CN115290892B - 一种缓冲液在脑特异性蛋白产物9.5检测试剂盒中的应用 - Google Patents
一种缓冲液在脑特异性蛋白产物9.5检测试剂盒中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种缓冲液在脑特异性蛋白产物9.5检测试剂盒中的应用,所述的缓冲液为碳酸盐缓冲液,所述的碳酸盐缓冲液中每1000mL包括以下成分:碳酸钠0.5‑5.0g、碳酸氢钠1.2‑9.6g、硫酸镁1.0‑5.0g、氯化钾0.5‑2.5g、甘氨酸0.75‑7.5g;所述的试剂盒中还包括HEPES缓冲液。本发明提供的碳酸盐缓冲液在应用于特异性蛋白产物9.5的ELISA试剂盒时,与其中的HEPES缓冲液具有协同作用,能够提高试剂盒检测性能,具有很好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种缓冲液在脑特异性蛋白产物9.5检测试剂盒中的应用。
背景技术
脑特异性蛋白产物9.5(Protein gene product 9.5,PGP 9.5)也称UCH-L1,是一种神经纤维中的特异性泛素羟基水解酶,也是神经轴突标记物,抗PGP9.5抗体与神经纤维结合,使用免疫荧光或免疫组织化学的方法即可标记出组织中PGP9.5阳性的神经纤维。
现有技术中已经公开,脑特异性蛋白产物9.5在创伤性脑损伤早期出现在血清和脑脊液中,因此检测脑特异性蛋白产物9.5可以作为检测创伤性脑损伤,且其敏感性和特异性比CT扫描更具优势。对于特异性蛋白产物9.5的检测方法进行改进对于创伤性脑损伤诊断具有重要意义。
Banyan Biomarkers研发的GFAP/PGP9.5脑损伤检测试剂盒Banyan BTI采用ELISA检测方法,诊断18岁及以上疑似TBI患者,具有97.6%的高灵敏性和99.6%的高度阴性预测值,优于CT扫描。
对于PGP9.5的检测,现有研究多侧重于单克隆抗体方向。
如中国专利201910719120.X中公开了一种鼠抗人泛素羧基末端水解酶-1(UCH-L1)的单克隆抗体,所述的抗体是由保藏号为CGMCC No.18188的杂交瘤细胞株UMAB244分泌产生。所述抗体的免疫原为真核细胞293T表达的UCH-L1全长蛋白,可应用于检测UCH-L1的各种免疫检测试剂盒的制备,包括但不限于双抗体夹心ELISA或化学发光法试剂盒的制备,为与UCH-L1相关的疾病诊断提供辅助手段。
再如中国专利201780080585.4中公开了抗UCH-L1抗体和抗GFAP抗体及其分别在来自个体的样品中的UCH-L1和GFAP的体外检测中的用途,所述个体比如已知或疑似患有脑损伤或损害例如轻度创伤性脑损伤等神经损害的个体。还提供了利用上述抗体以及包含抗UCH-L1抗体和抗GFAP抗体的组合物诊断个体的脑损伤或损害比如神经损害的方法、系统和试剂盒。
但在实际检测中,整个流程都会对最终的检测结果产生影响,对于抗体以外的检测部分进行优化,有利于提高PGP9.5检测试剂盒的整体性能,从而更好地应用于临床。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种缓冲液在脑特异性蛋白产物9.5检测试剂盒中的应用,通过优化ELISA流程中的缓冲液,使脑特异性蛋白产物9.5检测试剂盒的检测性能提高。
本发明中,“ELISA”指将可溶性的抗原或抗体结合到固相载体上,利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。该方法为本领域经典方法,操作流程中如无特别限制,本领域技术人员可以采用一般方法完成。
本发明中,“缓冲液”指的是多种成分的混合溶液,能在一定程度上抵消、减轻外在条件对整体实验的影响,从而保持溶液的相对稳定。
本发明中,“试剂盒”中可能包括用于检测流程的所有成分,但部分条件下,可能仅仅包括关键技术相关的部分,其他成分本领域技术人员可以轻易获得,且知晓具体与试剂盒的联用方式。
本发明中,“试剂盒的检测性能”用于衡量试剂盒针对检测目标的检测效果,其衡量标准是多方面的,可以是准确度、空白限、线性区间、重复性、批内差、批间差特异性、质控品瓶间差等。本发明中,各种用于验证试剂盒检测性能的实验方法,如无特别说明,均可参照本领域常规方法或者标准完成。
一方面,本发明提供了一种缓冲液在脑特异性蛋白产物9.5检测试剂盒中的应用。
