JP3993670B2 - 感作金属コロイド試薬溶液の安定化方法および安定な感作金属コロイド試薬含有溶液 - Google Patents
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【発明の属する技術分野】
本発明は感作金属コロイド試薬の溶液中での安定化に関するものである。特に、主として臨床検査の分野で、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定に用いられる感作金属コロイド試薬の溶液中での安定化法とその含有組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】
抗原抗体反応を利用した免疫学的測定において金属コロイドが広く用いられている。例えば、抗体を感作した金属コロイドを抗原と反応させて、抗原・抗体−金属コロイド複合体を形成させ、この複合体を抗体が固定化された判定紙(膜)上で泳動させると、固定化された抗体に複合体が捕捉され、その結果、金属コロイドによる着色が生じる。この着色を判定することにより抗原の有無を調べるイムノクロマト法がある。また、溶液中で抗体感作金コロイドと抗原を反応させると、金コロイドが凝集することによって、色調が変化する。この色調を吸光度変化として捉え測定することにより抗原の有無または量を調べるという凝集比色法がある。これらの測定方法においては、測定対象に特異的に結合する物質が金属コロイドに感作された感作金属コロイドが利用され、金属コロイドとしては金コロイドが用いられる場合が多い。
【0003】
金属コロイドを感作処理後に懸濁させる溶液の組成について、多くの報告がある。特開平9−5327の0.05%ポリエチレングリコール(分子量約20000)/PBS溶液(実施例1)、特開平2−141665の0.05Mリン酸ナトリウム−0.15M食塩−0.05%カーボワックス20M(pH7.2)(実施例3、p4)、特開平8−278305の10mMHEPES(pH7.1)、0.3M D−マンニトール、0.05%ポリエチレングリコール(分子量20000)、0.1%牛血清アルブミン(BSA)(実施例:金コロイド標識抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体の調製、p3右カラム、41−47行)、特公平7−46107の20mMトリス緩衝液(pH8.2)、150mM塩化ナトリウム、1%BSA(実施例5、p10右カラム、42−43行)、特開平7−318560の0.1Mトリス緩衝液(pH7.6)、0.3%BSA、0.25%ポリエチレングリコール(6000)、4%シュークロース、0.1%アジ化ナトリウム(実施例、p7右カラム、11−15行)、特開平6−94718の10mMリン酸緩衝液(pH6.4)、1%BSA、0.05%アジ化ナトリウム(実施例1、p5左カラム、9−13行)、等がある。また、Biochem.Biophys. Res. Commun. Vol.121、No.1(1984)p284−289のp285では、感作金コロイドをPBS(リン酸緩衝生理食塩水)/1%BSA/0.02%アジ化ナトリウム溶液中に懸濁したものは、4℃保存で4週間は反応性の低下がなかったと記載されている。
【0004】
また、金コロイド免疫測定時にナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウムの各塩を反応液中に存在させる方法が開示されている(特開平9−5326)が、これらの塩の添加は感作金コロイド試薬の安定化を目的とするものではなく、免疫反応の判定を容易にするためのものである。さらに、感作する前の金属コロイドの凝集防止方法(特開平9−70527)として、無機イオンを含まず、かつ有機系である緩衝剤(例としてトリスヒドロキシメチルアミノメタン、N−トリスヒドロキシメチル−2−アミノメタンスルホン酸等)を組成成分として用いる方法が開示されている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように感作処理後の金属コロイドを懸濁させる溶液には、緩衝剤、BSA、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウムの使用は一般的である。しかしながら、これら物質が添加された感作金属コロイド試薬溶液では経時的に反応性の低下が生じるので、臨床検査用試薬として、長期使用に耐えられる安定な試薬とすることが望まれる。よって、本発明の目的は、溶液中での感作金属コロイド試薬を安定化する方法、長期保存可能な感作金属コロイド試薬溶液を提供することである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明はカルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオン、デキストラン硫酸、コール酸、デオキシコール酸、キサンツレン酸から選ばれる酸またはその塩の1種または2種以上を組成成分として用いることを特徴とする、感作金属コロイド試薬溶液を安定化する方法および安定な感作金属コロイド試薬含有組成物を提供するものである。
また、本発明はカルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオンの1種または2種以上と、デキストラン硫酸、コール酸、デオキシコール酸、キサンツレン酸から選ばれる酸またはその塩の1種または2種以上とを組み合わせて、組成成分として用いることを特徴とする、感作金属コロイド試薬溶液をさらに安定化する方法およびさらに安定な感作金属コロイド試薬含有組成物を提供するものである。
