−ルラウリルエ−テ
ル、5−ブロモサルチル酸、サリチル酸ナトリウム、安
息香酸ナトリウム、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、フ
ェノ−ル、チモ−ル等が挙げられる。
に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。実施例1 ヒトヘモグロビンをヘモプレ−トオ−トII〔(株)ア
ズウェル製ヒトヘモグロビン検出用試薬キット:抗ヘモ
グロビン抗体を感作した金コロイド試薬凍結乾燥品、そ
の溶解液および検体希釈液を含む〕の検体希釈液に溶解
して、ヘモグロビン濃度0,50,100および200
ng/mlの溶液を調製し、小分け分注し−40℃の冷
凍庫に凍結保存したものを融解し、検体として使用す
る。ヘモプレ−トオ−トIIの金コロイド試薬凍結乾燥
品(30ml用)を0.1%BSA、3%マンニト−
ル、0.01%塩化カルシウム、0.02%コ−ル酸ナ
トリウム、0.05%アジ化ナトリウムを含む5mMH
EPES緩衝液(pH7.5)29mlで溶解する(金
コロイド液:溶液組成1)。該金コロイド液9容と後記
表1の種々の添加物質を蒸留水に溶解した試料1容を混
合し、試験用金コロイド試薬溶液を調製し、以下のよう
にしてその反応性を試験した。なお、添加物質濃度は試
験用金コロイド試薬溶液中で何れも0.05%とした。
液の反応性は金コロイド凝集比色法により以下のように
測定した。マイクロプレ−トに検体25μl、検体希釈
液50μl、試験用金コロイド試薬溶液100μlを添
加後マイクロプレ−トを撹拌し、撹拌後約30秒後とそ
の6分後の吸光度(主波長540nm、副波長700n
m)をプレ−トリ−ダ−を用いて測定した。初期吸光度
と6分後の吸光度の差(変化)を検体(ヘモグロビン)
に対する金コロイド試薬の反応性の指標とした。試験用
金コロイド試薬溶液の調製当日と37℃にて5日および
10日保存後のものについて上記操作により検体を測定
し、調製当日の試験用金コロイド試薬溶液の反応性を1
00%として、37℃にて5日および10日保存後のも
のの残存反応率(%)を求めた。その結果を表1の溶液
組成1の欄に示す。
(30ml用)を0.1%BSA、3%マンニト−ル、
0.01%塩化カルシウム、0.025%キサンツレン
酸、0.05%アジ化ナトリウムを含む5mMTES緩
衝液(pH7.0)29mlで溶解する(金コロイド
液:溶液組成2)。該金コロイド液9容と種々の添加物
(後記表1を参照)を蒸留水に溶解した試料1容を混合
し、試験用金コロイド試薬溶液とし、実施例1と同様に
してその反応性を試験した。なお、添加物質濃度は試験
用金コロイド試薬溶液中でいずれも0.05%とした。
すなわち、試験用金コロイド試薬溶液の調製当日と37
℃にて5日および10日保存後のものについて同様に検
体を測定し、試験用金コロイド試薬溶液の安定性(残存
反応率)について測定した。その結果を表1の溶液組成
2の欄に示す。
対照(蒸留水添加)に比べ、鉄、銅、鉛の各イオンとE
DTAとからなる物質(EDTA−Na−Fe、EDT
A−2Na−Cu、EDTA−2Na−Pb)を添加し
た場合、溶液組成1および2とも、金コロイド試薬溶液
の反応の低下が抑制され明白な安定化効果が認められ
た。一方、キレート剤単独(EDTA−2Na)やカル
シウム、マンガン、コバルトなどの他の金属イオンとE
DTAとからなる物質を添加した場合は安定化効果は劣
り、また、鉄や銅などの金属塩単独添加ではいずれも安
定化効果は認められなかった。
合の反応性の低下を鉄イオン、銅イオンおよび鉛イオン
から選ばれる金属イオンとキレ−ト剤からなる物質を1
種または2種以上配合することにより抑制することがで
き、感作金属コロイド試薬の安定化が図れる。従って、
本発明によれば、より長期にわたり感作金属コロイド試
薬溶液の使用が可能となり、感作金属コロイド試薬溶液
を用いた抗原抗体反応等の測定を行う臨床検査分野にお
いて、使用期間の延長や測定精度の向上に寄与すること
ができる。
Claims (12)
- 【請求項1】 感作金属コロイド試薬溶液に鉄イオン、
銅イオンおよび鉛イオンから選ばれる金属イオンとキレ
−ト剤からなる物質を1種または2種以上配合すること
を特徴とする感作金属コロイド試薬溶液の安定化方法。 - 【請求項2】 キレ−ト剤がエチレンジアミン四酢酸で
ある請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 該金属イオンとキレ−ト剤からなる物質
がエチレンジアミン四酢酸一ナトリウム鉄、エチレンジ
アミン四酢酸二ナトリウム銅、またはエチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム鉛である請求項1または2に記載の
方法。 - 【請求項4】 金属コロイドが金コロイドである請求項
1、2または3に記載の方法。 - 【請求項5】 感作金属コロイドが抗体により感作され
た金属コロイドである請求項1、2、3または4に記載
の方法。 - 【請求項6】 抗体がヒトヘモグロビンに対する抗体で
ある請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 安定化剤として、鉄イオン、銅イオンお
よび鉛イオンから選ばれる金属イオンとキレ−ト剤から
なる物質を1種または2種以上配合したことを特徴とす
る安定な感作金属コロイド試薬溶液。 - 【請求項8】 キレ−ト剤がエチレンジアミン四酢酸で
ある請求項7に記載の溶液。 - 【請求項9】 該金属イオンとキレート剤からなる物質
が、エチレンジアミン四酢酸一ナトリウム鉄、エチレン
ジアミン四酢酸二ナトリウム銅またはエチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム鉛である請求項7または8に記載の
溶液。 - 【請求項10】 金属コロイドが金コロイドである請求
項7、8または9に記載の溶液。 - 【請求項11】 感作金属コロイドが抗体により感作さ
れた金属コロイドである請求項7、8、9または10に
記載の溶液。 - 【請求項12】 抗体がヒトヘモグロビンに対する抗体
である請求項11に記載の溶液。
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---|---|---|---|
JP32804398A JP3983909B2 (ja) | 1998-11-18 | 1998-11-18 | 感作金属コロイド試薬溶液の安定化方法及び該安定化試薬溶液 |
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010007857A1 (ja) | 2008-07-14 | 2010-01-21 | アルフレッサファーマ株式会社 | 反応性物質が結合した微小粒子の安定化方法および該微小粒子含有試薬 |
US8080430B2 (en) | 2006-04-25 | 2011-12-20 | Canon Kabushiki Kaisha | Target substance detection material and method and kit for detecting target substance |
CN112051401A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-12-08 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种胃蛋白酶原的测定试剂盒 |
-
1998
- 1998-11-18 JP JP32804398A patent/JP3983909B2/ja not_active Expired - Fee Related
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