所述的缓冲液为碳酸盐缓冲液,所述的碳酸盐缓冲液中包括以下成分:
所述的试剂盒中还包括HEPES缓冲液,所述的HEPES缓冲液中包括以下成分:
原料名称 | 称取量 |
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 | 0.5-7.2g |
氯化钠 | 9g |
酪朊酸钠 | 0.5-5.0g |
甘露醇 | 5-30g |
非离子型表面活性剂 | 2-4mL |
防腐剂 | 1mL |
pH值 | 7.2-8.0 |
纯化水 | 定容至1000mL |
优选地,所述的碳酸盐缓冲液中包括以下成分:
原料名称 | 称取量 |
碳酸钠 | 1.0-3.0g |
碳酸氢钠 | 3.0-9.0g |
硫酸镁 | 2.0-4.0g |
氯化钾 | 1.0-2.0g |
甘氨酸 | 1.0-5.0g |
pH值 | 9.2-9.8 |
纯化水 | 定容至1000mL |
进一步优选地,所述的碳酸盐缓冲液中包括以下成分:
具体地,所述的HEPES缓冲液中,非离子型表面活性剂包括但不限于:吐温20;所述的防腐剂包括但不限于:Proclin300。
具体地,所述的碳酸盐缓冲液的配制方法为:称取Na2CO3、NaHCO3、MgSO4、KCl、甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值并定容至1000mL。
具体地,所述的HEPES缓冲液的配制方法为:称取HEPES、NaCl、酪朊酸钠、甘露醇、非离子型表面活性剂、防腐剂加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值在7.2-8.0之间并定容至1000mL。
具体地,所述的试剂盒为ELISA试剂盒。
具体地,所述的碳酸盐缓冲液用于ELISA试剂盒中固相抗体的前处理、包被和酶标抗体偶联物的制备和/或保存。
具体地,所述的固相抗体前处理包括浓缩和/或稀释。
优选地,所述的试剂盒中还包括用于检测脑特异性蛋白产物9.5的其他试剂,所述的其他试剂包括但不限于:高碘酸钠溶液、六水合氯化镁溶液、氯化锌水溶液、乙酸水溶液、硼氢化钠水溶液、标准品、质控品、清洗浓缩液、显色液、终止液中的一种或多种。
所述的清洗浓缩液成分如下:
原料名称 | 称取量 |
三羟甲基氨基甲烷 | 10-15g |
氯化钠 | 90g |
非离子型表面活性剂 | 2-50mL |
pH值 | 7.0-7.5 |
纯化水 | 定容至1000mL |
另一方面,本发明提供了一种脑特异性蛋白产物9.5检测试剂盒。
具体地,所述的试剂盒中包括碳酸盐缓冲液和HEPES缓冲液;所述的碳酸盐缓冲液中包括以下成分:
原料名称 | 称取量 |
碳酸钠 | 0.5-5.0g |
碳酸氢钠 | 1.2-9.6g |
硫酸镁 | 1.0-5.0g |
氯化钾 | 0.5-2.5g |
甘氨酸 | 0.75-7.5g |
pH值 | 9.2-9.8 |
纯化水 | 定容至1000mL |
所述的HEPES缓冲液中包括以下成分:
原料名称 | 称取量 |
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 | 0.5-7.2g |
氯化钠 | 9g |
酪朊酸钠 | 0.5-5.0g |
甘露醇 | 5-30g |
非离子型表面活性剂 | 2-4mL |
防腐剂 | 1mL |
pH值 | 7.2-8.0 |
纯化水 | 定容至1000mL |
优选地,所述的碳酸盐缓冲液中包括以下成分:
原料名称 | 称取量 |
碳酸钠 | 1.0-3.0g |
碳酸氢钠 | 3.0-9.0g |
硫酸镁 | 2.0-4.0g |
氯化钾 | 1.0-2.0g |
甘氨酸 | 1.0-5.0g |
pH值 | 9.2-9.8 |
纯化水 | 定容至1000mL |
具体地,所述的碳酸盐缓冲液的配制方法为:称取Na2CO3、NaHCO3、MgSO4、KCl、甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值并定容至1000mL。
具体地,所述的HEPES缓冲液的配制方法为:称取HEPES、NaCl、酪朊酸钠、甘露醇、非离子型表面活性剂、防腐剂加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值在7.2-8.0之间并定容至1000mL。
