CN113087782B - 一种中枢神经特异性蛋白的冻干方法 - Google Patents

一种中枢神经特异性蛋白的冻干方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于冻干技术领域，具体涉及一种中枢神经特异性蛋白的冻干方法。所述中枢神经特异性蛋白(S100‑β)的冻干方法，包括以下步骤：取缓冲液将S100‑β溶解，制成S100‑β试剂，放入真空冷冻干燥机内进行冻干；其中，所述缓冲液包括如下组分：4‑羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、硫酸镁(MgSO4)、牛血清白蛋白(BSA)、海藻糖、甘氨酸、酪蛋白(Casein)、甘油。该冻干方法能有效保存中枢神经特异性蛋白，有利于保持其最大的活性。

Description

一种中枢神经特异性蛋白的冻干方法
技术领域
本发明属于冻干技术领域，具体涉及一种中枢神经特异性蛋白的冻干方法。
背景技术
创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)后准确评估中枢神经系统受损严重程度和预后对临床治疗十分重要。目前尚没有一种较为准确的手段来评估TBI的严重程度，也难以判断预后。中枢神经系统损伤所引起的认知功能障碍、运动功能障碍、感觉功能障碍、情绪情感障碍等，严重影响患者的生活质量。
中枢神经特异性蛋白(S100-β)是一种分子量为21KD的酸性钙结合蛋白，主要由星形胶质细胞产生，通过半胱氨酸残基形成二硫键，以二聚体活性形式大量存在于中枢神经系统中。其含量能反映TBI的程度并对预后进行评估。临床上通过检测S100-β蛋白的表达，能够对脑损伤程度进行判断，同时可对患者的预后情况进行评估。
S100-β是一种不稳定的生物活性物质，在常温和2-8℃环境中会迅速丧失活性。当S100-β作为试剂盒组分使用时，如果不进行冻干处理，会造成检测错误并导致试剂盒失效。
现有技术中冻干方法和冻干缓冲液由多种。如中国专利申请CN111893168A提供一种用于冻干的QPCR反应缓冲液，包括如下原料：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液700800mM、硫酸铵150250mM、吐温200.050.15％V/V、氯化镁3035mM、海藻糖5 15mg/ml、甲酰胺515wt.％。将荧光PCR需要用到的所有组分制备在同一冻干粉末中，能够实现不需要过度依赖低温保存；使用时只需用冻干粉溶解液溶解该冻干粉，然后加入样本即可。
如中国专利申请CN107300616A公开一种冻干液配方及其应用。所述冻干液由以下按质量百分数计算的组分组成：0.5～5％干酪素钠，1～10％甘露醇，0.05～0.5％聚吡咯烷酮K30，余量为浓度0.01mol/L的磷酸缓冲液。本发明通过对冻干液配方的合理搭配，利用甘露醇、聚吡咯烷酮K30二者协同作用有助于蛋白的成膜，减少冻干粉在冻干后出现的挂壁现象，提高冻干粉的成型率。能获得很好的成型效果，并且产品外观良好，不出现挂壁等不良现象。本冻干液对多种细胞因子都有很好的冻干效果，尤其是对猴细胞因子有很好的冻干效果。
虽然现有技术中冻干方法及冻干缓冲液多种，但并没有有效的提高中枢神经特异性蛋白保存活性的冻干方法和冻干试剂。本发明旨在提供一种有效的冻干品制备方法，使中枢神经特异性蛋白保持最大的活性。使用特殊的缓冲体系溶解S100-β并将其冻干为干粉，可以长时间保持其活性，保证试剂盒的稳定性和有效性。
发明内容
为克服以上技术问题，本发明提供了一种中枢神经特异性蛋白的冻干方法。冻干方法能有效保存中枢神经特异性蛋白，有利于保持其最大的活性。
为实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：
一种中枢神经特异性蛋白(S100-β)的冻干方法，包括以下步骤：取缓冲液将S100-β溶解，制成S100-β试剂，放入真空冷冻干燥机内进行冻干；其中，所述包括如下组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、硫酸镁(MgSO4)、牛血清白蛋白(BSA)、海藻糖、甘氨酸、酪蛋白(Casein)、甘油。
优选地，所述S100-β试剂由S100-β抗原和缓冲液配制而成，用于标准品、质控品或参考品。
优选地，所述冻干方法，包括以下步骤：
将真空冷冻干燥机设置成三个阶段，分别为预冷冻段、升华干燥段、解析干燥段；冻干后，在4-8℃环境下保存。
