CN107727587A - 一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学检验技术领域，涉及一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其中：试剂R1包括缓冲液、稳定剂、盐、表面活性剂、防腐剂、海藻糖、肝素和凝血酶；试剂R2包括缓冲液、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和发色底物。将样本和去离子水以体积比1:(3‑5)混合，得稀释后样本；取稀释后样本，孵育30‑60s，加入试剂R1，混匀孵育60‑100s，加入试剂R2，混匀后，于405nm波长处检测。

Description

一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物医学检验技术领域，涉及一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒及其检测方法。

背景技术

抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)是一种单链糖蛋白，属于α2球蛋白，AT-Ⅲ具有分解脂蛋白的作用，对凝血系统中几乎所有的活性丝氨酸蛋白酶都有抑制作用。AT-III作为血液中活性凝血因子最重要的阻碍因子，它控制着血液的凝固和纤维蛋白的溶解。血液中抗凝血酶III的水平根据各种疾病、症状而变化。在弥散性血管内凝血(DIC)、肝疾患、肾病综合征等中降低。血液中的抗凝血酶III水平降低可能会导致肝素治疗效果无法呈现。因此，掌握抗凝血酶III的活性作为对于此类疾病的监测、病态分析、预后判定以及肝素治疗或使用抗凝血酶III浓缩制剂投药时的指标具有重要意义。

目前，测定AT-III的方法主要分为三类：免疫学分析方法、凝固法和发色底物法。

免疫学分析方法是通过单向放射免疫扩散法、免疫比浊法以及酶联免疫吸附法测定样本中AT-III的浓度。这种方法比较特异和灵敏，但是操作繁琐、耗时、准确度不高。凝固法是通过血浆凝固时间直接或间接地测定样本中AT-III活性，该方法有多种蛋白酶参与反应，测定易受影响，且操作比较繁琐、费时。发色底物法是在待测血浆中加入过量的凝血酶，凝血酶可与AT-III作用，形成无活性复合物，使凝血酶部分失活，剩余凝血酶作用于发色底物，裂解出显色基团，显色深浅与剩余凝血酶的量呈正相关，而与血浆中AT-III活性呈负相关。由于该方法灵敏度高、准确性好、检测时间短，且能够适用于多种自动化分析仪器，目前，临床上已广泛应用。

但是发色底物法也存在一定的缺陷，该法是通过加入外源性凝血酶来分析样本中AT-III活性，由于样本中也存在另一个肝素催化的凝血酶抑制剂—肝素辅助因子II(HCII)，因而测定剩余凝血酶的活性是凝血酶与AT-III和HCII反应后剩余的活性，因此，该法易受样本中HCII的干扰而导致AT-III的测定不准确。

目前市售试剂主要通过肝素酶降解肝素来降低HCII的干扰，但是该操作复杂，且肝素酶价格昂贵，大大增加了成本。还有一种是通过凝血因子Xa途径，虽然避开了肝素辅助因子Ⅱ的干扰，但是凝血因子Xa不但价格昂贵，而且稳定性较差，试剂灵敏度也没有凝血酶途径高，应用局限性很大。

发明内容

本发明针对现有发光底物法测定抗凝血酶III活性的不足，提供一种AT-III测定试剂盒及其检测方法，该试剂盒成本低廉、抗干扰能力强、灵敏度高、稳定性好，具有较广的应用前景。

为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其中：

试剂R1包括缓冲液、稳定剂、盐、表面活性剂、防腐剂、海藻糖、肝素和凝血酶；

试剂R2包括缓冲液、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和发色底物。

试剂R1中的凝血酶可与抗凝血酶III作用，形成无活性复合物，使凝血酶部分失活，剩余凝血酶作用于R2中的发色底物，发色底物裂解出产色基团，显色深浅与抗凝血酶III活性成负相关。试剂R1中的盐、海藻糖和肝素能够降低肝素辅助因子Ⅱ的干扰，稳定凝血酶，从而提高测量的准确性。

作为优选，所述试剂R1的稳定剂为牛血清蛋白、酪蛋白、明胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、甘露醇、山梨醇中的一种或多种。