本発明によれば、感作金属コロイド試薬溶液の反応性を長期に維持することができ、公知の方法に従ってヘモグロビンの測定試薬として好適に使用される。
【0007】
【発明の実施の形態】
本発明における金属コロイドとしては、金、銀、セレン等のコロイドがあるが、金コロイドが一般的に利用され易く、好ましい。
金属コロイドを感作するものとしては、抗体や抗原の他に、測定対象に特異的に結合するものであれば利用可能である。
本発明で安定化剤として用いられるカルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオンは、通常塩の形で用いられ、それらの塩としては、溶液中でそれらのイオンを形成する塩であればいずれも利用できる。例えばカルシウムイオンには塩化カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム等の塩、マグネシウムイオンには塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の塩、バリウムイオンには塩化バリウム、フッ化バリウム等の塩が含まれる。これらの金属イオンは0.018−4.5mMの濃度範囲、好ましくは1mM付近の濃度で配合される。それらを塩の濃度で示せば、例えばカルシウムイオンとしての塩化カルシウムの濃度は0.0002−0.05%(0.018−4.5mM)の範囲で、0.01%(0.9mM)付近が好ましい。
他の安定化剤であるデキストラン硫酸、コール酸、デオキシコール酸およびキサンツレン酸は遊離酸としてまたはそれらの塩として用いられ、例えばデキストラン硫酸はナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩等が利用でき、その用量は0.0001−0.2%の濃度範囲である。コール酸およびデオキシコール酸はそのものまたはナトリウム塩等のアルカリ金属塩等が利用でき、その用量は0.0001−0.5%の範囲である。またキサンツレン酸も、そのものまたはアルカリ金属塩として利用でき、その用量は0.005−0.1%の範囲である。
本発明における感作金属コロイド試薬液には、従来用いられている緩衝剤、糖および糖アルコール、アルブミン、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、防腐剤、その他の物質が適宜含まれる。
【0008】
緩衝剤としては、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、トリス塩酸緩衝液、2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルフォン酸(HEPES)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルフォン酸(BES)、2−モルフォリノエタンスルフォン酸(MES)、3−[N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−ヒドロキシプロパンスルフォン酸(DIPSO)、2−ヒドロキシ−N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルフォン酸(TAPSO)等のグッド緩衝液が挙げられ、pHは5−9が好ましく、濃度は1−100mMが好ましい。糖および糖アルコールとしては、グルコ−ス、マンノース、サッカロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール等が挙げられ、濃度としては0.01−10%が好ましい。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン(BSA)が好ましく、濃度としては0.001−1%が好ましい。防腐剤としてはアジ化ナトリウムが好ましく、濃度としては0.01−0.5%が好ましい。その他の添加物質として、ツィーン20、ポリエチレングリコール(分子量1、000−500、000)、ポリエチレングリコールラウリルエーテル、5−ブロモサルチル酸、サリチル酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、フェノール、チモール等が挙げられる。
【0009】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例1
ヒトヘモグロビンを緩衝液A(0.05%BSA、0.1%アスパラギン、0.9%塩化ナトリウム、1.8%ポリエチレングリコール、0.05%アジ化ナトリウムを含む30mM MES緩衝液pH5.7)に溶解して、ヘモグロビン濃度0、50、100および200ng/mlの溶液を調製し、小分け分注し−40℃の冷凍庫に凍結保存したものを融解し、検体として使用する。
抗ヘモグロビン抗体を感作した金コロイド試薬(メイチェック ヘモプレート(オート)(日本商事(株)製)の金コロイド試薬凍結乾燥品(60ml用)を0.2%BSA、6%マンニトール、0.1%アジ化ナトリウムを含む10mM HEPES緩衝液B(15ml)で溶解する(金コロイド液)。各種の安定化剤(後記表1および表2を参照)を蒸留水に溶解し、試料溶液とする。ただし、酸の物質については水酸化ナトリウム溶液を添加し中性に調整する。前記、金コロイド液と試料溶液を1:1に混合し、金コロイド試薬溶液とする。