优选地，所述预冷冻段为：将S100-β试剂从常温降温至0℃；降温时间为5-30分钟；
在0℃保温2-10分钟后，再降温至-30℃，降温时间为5-30分钟；
在-30℃保温5-60分钟后，再降温至-55℃，降温时间为5-30分钟；在-55℃保温30-240分钟；
优选地，所述升华干燥段为：将真空度在1-5分钟内降至0-5帕斯卡(pa)；设置7个温度点，分别为-50℃、-45℃、-35℃、-30℃、-25℃、-25℃、-5℃；
-55℃到-50℃的升温时间为2-10分钟、在-50℃的保温时间为10-60分钟；
-50℃到-45℃的升温时间为10-60分钟、在-45℃的保温时间为30-120分钟；
-45℃到-35℃的升温时间为10-60分钟、在-35℃的保温时间为30-240分钟；
-35℃到-30℃的升温时间为2-60分钟、在-30℃的保温时间为30-480分钟；
-30℃到-25℃的升温时间为2-60分钟、在-25℃的保温时间为30-240分钟；
-25℃到-15℃的升温时间为5-60分钟、在-15℃的保温时间为30-120分钟；
-15℃到-5℃的升温时间为5-30分钟、在-5℃的保温时间为10-60分钟。
优选地，所述解析干燥段为：设置两个温度点，分别为20℃、25℃；
-5℃到20℃的升温时间为30-120分钟、在20℃的保温时间为10-60分钟；
20℃到25℃的升温时间为5-15分钟、在25℃的保温时间为120-620分钟。
优选地，按照重量份数计，所述缓冲液包括如下组分：HEPES 1.0-10份、氯化钠5-10份、氯化钾0.5-5份、硫酸镁0.1-10份、BSA 4.0-30份、海藻糖10-100份、甘氨酸4.0-20份、Casein 0.5-25份、甘油20-200份。
优选地，按照重量份数计，所述缓冲液包括如下组分：HEPES 3.0-10份、氯化钠9份、氯化钾0.5-5份、硫酸镁0.1-10份、BSA 4.0-27份、海藻糖10-100份、甘氨酸4.0-18份、Casein 0.5-25份、甘油20-200份。
优选地，所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取HEPES、NaCl、KCl、MgSO4、海藻糖、牛血清白蛋白、甘氨酸、酪蛋白、甘油依次加入到纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值，并定容至1000ml；
(2)使用滤膜进行过滤，即得缓冲液。
优选地，所述pH值在6.5-8.2之间。
优选地，所述滤膜孔径为0.22μm。
与现有技术比，本发明的技术优势在于：
1.本发明提供的冻干方法使用特殊的缓冲体系能够有效提高S100-β的保存效果，可使S100-β在常温(10-30℃)环境下可以保持活性7天，4-8℃储存期达到12个月、在-20℃储存期达到3年。
2.本发明提供的冻干方法及缓冲液能够提高S100-β检测试剂的检测灵敏度。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
一种中枢神经特异性蛋白(S100-β)的冻干方法，包括以下步骤：
(1)制备缓冲液
所述缓冲液包括如下组分：HEPES 1.0g、氯化钠7g、氯化钾1g、硫酸镁3g、BSA 30g、海藻糖30g、甘氨酸10g、Casein 15g、甘油100ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
称取HEPES、NaCl、KCl、MgSO4、海藻糖、牛血清白蛋白、甘氨酸、酪蛋白、甘油依次加入到纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值至7.1，并定容至1000ml；使用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，即得缓冲液。
(2)取S100-β重组蛋白以缓冲液将其溶解，充分混合后配制成6个浓度的S100-β试剂作为校准品，浓度为0ng/mL、1ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL。
(3)将不同浓度的冻干品放入真空冷冻干燥机的冻干仓内，按照表1设计好的程序进行冻干。冻干后，在4-8℃环境下保存。
表1冻干程序
Figure BDA0003012933380000041
Figure BDA0003012933380000051
实施例2
一种中枢神经特异性蛋白(S100-β)的冻干方法，包括以下步骤：
(1)制备缓冲液