具体地,所述的试剂盒为ELISA试剂盒。
具体地,所述的碳酸盐缓冲液用于ELISA试剂盒中固相抗体的前处理、包被和酶标抗体偶联物的制备和/或保存。
具体地,所述的固相抗体前处理包括浓缩和/或稀释。
优选地,所述的试剂盒中还包括用于检测脑特异性蛋白产物9.5的其他试剂,所述的其他试剂包括但不限于:高碘酸钠溶液、六水合氯化镁溶液、氯化锌水溶液、乙酸水溶液、硼氢化钠水溶液、标准品、质控品、清洗浓缩液、显色液、终止液中的一种或多种。
所述的清洗浓缩液成分如下:
原料名称 | 称取量 |
三羟甲基氨基甲烷 | 10-15g |
氯化钠 | 90g |
非离子型表面活性剂 | 2-50mL |
pH值 | 7.0-7.5 |
纯化水 | 定容至1000mL |
本发明的有益效果:
本发明提供的碳酸盐缓冲液在应用于特异性蛋白产物9.5的ELISA试剂盒时,与其中的HEPES缓冲液具有协同作用,对于特异性蛋白产物9.5的检测试剂盒的性能具有较大的提升作用,具有很好的临床应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例,对本发明作进一步详细的阐述,下述实施例不用于限制本发明,仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
以下实施例中,部分缓冲液配方和配制方法如下:
缓冲液1:
称取2.0-3.8g的Na2HPO4·12H2O、0.01-0.8g的NaH2PO4加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值在6.5-7.6之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表1缓冲液1配方
原料名称 | 称取量 |
十二水合磷酸氢二钠 | 2.0-3.8g |
磷酸二氢钠 | 0.01-0.8g |
pH值 | 6.5-7.6 |
纯化水 | 定容至1000mL |
缓冲液2:
称取10-28g的NaIO加入到一定量的缓冲液1中搅拌至完全溶解,调试pH值在6.5-7.6之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表2缓冲液2配方
原料名称 | 称取量 |
高碘酸钠 | 10-28g |
pH值 | 6.5-7.6 |
缓冲液1 | 定容至1000mL |
缓冲液3:
称取203.3g的MgCl2·6H2O加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表3缓冲液3配方
原料名称 | 称取量 |
六水合氯化镁 | 203.3g |
纯化水 | 定容至1000mL |
缓冲液4:
称取136.3g的ZnCl2加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表4缓冲液4配方
原料名称 | 称取量 |
氯化锌 | 136.3g |
纯化水 | 定容至1000mL |
缓冲液5:
称取0.02-0.57g的CH COOH加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表5缓冲液5配方
原料名称 | 称取量 |
乙酸 | 0.02-0.57g |
纯化水 | 定容至1000mL |
缓冲液6:
称取8.5-52g的Na2CO3、14-86g的NaHCO3加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值在9.0-10.0之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表6缓冲液6配方
原料名称 | 称取量 |
碳酸钠 | 8.5-52g |
碳酸氢钠 | 14-86g |
pH值 | 9.0-10.0 |
纯化水 | 定容至1000mL |
缓冲液7:
称取1-5mg的NaBH4加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表7缓冲液7配方
原料名称 | 称取量 |
硼氢化钠 | 1-5mg |
纯化水 | 定容至1000mL |
