CN112662735A

CN112662735A - 一种抗凝血酶ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法

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Publication number: CN112662735A
Application number: CN202011606658.9A
Authority: CN
Inventors: 邹红建; 胡军; 隋延锋
Original assignee: Beijing Mdc New Spring Medical Devices Co ltd
Current assignee: Beijing Mdc New Spring Medical Devices Co ltd
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN112662735B

Abstract

本发明涉及临床检验领域，特别涉及一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法。该试剂盒的制备原料包括稀释缓冲液、凝血酶试剂和发色底物试剂；稀释缓冲液为含有苯扎溴铵的生理盐水；凝血酶试剂包括凝血酶、肝素钠、海藻糖、氯化钠和缓冲液；发色底物试剂包括发色底物、乳糖、海藻糖和缓冲液。本发明中稀释缓冲液添加苯扎溴铵，能改变血浆中纤维蛋白原的结构或状态，避免纤维蛋白原干扰凝血酶裂解底物的反应速率，提高检测抗凝血酶III活性的准确性。

Description

一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及临床检验领域，特别涉及一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

正常人体内血液凝固过程的促进与抑制，二者处于动态平衡状态。作为人体内最重要的抗凝物质，抗凝血酶Ⅲ(以下简称AT-III)控制着血液凝固和纤维蛋白溶解的过程，从而维持机体的凝血平衡，因此AT-III活性的变化是诊断弥漫性血管内凝血(DIC)、肝硬化、败血症、血栓形成性疾病(心肌梗塞，静脉血栓形成等)、先天性AT-Ⅲ缺陷、血友病、再生障碍性贫血的重要指标。

AT-III是一种球蛋白，在肝内合成。研究表明抗凝血酶Ⅲ的含量或者活性低既有遗传性的也有获得性的。先天性遗传引起的血液中抗凝血酶Ⅲ缺乏又分为I型和II型，I型抗凝血酶Ⅲ缺乏的特征是抗凝血酶Ⅲ合成的降低，血液中抗凝血酶Ⅲ含量和活性均降低。II型抗凝血酶Ⅲ缺乏的特征是抗凝血酶Ⅲ合成正常，血液中抗凝血酶Ⅲ含量正常，但由于部分抗凝血酶Ⅲ功能丧失，表现出抗凝血酶Ⅲ活性降低。获得性的抗凝血酶Ⅲ含量或者活性低的原因有多种，例如肝病引起的抗凝血酶Ⅲ合成减少；肾病引起的抗凝血酶Ⅲ流失；肝素等药物引起的抗凝血酶Ⅲ损失，以及弥散性血管内凝血引起的抗凝血酶Ⅲ消耗。无论是遗传性的还是获得性的抗凝血酶Ⅲ缺失症都给患者带来血栓的风险，给他们的健康和生命带来难以预测的威胁。抗凝血酶Ⅲ活性的检测在先天性抗凝血酶Ⅲ缺陷或异常的临床诊断具有非常重要的意义。

目前检测抗凝血酶Ⅲ的方法有两种，一种为检测抗凝血酶Ⅲ抗原的含量，如免疫分析法，此法方法比较特异和灵敏，但是操作繁琐、耗时，而且无法测定II型抗凝血酶Ⅲ缺乏；另一种为检测抗凝血酶Ⅲ的活性，如凝固法和发色底物法，凝固法是通过血浆凝固时间来测定样本中AT-Ⅲ活性，由于受影响的因素较多，因此特异性，准确度较差，而且操作繁琐。目前，在市场销售的试剂盒中，底物发色法是测定血浆中抗凝血酶Ⅲ活性的通用方法，此法具有灵敏度高、准确性好、检测时间短等特点，且能够适用于多种自动化分析仪器，临床上已被广泛应用。

底物发色法的原理：抗凝血酶Ⅲ(AT-III)是一种多功能的丝氨酸蛋白酶抑制物，是凝血酶(FⅡa)与活化的凝血因子Ⅶ、Ⅺ、Ⅹ等蛋白酶的抑制剂。在过量的丝氨酸蛋白酶存在下，血浆中的抗凝血酶Ⅲ与丝氨酸蛋白酶形成1： 1的复合物从而抑制此蛋白酶的活性，剩余的没有和抗凝血酶Ⅲ形成复合物的蛋白酶作用于特异的发色底物，将底物裂解产生4-硝基苯胺(4-nitroaniline， pNA)显色基团，4-硝基苯胺的浓度和其在405nm处的吸光度的变化呈正相关，而产生的4-硝基苯胺的量与抗凝血酶Ⅲ的活性成反比。因此，通过检测405nm 处吸光度的变化，可计算出血浆中抗凝血酶Ⅲ的活性水平。