所述缓冲液包括如下组分：HEPES 10g、氯化钠5g、氯化钾5g、硫酸镁10g、BSA4.0g、海藻糖100g、甘氨酸4.0g、Casein 25g、甘油20ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
称取HEPES、NaCl、KCl、MgSO4、海藻糖、牛血清白蛋白、甘氨酸、酪蛋白、甘油依次加入到纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值至8.2，并定容至1000ml；使用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，即得缓冲液。
(2)取S100-β重组蛋白以缓冲液将其溶解，充分混合后配制成6个浓度的S100-β试剂作为校准品，浓度为0ng/mL、1ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL。
(3)将不同浓度的冻干品放入真空冷冻干燥机的冻干仓内，按照表2设计好的程序进行冻干。冻干后，在4-8℃环境下保存。
表2冻干程序
Figure BDA0003012933380000052
实施例3
一种中枢神经特异性蛋白(S100-β)的冻干方法，包括以下步骤：
(1)制备缓冲液
所述缓冲液包括如下组分：HEPES 3.0g、氯化钠9g、氯化钾0.5g、硫酸镁0.1g、BSA27g、海藻糖10g、甘氨酸18g、Casein 0.5g、甘油200ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
称取HEPES、NaCl、KCl、MgSO4、海藻糖、牛血清白蛋白、甘氨酸、酪蛋白、甘油依次加入到纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5，并定容至1000ml；使用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，即得缓冲液。
(2)取S100-β重组蛋白以缓冲液将其溶解，充分混合后配制成6个浓度的S100-β试剂作为校准品，浓度为0ng/mL、1ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL。
(3)将不同浓度的冻干品放入真空冷冻干燥机的冻干仓内，按照表3设计好的程序进行冻干。冻干后，在4-8℃环境下保存。
表3冻干程序
Figure BDA0003012933380000061
对比例1
与实施例1相比，区别仅在于缓冲液的组成不同。
将海藻糖替换为甘露糖，其余步骤不变。
一种中枢神经特异性蛋白(S100-β)的冻干方法，包括以下步骤：
(1)制备缓冲液
所述缓冲液包括如下组分：HEPES 1.0g、氯化钠7g、氯化钾1g、硫酸镁3g、BSA 30g、甘露糖30g、甘氨酸10g、Casein 15g、甘油100ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
称取HEPES、NaCl、KCl、MgSO4、甘露糖、牛血清白蛋白、甘氨酸、酪蛋白、甘油依次加入到纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值至7.1，并定容至1000ml；使用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，即得缓冲液。
(2)-(3)步骤同实施例1。
对比例2
与实施例1相比，区别仅在于缓冲液的组成不同。
将甘氨酸替换为赖氨酸，其余步骤不变。一种中枢神经特异性蛋白(S100-β)的冻干方法，包括以下步骤：
(1)制备缓冲液
所述缓冲液包括如下组分：HEPES 1.0g、氯化钠7g、氯化钾1g、硫酸镁3g、BSA 30g、海藻糖30g、赖氨酸10g、Casein 15g、甘油100ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
称取HEPES、NaCl、KCl、MgSO4、海藻糖、牛血清白蛋白、赖氨酸、酪蛋白、甘油依次加入到纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值至7.1，并定容至1000ml；使用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，即得缓冲液。
(2)-(3)步骤同实施例1。
对比例3