缓冲液8(碳酸盐缓冲液):
称取0.5-5.0g的Na2CO3、1.2-9.6g的NaHCO3、1.0-5.0g的MgSO4、0.5-2.5g的KCl、0.75-7.5g的甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值在9.2-9.8之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表8缓冲液8配方
原料名称 | 称取量 |
碳酸钠 | 0.5-5.0g |
碳酸氢钠 | 1.2-9.6g |
硫酸镁 | 1.0-5.0g |
氯化钾 | 0.5-2.5g |
甘氨酸 | 0.75-7.5g |
pH值 | 9.2-9.8 |
纯化水 | 定容至1000mL |
缓冲液9(HEPES缓冲液):
称取0.5-7.2g的HEPES、9.0g的NaCl、0.5-5.0g的酪朊酸钠、5-30g的甘露醇2-4mL的非离子型表面活性剂、1mL的防腐剂加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值在7.2-8.0之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表9缓冲液9配方
原料名称 | 称取量 |
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 | 0.5-7.2g |
氯化钠 | 9g |
酪朊酸钠 | 0.5-5.0g |
甘露醇 | 5-30g |
非离子型表面活性剂 | 2-4mL |
防腐剂 | 1mL |
pH值 | 7.2-8.0 |
纯化水 | 定容至1000mL |
缓冲液10:
称取1.0-1.5g的Tris、9g的NaCl、0.2-5mL的非离子型表面活性剂加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值在7.0-7.5之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表10缓冲液10配方
原料名称 | 称取量 |
三羟甲基氨基甲烷 | 1.0-1.5g |
氯化钠 | 9g |
非离子型表面活性剂 | 0.2-5mL |
pH值 | 7.0-7.5 |
纯化水 | 定容至1000mL |
缓冲液11:
称取12.0-15.0g的Tris、5.0-50g的牛血清白蛋白、1.0-30g甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值在7.6-8.8之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表11缓冲液11配方
原料名称 | 称取量 |
三羟甲基氨基甲烷 | 12.0-15.0g |
牛血清白蛋白 | 5.0-50g |
甘氨酸 | 1.0-30g |
pH值 | 7.6-8.8 |
纯化水 | 定容至1000mL |
缓冲液12:
称取2.3-23.8g的HEPES、9.0g的NaCl、5.0-30g的牛IgG、1-10mL的缓冲液3、1-10mL的缓冲液4、1-20g的酶水解明胶、30-120mL的酶稳定剂、0.2-5g的月桂醇聚氧乙烯醚、1mL的防腐剂加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值在7.0-7.6之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表12缓冲液12配方
缓冲液13:
称取10-15g的Tris、90g的NaCl、2-50mL的非离子型表面活性剂加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值在7.0-7.5之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表13缓冲液13配方
原料名称 | 称取量 |
三羟甲基氨基甲烷 | 10-15g |
氯化钠 | 90g |
非离子型表面活性剂 | 2-50mL |
pH值 | 7.0-7.5 |
纯化水 | 定容至1000mL |
实施例1一种脑特异性蛋白产物9.5检测试剂盒及其检测方法