美国专利US5546007和中国专利CN102690862A公开了一种以凝血酶为基础的发色底物法检测抗凝血酶Ⅲ活性的试剂盒，两者分别对离子浓度的优化和肝素衍生物的筛选，达到降低肝素辅因子Ⅱ(HCⅡ)干扰抗凝血酶Ⅲ活性测定的影响，但是凝血酶与发色底物在水溶液下不稳定，不宜久存。此外，中国专利CN106153612A发表了一种以活化因子X(FXa)为基础的发色底物法测定抗凝血酶Ⅲ活性的试剂盒，此法避免了样本中肝素辅因子以及药物水蛭素、阿加曲班、达比加群等抗凝血因素的干扰。然而活化因子X(FXa)极易失活，价格昂贵，增加试剂盒制作成本。

无论是以凝血酶为基础的，还是以活化因子X(FXa)为基础的底物发色法，都要求过量的凝血酶或FXa存在，根据凝血瀑布学说，血浆中其他凝血因子或多或少均能消耗或灭活凝血酶和活化因子X的活性，从而干扰抗凝血酶Ⅲ活性的检测。

目前的发色底物法检测抗凝血酶III活性的手段仍有待改进。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法。本发明通过优化条件和筛选特定添加剂，提供一种基于凝血酶与显色基质相互作用的抗凝血酶III活性检测试剂盒，此试剂盒具有稳定性好，灵敏度高，抗干扰性强，批间差小以及使用方便等诸多优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒，该试剂盒的制备原料包括稀释缓冲液、凝血酶试剂和发色底物试剂；

稀释缓冲液为含有苯扎溴铵的生理盐水；

凝血酶试剂包括凝血酶、肝素钠、海藻糖、氯化钠和缓冲液；

发色底物试剂包括发色底物、乳糖、海藻糖和缓冲液。

血浆样本中肝素辅因子Ⅱ或抗凝血酶Ⅲ能捕获凝血酶的催化活性位点，从而抑制凝血酶催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，起到抗凝作用。然而，基于凝血酶与其发色底物的相互反应的原理，肝素通过增强抗凝血酶III活性，形成1:1抗凝血酶III-凝血酶复合物而抑制凝血酶的活性，剩余的凝血酶作用于底物，解离出发色基团。相比于底物，血浆样本中存在大量的纤维蛋白原，而纤维蛋白原同样能与凝血酶相互作用，从而消耗凝血酶的活性，导致检测抗凝血酶III活性的结果偏高。

为了避免血浆样本中纤维蛋白原干扰抗凝血酶III活性的检测的影响，本发明稀释缓冲液，一方面能够稀释样本，降低样本中微量的、能影响凝血酶活性的其他凝血因子(如HCⅡ)的干扰，降低对凝血酶的抑制作用，并且减少试剂盒中凝血酶和底物的浓度，节约生产成本；另一方面，稀释缓冲液包含表面活性剂苯扎溴铵，能与纤维蛋白原形成络合物，使其构象发生变化，无法捕获凝血酶的催化活性位点，从而消除干扰抗凝血酶III活性检测的影响。而且对凝血酶活性无影响，从而提高了检测抗凝血酶III活性的准确度。

作为优选，稀释缓冲液中苯扎溴铵的浓度为0.01w/v％～0.2w/v％。

作为优选，凝血酶试剂中各组分浓度为：凝血酶3～6U/mL、肝素钠 2～5U/mL、海藻糖8w/v％～16w/v％、氯化钠0.9w/v％～w/v3％、缓冲液余量。

作为优选，凝血酶试剂还包括赖氨酸盐酸盐、蛋白质稳定剂Ⅱ和

作为优选，凝血酶试剂中各组分浓度为：凝血酶3～6U/mL、肝素钠 2～5U/mL、海藻糖8w/v％～16w/v％、氯化钠0.9w/v％～3w/v％、赖氨酸盐酸盐 0.05w/v％～0.5w/v％、蛋白质稳定剂Ⅱ0.05v/v％～0.8v/v％、