与实施例1相比，区别仅在于缓冲液中海藻糖和甘氨酸的用量不同。
海藻糖5g、甘氨酸35g；其余步骤不变。
一种中枢神经特异性蛋白(S100-β)的冻干方法，包括以下步骤：
(1)制备缓冲液
所述缓冲液包括如下组分：HEPES 1.0g、氯化钠7g、氯化钾1g、硫酸镁3g、BSA30g、海藻糖5g、甘氨酸35g、Casein 15g、甘油100ml。
所述缓冲液的制备方法，步骤同实施例1。
对比例4
与实施例1相比，区别仅在于冷冻程序不同。
表4冻干程序
Figure BDA0003012933380000081
效果例
1.检测方法
采用北京美联泰科生物技术有限公司自研的全自动化学发光免疫分析仪进行检测(其它市售产品亦可)。反应所需样本量为30μL，自动检验流程为：
①免疫反应：将30μL样本、50μL试剂A、50μL试剂B、50μL试剂C依次加入反应孔位，在37℃条件下反应20min。
②磁分离及清洗：在1号清洗孔位加入300μL清洗液，将含磁微粒的混合物用磁力吸出反应孔位，在1号清洗孔位脱磁。清洗2min后。在2号和3号清洗孔位分别进行1次磁分离及清洗。
③读值：在测读孔位加入150uL发光底物，将含磁微粒的混合物用磁力吸出3号清洗孔位，在测读孔位脱磁。ALP催化的发光底物发光后检测相对发光强度(RLU)。
④根据检测的校准品数值可获得一条S100-β浓度-发光值标准曲线。该曲线使用四参数Logistic方程拟合。
⑤样本的检测值可以和这条曲线上获得唯一的浓度值对应，从而实现对未知样本的浓度检测。
2.检测指标
2.1外观
冻干品应为白色、无杂质的疏松体。冻干物质整体应为上、下等宽的柱状体，上表面不应出现裂痕、下表面不应出现收缩。整体不应出现明显气孔。复溶后液体均匀(无肉眼可见颗粒、无沉淀)视为合格。
2.2浓度偏差
使用中枢神经特异性蛋白检测试剂盒(磁微粒化学发光法)对六个浓度的冻干品进行检测，进行双平行测试。按照设置完成的程序运行，结束后读取发光值，将浓度和发光值输入仪器进行拟合。按公式(1)进行计算。浓度偏差应满足：B点浓度在瓶标浓度±12％范围内；C点、D点、E点、F点在瓶标浓度±8％范围内。视为合格。
浓度偏差＝(拟合浓度-瓶标浓度)/瓶标浓度…………………(1)
2.3含水量
取10个不同浓度的冻干品。将冻干品去除顶盖和胶塞后称重，记为M1n(n＝1、2、3……10)。将其在200℃条件下进行烘干，直至质量不再发生变化为止，再次称重，记为M2n(n＝1、2、3……10)。将这些装有样品的冻干瓶将依次清洗干净，在200℃条件下进行烘干，直至质量不再发生变化为止，对这些冻干瓶依次称重，记为M3n(n＝1、2、3……10)。按公式(2)进行计算。冻干品含水量应小于2％。视为合格。
含水量＝[(M1n-M3n)/(M2n-M3n)]-1×100％…………………(2)
2.4准确度
将浓度约为20ng/mL(允许偏差±10％)的中枢神经特异性蛋白(S100-β)液(A)加入到浓度范围0ng/mL-0.1ng/mL的样本B中，所加入S100-β抗原与样本B之间的体积比例为1:9，使用冻干品和配套的中枢神经检测试剂盒(磁微粒化学发光法)进行检测。根据公式(3)计算回收率R，其回收率应在85％～115％范围内。视为合格。
Figure BDA0003012933380000091
式中：
R—回收率；
V—样品A液的体积；
V0—血清样品B液的体积；
C—血清样品B液加入A液后的3次测量平均值；
C0—血清样品B液的3次测量平均值；
CS—样品A液的浓度。
2.5线性区间
将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本混合成不少于5个稀释浓度，其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值，记录各样品的测量结果，并计算各样品3次测量值的平均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(2)计算线性回归的相关系数(r)，在0.1～150ng/mL的线性区间内，相关系数r应≥0.990。视为合格。
Figure BDA0003012933380000101
式中：
r————相关系数；
xi————稀释比例；
yi————各个样本测定结果均值；
Figure BDA0003012933380000102
————稀释比例的均值；
Figure BDA0003012933380000103
————样本测定结果总均值。
2.6重复性
重复测试冻干品C点10次，计算10次测试结果的平均值