1、检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心法测定PGP9.5的含量。样本中PGP9.5和试剂A中的酶标抗体1及包被板中的抗体2结合,形成“三明治”夹心结构。经洗涤,加入显色液进行反应。显色液在过氧化物酶的催化下转化为蓝色,并在酸的作用下转化为最终的黄色。颜色的深浅与样本中PGP9.5的浓度成正相关。在450nm波长下测定OD值并计算样本浓度。
2、试剂盒组分
PGP9.5试剂盒由包被板、试剂A、校准品、质控品、清洗浓缩液(缓冲液13)、显色液、终止液组成。其中包被板为96孔微孔板。试剂A为含一定浓度辣根过氧化物酶标记的PGP9.5抗体溶液;校准品由含有六个浓度的PGP9.5抗原和缓冲液配制而成,用于校准标准曲线;质控品由含有两个浓度的PGP9.5抗原和缓冲液配制而成;清洗浓缩液用于反应过程的清洗,工作液浓度为10倍稀释的浓缩液;显色液为TMB溶液;终止液为2M硫酸。
表14试剂盒主要组分
试剂盒主要组分 | 装量 |
包被板(96孔) | 1个 |
试剂A | 30mL |
质控品 | 1mL×1 |
校准品1~6 | 1mL×1 |
清洗浓缩液 | 10mL |
显色液 | 30mL |
终止液 | 30mL |
3、生产工艺
3.1校准品、质控品的生产
将PGP9.5重组蛋白(Abcam,ab198431)作为校准品的原料。以缓冲液11将其溶解,充分混合后配制成6个校准品,浓度为0pg/mL、80pg/mL、160pg/mL、480pg/mL、1280pg/mL、2560pg/mL。
将PGP9.5重组蛋白作为质控品的原料。以缓冲液11将其溶解,充分混合配制成质控品。浓度为80pg/mL、480pg/mL。
3.2试剂A的生产
将酶标记PGP9.5抗体偶联物作为试剂A的原料(见6.1部分)。以缓冲液12将其充分混匀配制成试剂A。
4.检测方法
免疫反应:将100uL样本、100μL试剂A依次加入微孔板孔位,在37℃条件下反应40min。
清洗:通过仪器的自动清洗流程对微孔板进行清洗。
读值:在各孔位加入100μL显色液,室温避光反应15min,再在各孔位加入50μL终止液。辣根过氧化物酶催化的显色液显色后在5min内用自研仪器检测450nm波长吸光度(OD值)。
根据检测的校准品数值可获得一条GFAP浓度-发光值标准曲线。该曲线使用四参数Logistic方程拟合。
样本的检测值可以和这条曲线上获得唯一的浓度值对应,从而实现对未知样本的浓度检测。
5.检测指标
5.1准确度
将浓度约为3000pg/mL(允许偏差±10%)的脑特异性蛋白产物(PGP9.5)液(A)加入到浓度范围0pg/mL-80pg/mL的样本B中,所加入PGP9.5抗原与样本B之间的体积比例为1:9,根据公式(1)计算回收率R,其回收率应在85%-115%范围内。
式中:
R—回收率;
V—样品A液的体积;
V0—血清样品B液的体积;
C—血清样品B液加入A液后的3次测量平均值;
C0—血清样品B液的3次测量平均值;
CS—样品A液的浓度。
5.2空白限
5.3线性区间
将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本混合成不少于5个稀释浓度,其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值,记录各样品的测量结果,并计算各样品3次测量值的平均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量,以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(2)计算线性回归的相关系数(r),在80-2560pg/mL的线性区间内,相关系数r应≥0.990。
式中:
r—相关系数;
xi—稀释比例;
yi—各个样本测定结果均值;
5.4重复性
式中:s——样本测试值的标准差;
5.5批间差
5.6校准品和质控品瓶间差
检测同一批号10瓶校准品(或质控品)各1次,按公式(5)计算,测定结果的均值与标准差(S1)。另取上述10瓶校准品(或质控品)中的1瓶连续测定5次,计算结果的均值和标准差(S2),按照公式(6)、(7)计算瓶间重复性CV%,测量结果应<10%。
(说明:当S1<S2时,令CV瓶间=0)
式中:S—标准差。