0.1 v/v％～2v/v％、缓冲液余量。

作为优选，凝血酶为牛凝血酶。

作为优选，发色底物试剂中各组分浓度为：发色底物0.4～2mmol/L、硫柳汞钠0.06w/v％～0.2w/v％、乳糖2w/v％～8w/v％、海藻糖4w/v％～10w/v％、缓冲液余量。

作为优选，防腐剂为硫柳汞钠。

作为优选，发色底物选自H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl(S2238)、 CH₃OCO-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-D-CHG-Ala-Arg-pNA·AcOH(PA2493)中的一种或几种。

作为优选，缓冲液为25～100mmol/L、pH 7.4～8.4的Tris-HCl缓冲液。

本发明还提供了该试剂盒的制备方法，分别配制稀释缓冲液、凝血酶试剂和发色底物试剂，将凝血酶试剂和发色底物试剂冷冻干燥。

本发明提供了一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法。该试剂盒的制备原料包括稀释缓冲液、凝血酶试剂和发色底物试剂；稀释缓冲液为含有苯扎溴铵的生理盐水；凝血酶试剂包括凝血酶、肝素钠、海藻糖、氯化钠和缓冲液；发色底物试剂包括发色底物、乳糖、海藻糖和缓冲液。本发明的优点如下：

本发明中稀释缓冲液添加苯扎溴铵，能改变血浆中纤维蛋白原的结构或状态，避免纤维蛋白原干扰凝血酶裂解底物的反应速率，提高检测抗凝血酶III 活性的准确性；

本发明中，在凝血酶试剂中还可以进一步优化添加剂赖氨酸盐酸盐、蛋白质稳定剂Ⅱ和

不仅可提高凝血酶水溶液的稳定性，还可以增强用于检测抗凝血酶III活性的精密度；

针对凝血酶和发色底物在水溶液中通常不稳定，不能长时间保存的问题，采用特定的添加剂，能够有效地提高凝血酶和发色底物在水溶液中的稳定性，并且以干粉型外观形态存在，将更有利于增强其稳定性；

试验表明，本发明AT-III活性测定试剂盒具有优异的性能，在2-8℃下稳定18个月，相对偏差在-4.8％～+5.2％，精密度CV值：6.3％；瓶间差一致性好，其CV值：3.6％；线性范围[3.6％，130％]，其相关性R²>0.99；试剂盒复溶后在 37℃下能稳定维持24h，在25℃下能够稳定保存55天，在2℃～8℃下至少稳定保存90天；稳定性高。

附图说明

图1-1不同浓度表面活性剂对纤维蛋白原的影响；

图1-2实施例1和实施例2的定标曲线；

图2抗凝血酶III活性的标准曲线；

图3抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒的相关性；

图4抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒的线性；

图5抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒的机型差图。

具体实施方式

本发明公开了一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法中所用制备原料药或仪器均可由市场购得。其中，蛋白质稳定剂Ⅱ购自湖州英创生物科技有限公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

稀释缓冲液的制备：称取0.075g苯扎溴铵，溶于100mL生理盐水。

凝血酶试剂的制备：其各组分配比为4.5U/mL牛凝血酶，3.5U/mL肝素钠，12％(w/v)海藻糖，0.25％(w/v)赖氨酸盐酸盐，2％(w/v)氯化钠， 0.4％(v/v)蛋白质稳定剂Ⅱ，1％(v/v)

60mmol/L、pH8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

底物试剂的制备：配制含0.1％(w/v)硫柳汞钠、5％(w/v)乳糖、7％ (w/v)海藻糖的75mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0；最后，加入凝血酶底物 PA2493，搅拌混匀，至浓度为1.2mmol/L。

上述的凝血酶试剂和底物试剂配制完成后，经分装、冷冻干燥，制成冻干粉。

实施例2

稀释缓冲液的制备：100mL生理盐水。

60mmol/L、pH8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

实施例3

凝血酶试剂的制备：其各组分配比为4.5U/mL牛凝血酶，3.5U/mL肝素钠，12％(w/v)海藻糖，0.25％(w/v)氯化钠，60mmol/L、pH8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

实施例4

稀释缓冲液的制备：称取0.025g苯扎溴铵，溶于100mL生理盐水。

凝血酶试剂的制备：其各组分配比为3U/mL牛凝血酶，2U/mL肝素钠， 8％(w/v)海藻糖，0.05％(w/v)赖氨酸盐酸盐，0.9％(w/v)氯化钠，0.05％(v/v)蛋白质稳定剂Ⅱ，0.1％(v/v)