Figure BDA0003012933380000104
和标准差SD。按公式(5)计算变异系数(CV)，结果CV≤8％。视为合格。
Figure BDA0003012933380000105
式中：s——样本测试值的标准差；
Figure BDA0003012933380000111
——样本测试值的平均值。
2.7稳定性效果
实验方法：在不同的条件下(4-8℃设置0个月、3个月、6个月、9个月、12个月五个时间节点；-20℃设置0个月、6个月、12个月、18个月、24个月、36个月六个时间点)使用上述2.1-2.6记载的指标检测方法进行试验，2.1-2.6六个指标中，每合格一个指标计1分，六个指标均合格者为6分即为满足有效期条件。试验结果见下表：
表5稳定性效果数据
Figure BDA0003012933380000112
由此可知，本发明提供的缓冲液及冻干方法可以使S100-β在4-8℃下能有效保存12个月，-20℃下有效保存36个月。当改变缓冲液体系或者冻干方法时，其性能稳定性受到不同程度的影响。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种中枢神经特异性蛋白的冻干方法，包括以下步骤：取缓冲液将S100-β溶解，制成S100-β试剂，放入真空冷冻干燥机内进行冻干；将真空冷冻干燥机设置成三个阶段，分别为预冷冻段、升华干燥段、解析干燥段；冻干后，在4-8℃环境下保存；
所述预冷冻段为：将S100-β试剂从常温降温至0℃；降温时间为5-30分钟；
在0℃保温2-10分钟后，再降温至-30℃，降温时间为5-30分钟；
在-30℃保温5-60分钟后，再降温至-55℃，降温时间为5-30分钟；在-55℃保温30-240分钟；
所述解析干燥段为：设置两个温度点，分别为20℃、25℃；
-5℃到20℃的升温时间为30-120分钟、在20℃的保温时间为10-60分钟；
20℃到25℃的升温时间为5-15分钟、在25℃的保温时间为120-620分钟；
其中，所述缓冲液由如下组分制成：HEPES、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、BSA、海藻糖、甘氨酸、Casein、甘油、纯化水；
按照重量份数计，所述缓冲液包括如下组分：HEPES 1.0-10 份、氯化钠5-10 份、氯化钾 0.5-5 份、硫酸镁0.1-10 份、BSA 4.0-30 份、海藻糖10-100 份、甘氨酸4.0-20份、Casein 0.5-25 份、甘油20-200 份；
所述缓冲液的pH值在6.5-8.2之间。
2.如权利要求1所述的冻干方法，其特征在于，所述升华干燥段为：将真空度在1-5分钟内降至0-5帕斯卡（pa）；设置7个温度点，分别为-50℃、-45℃、-35℃、-30℃、-25℃、-25℃、-5℃；-55℃到-50℃的升温时间为2-10分钟、在-50℃的保温时间为10-60分钟；
-50℃到-45℃的升温时间为10-60分钟、在-45℃的保温时间为30-120分钟；
-45℃到-35℃的升温时间为10-60分钟、在-35℃的保温时间为30-240分钟；
-35℃到-30℃的升温时间为2-60分钟、在-30℃的保温时间为30-480分钟；
-30℃到-25℃的升温时间为2-60分钟、在-25℃的保温时间为30-240分钟；
-25℃到-15℃的升温时间为5-60分钟、在-15℃的保温时间为30-120分钟；
-15℃到-5℃的升温时间为5-30分钟、在-5℃的保温时间为10-60分钟。
3.如权利要求1所述的冻干方法，其特征在于，按照重量份数计，所述缓冲液包括如下组分：HEPES 3.0-10 份、氯化钠9 份、氯化钾 0.5-5 份、硫酸镁0.1-10 份、BSA 4.0-27份、海藻糖10-100 份、甘氨酸4.0-18 份、Casein 0.5-25 份、甘油20-200 份。
4.如权利要求1所述的冻干方法，其特征在于，所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
（1）称取HEPES、NaCl、KCl、MgSO4、海藻糖、牛血清白蛋白、甘氨酸、酪蛋白、甘油依次加入到纯化水中搅拌至完全溶解，调节pH值，并定容至1000ml；
（2）使用滤膜进行过滤，即得缓冲液。
5.如权利要求4所述的冻干方法，其特征在于，所述滤膜孔径为0.22μm。
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