6.反应流程
6.1酶标记抗体1及纯化
6.1.1辣根过氧化物酶(HRP)的检测
使用纯化水将超微量紫外分光光度计调零,检测HRP在275nm波长和403nm波长处的OD值。计算RZ值,RZ=OD403nm/OD275nm,当RZ≥3.0时,HRP可用。
6.1.2超滤浓缩离心管的前处理
取两支超滤浓缩离心管,其分子截流量≥10KD。使用纯化水将内管、外管浸泡5min以上。在内管中加入500μL纯化水。离心机参数设置为:2-8℃、12000rpm、离心5min。弃掉外管上清后,重复以上加液-离心-弃上清步骤,一共重复5次。将两支处理好的超滤浓缩离心管排空液体,盖好盖子备用。
6.1.3辣根过氧化物酶(HRP)的活化
称取5mg HRP(Merck,P8375),溶于1.2mL纯化水中,加入0.3mL新鲜配制的缓冲液2,室温条件下混匀20min。将HRP溶液转入一支处理好的超滤浓缩离心管内管中,在内管中加入500μL缓冲液5。离心机参数设置为:2-8℃、12000rpm、离心5min。弃掉外管上清后,重复以上加液-离心-弃上清步骤,一共重复5次。收集内管中的浓缩液,2-8℃避光保存。
6.1.4抗体1的活化
按抗体1(merck,ZRB1664)与缓冲液6体积比1:5-1:20的比例将缓冲液6加入抗体1溶液中进行活化,震荡混匀后,立即测试混合液的pH值,pH值应在9-10之间。
6.1.5抗体1和HRP的连接
按抗体1与HRP质量比1:2-1:1的比例在抗体1溶液中的加入HRP溶液(即:1.0mg抗体1加入1.0-2.0mg HRP)。震荡混匀后,立即测试混合液的pH值,pH值应在9-10之间,如不符合要求,使用缓冲液6进行调节。将混合物在20-40℃条件下中避光混匀反应1-3.5小时。
6.1.6抗体1偶联物的终止和纯化
按1mg抗体1加入100μL缓冲液7的比例加入该溶液,在2-8℃条件下混匀反应2小时。将反应液转入另一个处理好的超滤浓缩离心管内管中。在内管中加入500μL缓冲液8。离心机参数设置为:2-8℃、12000rpm、离心5min。弃掉外管上清后,重复以上加液-离心-弃上清步骤,一共重复5次。收集内管中的浓缩液。该浓缩液即抗体1偶联物,其浓度应在1-4mg/mL之间,如不在范围,应重新浓缩或使用缓冲液8进行稀释。
按1mL抗体1偶联物加入1mL甘油(即体积比1:1)、1mL抗体1偶联物加入5-20μg牛血清白蛋白(即质量体积比200:1-200:4)。充分混匀后,在-20℃环境下保存。
6.2抗体2包被及封闭
6.2.1超滤浓缩离心管的前处理
取一支超滤浓缩离心管,其分子截流量≥10KD。使用纯化水将内管、外管浸泡5min以上。在内管中加入500μL纯化水。离心机参数设置为:2-8℃、12000rpm、离心5min。弃掉外管上清后,重复以上加液-离心-弃上清步骤,一共重复5次。将处理好的超滤浓缩离心管排空液体,盖好盖子备用。
6.2.2抗体2的前处理
量取1mg抗体2(Abcam,227157)溶液,将其转入处理好的超滤浓缩离心管内管中,在内管中加入500μL缓冲液8。离心机参数设置为:2-8℃、12000rpm、离心5min。弃掉外管上清后,重复以上加液-离心-弃上清步骤,一共重复5次。收集内管中的浓缩液,其浓度应在0.5-2mg/mL之间,如不在范围,应重新浓缩或使用缓冲液8进行稀释。2-8℃保存。
6.2.3抗体2的包被、清洗和封闭
将处理后的抗体2使用缓冲液8进行稀释,稀释浓度在0.1-4μg/mL。在96孔微孔板中加入稀释后的抗体2溶液,每孔的加入量为50-150μL,在2-8℃条件下避光反应12-16小时或在35-42℃条件下避光反应0.5-2小时。之后弃掉各孔反应液,并在各孔中加入缓冲液10,每孔的加入量为200μL。水平均匀震荡微孔板2min。之后弃掉反应液,并重复该过程,一共重复3-5次。最后弃掉各孔反应液并排干液体。之后加入缓冲液9,每孔的加入量为200μL。在35-42℃条件下避光反应0.5-2小时。
6.2.4抗体2包被板的清洗和保存
反应结束后,弃掉各孔反应液。并在各孔中加入缓冲液10,每孔的加入量为200μL。水平均匀震荡微孔板2min。之后弃掉反应液,并重复该过程,一共重复3-5次。最后弃掉各孔反应液并排干液体,在35-42℃条件下避光反应0.5-2小时。使用避光铝膜袋对处理好的包被板进行抽真空封闭,在2-8℃条件下保存。