25mmol/L、pH7.4三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

底物试剂的制备：配制含0.06％(w/v)硫柳汞钠、2％(w/v)乳糖、4％ (w/v)海藻糖的50mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.4；最后，加入凝血酶底物 PA2493，搅拌混匀，至浓度为0.4mmol/L。

实施例5

稀释缓冲液的制备：称取0.05g苯扎溴铵，溶于100mL生理盐水。

凝血酶试剂的制备：其各组分配比为6U/mL牛凝血酶，5U/mL肝素钠， 16％(w/v)海藻糖，0.5％(w/v)赖氨酸盐酸盐，3％(w/v)氯化钠，0.8％ (v/v)蛋白质稳定剂Ⅱ，2％(v/v)

100mmol/L、pH8.4三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

底物试剂的制备：配制含0.2％(w/v)硫柳汞钠、8％(w/v)乳糖、10％(w/v)海藻糖的100mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.4；最后，加入凝血酶底物PA2493，搅拌混匀，至浓度为2mmol/L。

实施例6

稀释缓冲液的制备：称取0.1g苯扎溴铵，溶于100mL生理盐水。

凝血酶试剂的制备：其各组分配比为5.0U/mL牛凝血酶，2.7U/mL肝素钠，10.3％(w/v)海藻糖，0.17％(w/v)赖氨酸盐酸盐，2.1％(w/v)氯化钠， 0.30％(v/v)蛋白质稳定剂Ⅱ，0.7％(v/v)

39mmol/L、pH8.1三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

底物试剂的制备：配制含0.12％(w/v)硫柳汞钠、5.5％(w/v)乳糖、 6％(w/v)海藻糖的68mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.8；最后，加入凝血酶底物PA2493，搅拌混匀，至浓度为1.5mmol/L。

实施例7抗凝血酶Ⅲ活性测定的操作

本发明所述的抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒，复溶，采用TECO 1800全自动凝血分析仪，按照制造商所提供的说明书进行参数设置：样本(校准品、质控品或血浆)与稀释缓冲液试剂按1:40混合，并取出一定体积的混合液，加入等体积的凝血酶试剂混合并孵育2min，再加入凝血酶底物试剂混合并孵育25s，在405nm波长照射下，读取待测样品中发色底物的信号强度(吸光度OD值)；最后通过计算信号强度并和已知浓度标准品的标准曲线比对得到血液中抗凝血酶Ⅲ的活性。

试验例1本发明所述的抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒的性能评价

1.干扰物纤维蛋白原的影响

将已知AT-Ⅲ活性为104％的德国TECO公司通用校准品，用生理盐水等比例稀释一系列浓度(104％、52％、26％、13％)，并且该校准品含有266mg/mL 纤维蛋白原，从而也获得了含有纤维蛋白原一系列浓度(266mg/mL、133 mg/mL、66.5mg/mL和33.25mg/mL)样本，配制一系列浓度表面活性剂如实施例1、实施例2、实施例4、实施例5和实施例6试剂盒检测上述样本AT- Ⅲ活性所对应的吸光度OD值，每个样本重复测试3次求平均值，绘制各实施例的定标曲线，结果见附图1-1，随表面活性剂浓度的增加，定标曲线 R²更趋向于1。

选择实施例1和实施例2检测的数值绘制其实施例的定标曲线结果如图 1-2，而且以此实施例的定标曲线为依据，实施例1和实施例2试剂检测定值血浆，每个样本重复测试3次求平均值，其结果如表1。

表1实施例1和实施例2检测定值血浆

由图1-1、图1-2所示，实施例1定标曲线的线性R²＝0.998，明显优于实施例2，并且随着稀释倍数的增加，样本中纤维蛋白原的浓度随着减少，实施例1和实施例2的吸光度高度吻合一致，即可优化样本的稀释倍数以及在稀释液中添加纤维蛋白原的表面活性剂，能消除纤维蛋白原影响凝血酶裂解底物的反应速率，从而提高试剂盒检测血浆样本AT-III活性的准确度，由表 1可看出，实施例1检测正常、异常血浆AT-III活性结果的相对偏差分别为 0.4％和-2.54％，明显优于实施例2。由此表明该表面活性剂能使本发明试剂盒检测AT-III活性不受纤维蛋白原的干扰。