金コロイド試薬溶液の反応性は金コロイド凝集比色法により以下のように測定する。マイクロプレートに検体(25μl)、緩衝液A(50μl)、金コロイド試薬溶液(100μl)を添加後、マイクロプレートを撹拌し、撹拌後約30秒後とその6分後の吸光度(主波長540nm、副波長700nm)をプレートリーダーを用いて測定する。初期吸光度と6分後の吸光度の差(変化)を検体(ヘモグロビン)に対する金コロイド試薬溶液の反応性の指標とする。金コロイド試薬溶液の調製当日と37℃にて3日保存後に検体を測定し、調製当日の金コロイド試薬溶液の反応性を100%として、37℃にて3日保存後の残存反応率(%)を求める。その結果を表1に示す。
【0010】
【表1】
【0011】
表1の安定化剤の濃度は金コロイド試薬溶液中の濃度である。対照(蒸留水添加)に比べ、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フッ化バリウム、デキストラン硫酸カリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、キサンツレン酸の添加で、金コロイド試薬溶液の反応の低下が抑制され、金コロイド試薬溶液の安定化効果が認められる。
【0012】
実施例2
実施例1と同様の方法で、金コロイド試薬溶液の調製当日と37℃にて3、6日保存後に検体を測定し、安定化剤の単独および組み合わせの添加による金コロイド試薬溶液の安定化効果について検討する。その結果を表2に示す。
【0013】
【表2】
【0014】
表2の試験結果から明らかなように、塩化バリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、デキストラン硫酸カリウム、コール酸ナトリウム、キサンツレン酸各単独とそれらの組み合わせの添加それぞれに金コロイド試薬溶液の安定化効果が認められる。
【0015】
【発明の効果】
感作金属コロイド試薬溶液の反応性の低下をカルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオン、デキストラン硫酸、コール酸、デオキシコール酸、キサンツレン酸から選ばれる酸またはその塩の1種または2種以上を用いることにより抑制することができ、感作金属コロイド試薬の安定化が図れる。従って、本発明によれば、より長期にわたり感作金属コロイド試薬溶液の安定化が可能となり、感作金属コロイド試薬溶液を用いた抗原抗体反応等の測定を行う臨床検査分野において、使用期間の延長や測定精度の向上に寄与することができる。
Claims (10)
- 濃度範囲が0.018〜4.5mMの範囲の、カルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオン、または濃度範囲0.0001〜0.2%のデキストラン硫酸、濃度範囲0.0001〜0.5%のコール酸、濃度範囲0.0001〜0.5%のデオキシコール酸、および濃度範囲0.005〜0.1%のキサンツレン酸から選ばれる酸もしくはそれらの塩から選ばれる物質の1種または2種以上を用いることを特徴とする感作金属コロイド試薬溶液の安定化方法。
- 濃度範囲が0.018〜4.5mMの範囲の、カルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオンの1種または2種以上と、濃度範囲0.0001〜0.2%のデキストラン硫酸、濃度範囲0.0001〜0.5%のコール酸、濃度範囲0.0001〜0.5%のデオキシコール酸および濃度範囲0.005〜0.1%のキサンツレン酸から選ばれる酸もしくはそれらの塩の1種または2種以上とを組み合わせて用いることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 金属コロイドが金コロイドである請求項1または2に記載の方法。
- 金属コロイドの感作が抗体による感作である請求項1、2または3に記載の方法。
- 抗体がヒトヘモグロビンに対する抗体である請求項4に記載の方法。
- 濃度範囲が0.018〜4.5mMの範囲の、カルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオン、または濃度範囲0.0001〜0.2%のデキストラン硫酸、濃度範囲0.0001〜0.5%のコール酸、濃度範囲0.0001〜0.5%のデオキシコール酸、および濃度範囲0.005〜0.1%のキサンツレン酸から選ばれる酸もしくはそれらの塩から選ばれる物質の1種または2種以上を含有することを特徴とする安定な感作金属コロイド試薬含有溶液。
- 濃度範囲が0.018〜4.5mMの範囲の、カルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオンの1種または2種以上と、濃度範囲0.0001〜0.2%のデキストラン硫酸、濃度範囲0.0001〜0.5%のコール酸、濃度範囲0.0001〜0.5%のデオキシコール酸、および濃度範囲0.005〜0.1%のキサンツレン酸から選ばれる酸もしくはその塩の1種または2種以上とを含有することを特徴とする請求項6に記載の溶液。
- 金属コロイドが金コロイドである請求項6または7に記載の溶液。
- 金属コロイドの感作が抗体による感作である請求項6、7または8に記載の溶液。
- 抗体がヒトヘモグロビンに対する抗体である請求項9に記載の溶液。
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