实施例2-5不同配方碳酸盐缓冲液和HEPES缓冲液的作用
以下所有配方中,防腐剂为Proclin300 1mL(Solarbio,P6840);非离子表面活性剂为Tween-20(赛默飞,85113)。
碳酸盐缓冲液的变量成分如下:
HEPES缓冲液中的变量成分如下:
参照实施例1,在相同实验条件下,使用实施例2-5缓冲液,各检测指标的检测结果如下:
对比例
参照实施例4设置对比例,具体如下:
与实施例4的区别 | |
对比例1 | 碳酸盐缓冲液中将碳酸氢钠替换为磷酸二氢钠 |
对比例2 | 碳酸盐缓冲液中硫酸镁替换为氯化钠 |
对比例3 | 碳酸盐缓冲液中甘氨酸添加量为10g |
对比例4 | HEPES缓冲液中4-羟乙基哌嗪乙磺酸添加量为12g |
对比例5 | HEPES缓冲液中非离子型表面活性剂为曲拉通X100 |
对比例6 | HEPES缓冲液中不添加甘露醇 |
参照实施例4,在相同实验条件下,使用对比例1-6缓冲液,各检测指标的检测结果如下:
Claims (13)
1.一种缓冲液在制备脑特异性蛋白产物9.5检测试剂盒中的应用,其特征在于,所述的缓冲液为碳酸盐缓冲液,所述的碳酸盐缓冲液由以下成分组成:
所述的试剂盒中还包括HEPES缓冲液,所述的HEPES缓冲液由以下成分组成:
所述的碳酸盐缓冲液用于ELISA试剂盒中固相抗体的前处理、包被和酶标抗体偶联物的制备和/或保存。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的碳酸盐缓冲液由以下成分组成:
。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的碳酸盐缓冲液由以下成分组成:
。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的碳酸盐缓冲液的配制方法为:称取Na2CO3、NaHCO3、MgSO4、KCl、甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值并定容至1000mL。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的HEPES缓冲液的配制方法为:称取HEPES、NaCl、酪朊酸钠、甘露醇、非离子型表面活性剂、防腐剂加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解,调试pH值在7.2-8.0之间并定容至1000mL。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的试剂盒为ELISA试剂盒。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的固相抗体前处理包括浓缩和/或稀释。
8.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的试剂盒中还包括用于检测脑特异性蛋白产物9.5的其他试剂。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的其他试剂包括:高碘酸钠溶液、六水合氯化镁溶液、氯化锌水溶液、乙酸水溶液、硼氢化钠水溶液、标准品、质控品、清洗浓缩液、显色液、终止液中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的应用,所述的清洗浓缩液成分如下:
。
11.一种脑特异性蛋白产物9.5检测试剂盒,其特征在于,包括碳酸盐缓冲液和HEPES缓冲液;所述的碳酸盐缓冲液由以下成分组成:
所述的HEPES缓冲液由以下成分组成:
所述的碳酸盐缓冲液用于ELISA试剂盒中固相抗体的前处理、包被和酶标抗体偶联物的制备和/或保存。
12.根据权利要求11所述的试剂盒,其特征在于,所述的碳酸盐缓冲液由以下成分组成:
。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中还包括:高碘酸钠溶液、六水合氯化镁溶液、氯化锌水溶液、乙酸水溶液、硼氢化钠水溶液、标准品、质控品、清洗浓缩液、显色液、终止液中的一种或多种。
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