2.稳定凝血酶组合物对凝血酶稳定性的影响

将实施例1和实施例3的试剂盒分别分成三组，复溶，分别放置在2℃～8℃、25℃和37℃条件下，间隔一定时间，按照抗凝血酶Ⅲ活性测定的操作方法，由同一个或一组操作者在同一台仪器上进行，对正常质控血浆和异常质控血浆进行检测，记录检测结果吸光度OD值的变化，判断试剂盒的凝血酶活性是否降低，如表2：

表2-1抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒在2℃～8℃的稳定性

表2-2抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒在25℃的稳定性

表2-3抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒在37℃的稳定性

表2结果分别表明，实施例1试剂复溶后在2℃～8℃下凝血酶活性至少 90天以上无明显丧失；在25℃下能够稳定保存55天；在37℃下能稳定维持活性20h，明显优于实施例3试剂盒的凝血酶的稳定性，说明本发明所提供的的组合物(赖氨酸盐酸盐、蛋白质稳定剂Ⅱ和

)能长期地维持凝血酶的稳定性。

试验例2本发明试剂盒的分析性能评估

1.实施例1定标标准曲线的绘制

将校准品用生理盐水稀释一系列浓度(104％、52％、26％、13％)，用实施例1所述的抗凝血酶III活性检测试剂盒，在TECO 1800凝血分析仪上检测校准品溶液的OD值，以OD值为纵坐标，以相应的抗凝血酶Ⅲ活性值为横坐标，绘制标准曲线，如图2所示。

由图2所示，本发明试剂盒以凝血酶的发色底物法基础，其检测的吸光度OD值与相应的抗凝血酶Ⅲ活性呈现良好的线性关系，线性关系用函数定义为Y＝-0.0029X+0.0375，R²＝0.9985。

2.实施例1精密度的检测

按照抗凝血酶Ⅲ活性测定的操作方法，由同一个或一组操作者在同一台仪器上进行，对正常质控血浆和异常质控血浆重复侧定10次，计算测定值的均数、标准差和变异系数CV，如下：

表3抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒的精密度

变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。表3结果所示，本发明试剂盒检测正常质控血浆抗凝血酶Ⅲ活性时其CV值为3.25％；异常质控血浆抗凝血酶Ⅲ活性时其 CV为5.91％，表明本发明试剂盒具有优良的精密度。

3.实施例1批间差的检测

取出三个批号的本发明试剂盒，复溶，按照抗凝血酶Ⅲ活性测定的操作方法，由同一个或一组操作者在同一台仪器上进行，分别对正常质控血浆和异常质控血浆AT-Ⅲ活性进行10次检测，计算测定值的均数、标准差和变异系数CV，如下：

表4-1抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒检测正常质控血浆的批间差

表4-2抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒检测异常质控血浆的批间差

变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。表4结果所示本发明试剂盒检测正常值质控血浆和异常值质控血浆的精密度(CV％)值分别为4.69％和6.38％，表明本发明试剂盒具有优良的批间差。

4.实施例1批内差的检测

用10盒同一批次本发明试剂盒，复溶，按照抗凝血酶Ⅲ活性测定的操作方法，由同一个或一组操作者在同一台仪器上进行，分别对正常质控血浆和异常质控血浆进行测定，即：任选一盒对质控血浆测定10次，同时每盒都对质控血浆检测1次，计算测定值的均数、标准差和变异系数CV，如下：

表5-1抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒检测正常值质控血浆的批内差

表5-2抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒检测异常值质控血浆的批内差

表5结果所示本发明试剂盒检测正常值质控血浆和异常值质控血浆的精密度(CV％)值分别为2.96％和7.81％，表明本发明试剂盒具有优良的批内差。

5.实施例1与市售进口试剂盒的相关性的检测

本发明试剂盒与市售试剂盒分别在TECO1800全自动生化分析仪上，对 170份新鲜血浆样本(包含正常和异常样本)进行AT-III活性的检测，并对测定值进行相关分析(结果见图，X轴表示市售试剂盒A的测定值，Y轴表示本发明试剂盒的测定值)。

图3表明，本发明试剂盒与市售试剂盒相关线性方程为：y＝0.949x+ 5.5011，相关系数：R²＝0.944，虽然个别正常值样本偏差稍大以及异常值血浆样本较少，造成整体相关系数不好，但是检测结果的阴、阳性基本符合，结果表明本发明试剂盒与市售试剂盒A相关性良好。

6.实施例1线性范围的检测

将活性为144％的AT-III样本稀释如下：129.6％、115.2％、100.8％、86.4％、72％、57.6％、43.2％、28.8％、14.4％、7.2％和3.6％，每个稀释样本重复测试 4次，分别求出测定结果的均值。以稀释度为自变量，测定结果均值为因变量求出线性回归方程和相关系数R，如图4。

由图4所示，线性回归方程y＝136.5x+3.3683，R＝0.992，故本发明试剂的线性范围：3.6％～140％。

7.实施例1试剂盒抗干扰性的检测

取4份混合血浆，其中一份作为对照，其他三份分别加入3种潜在干扰物：胆红素(Db)、血红蛋白(Hb)、甘油三酯(乳糜)，每种干扰物配制两个或三个浓度梯度，用实施例1试剂盒对血浆样本AT-Ⅲ活性进行重复测定4次，求均值，结果如表6所示：

表6抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒的抗干扰性

由表6所示，在分别含有30mg/dL胆红素、200mg/dL血红蛋白和5000 mg/dL乳糜的各个血浆样本中，本发明试剂盒检测血浆样本AT-Ⅲ活性与空白血浆样本的结果对比，其相对偏差分别为1.81％、-0.55％和-3.15％，即均无抑制效果，表明该试剂盒有良好特异性。

8.实施例1试剂盒机型差的检测

用实施例1试剂盒分别在TOP 700和TECO 1800上完成定标，并以各自仪器上的定标曲线为依据，检测22个血浆样本，并且该血浆样本AT-Ⅲ活性范围[66％，128％]，其检测的结果如表7。为了分析本发明试剂盒在上述两种仪器上检测血浆样本AT-Ⅲ活性的机型差，以TOP 700仪器检测AT-Ⅲ活性的结果为横坐标，TECO 1800仪器检测的结果为纵坐标，绘制机型差曲线图5。

表7抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒的机型差

表7表明，本发明试剂盒分别在TOP 700和TECO 1800仪器上检测血浆样本AT-Ⅲ活性结果相对比，其相对偏差基本上均在±5％之间，而且图5反映出本发明试剂盒在此两种仪器上检测血浆样本AT-Ⅲ活性的相关性R²＝0.9765，故本发明试剂盒的机型差较小。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的制备原料包括稀释缓冲液、凝血酶试剂和发色底物试剂；

所述稀释缓冲液为含有苯扎溴铵的生理盐水；

所述凝血酶试剂包括凝血酶、肝素钠、海藻糖、氯化钠和缓冲液；

所述发色底物试剂包括发色底物、防腐剂、乳糖、海藻糖和缓冲液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释缓冲液中苯扎溴铵的浓度为0.01w/v％～0.2w/v％。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述凝血酶试剂中各组分浓度为：凝血酶3～6U/mL、肝素钠2～5U/mL、海藻糖8w/v％～16w/v％、氯化钠0.9w/v％～3w/v％、缓冲液余量。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述凝血酶试剂还包括赖氨酸盐酸盐、蛋白质稳定剂Ⅱ和

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述凝血酶试剂中各组分浓度为：凝血酶3～6U/mL、肝素钠2～5U/mL、海藻糖8w/v％～16w/v％、氯化钠0.9w/v％～3w/v％、赖氨酸盐酸盐0.05w/v％～0.5w/v％、蛋白质稳定剂Ⅱ0.05v/v％～0.8v/v％、

0.1v/v％～2v/v％、缓冲液余量。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述凝血酶为牛凝血酶。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发色底物试剂中各组分浓度为：发色底物0.4～2mmol/L、防腐剂0.06w/v％～0.2w/v％、乳糖2w/v％～8w/v％、海藻糖4w/v％～10w/v％、缓冲液余量。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述发色底物选自H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl、CH₃OCO-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-D-CHG-Ala-Arg-pNA·AcOH中的一种或几种。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为25～100mmol/L、pH 7.4～8.4的Tris-HCl缓冲液。

10.权利要求1至9中任一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于，分别配制稀释缓冲液、凝血酶试剂和发色底物试剂，将凝血酶试剂和发色底物试剂冷冻干燥。