进一步优选，所述试剂R1的稳定剂为0.5-10g/L牛血清蛋白(BSA)、1-50g/L明胶、1-50g/L甘露醇的一种或多种。

作为优选，试剂R1中的盐为氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸铵的一种或多种。

进一步优选，试剂R1中的盐为0.05-5mol/L硫酸铵。盐离子的存在，可以降低肝素辅助因子Ⅱ的干扰，但是同时也会降低凝血酶的对发色底物的敏感度。本发明优选0.05-5mol/L的硫酸铵，在此浓度范围内的硫酸铵使凝血酶对发色底物的敏感度降低的不明显，但是显著降低了肝素辅助因子Ⅱ的干扰。

作为优选，试剂R1中海藻糖的浓度为10-50g/L。本发明在试剂R1中添加海藻糖，通过调节海藻糖的浓度，使海藻糖的存在不仅能降低肝素辅助因子Ⅱ的干扰，还对凝血酶有一定的稳定作用。

作为优选，试剂R1中肝素浓度为1-500mg/L。肝素能够激活AT-Ⅲ的反应活性，但是同时也会肝素辅助因子Ⅱ反应活性，当肝素浓度在合适范围内，AT-Ⅲ活性能够被充分激活，而肝素辅助因子Ⅱ得不到充分激活，从而降低肝素辅助因子Ⅱ的干扰。

作为优选，所述试剂R2的稳定剂为牛血清蛋白、明胶、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇、乙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇中的一种或几种。

进一步优选，所述试剂R2的稳定剂为0.5-10g/L牛血清蛋白、1-50g/L聚乙烯吡咯烷酮、0.1-10g/L酪蛋白和10-100g/L海藻糖。

作为优选，所述试剂R1和试剂R2中的缓冲液均为TRIS缓冲液、MOPS缓冲液、POPOS缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸缓冲液、咪唑缓冲液中的一种或多种。

进一步优选，试剂R1和试剂R2中的缓冲液均为10-100mmol/L TRIS缓冲液。

作为优选，试剂R1和试剂R2中的表面活性剂均为曲拉通-100、吐温-20、吐温-80、月桂醇聚氧乙烯醚的一种或多种。

进一步优选，试剂R1中的表面活性剂为0.1-10ml/L的曲拉通-100。试剂R2中的表面活性剂为0.1-10ml/L的吐温-20。

作为优选，试剂R1和试剂R2中的防腐剂均为叠氮钠、硫酸庆大霉素、硫柳汞中的一种或多种。

进一步优选，试剂R1和试剂R2中的防腐剂均为0.1-1g/L的叠氮钠。

作为优选，试剂R1中的凝血酶为高比活牛凝血酶，浓度为1ku-50ku/L。

作为优选，试剂R2中的发色底物为Bz-Phe-Val-Arg-pNA(S-2160)、HD-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl(S-2238)、Tos-Gly-Pro-Arg-pNA(ChromozymTH)、Phe-Pro-Arg-pNA中的任意一种。

进一步优选，试剂R2中的发色底物为0.1-5g/L的HD-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl。

为了达到本发明的另一个目的，采用以下技术方案：一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒的检测方法，所述检测方法包括：

将样本和去离子水以体积比1:(3-5)混合，得稀释后样本；取稀释后样本，孵育30-60s，加入试剂R1，混匀，孵育60-100s，加入试剂R2，其中，稀释后样本、试剂R1和试剂R2的体积比为1:20:5，混匀后，于405nm波长处读取吸光度，根据标准曲线(五点定标获得)，得出样本中抗凝血酶Ⅲ的活性。

本发明的试剂盒为液体试剂，37℃下能保存15天以上，2-8℃能保存12个月以上。而市售产品大部分为冻干型粉末，使用麻烦，复溶后稳定性差。

本发明通过调节肝素的浓度，可以降低肝素辅助因子Ⅱ的干扰。通过加入一定浓度的盐离子，减少肝素辅助因子Ⅱ的干扰。通过添加海藻糖，不仅能降低肝素辅助因子Ⅱ的干扰，还对凝血酶有一定的稳定作用。本发明的试剂盒成本低廉、抗干扰能力强、灵敏度高、稳定性好。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述说明。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。

本发明试剂盒测定抗凝血酶Ⅲ活性的具体操作步骤如表1所示，但是表1仅限操作步骤中的一种实例，不限制保护范围。

表1测定抗凝血酶Ⅲ活性的检测步骤

实施例1

本实施例的抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒由下列组分组成：

试剂R1

Tris缓冲液100mmol/L，BSA 5g/L，明胶50g/L，甘露醇50g/L，硫酸铵1mol/L，曲拉通-100 1ml/L，叠氮钠1g/L，海藻糖50g/L，肝素10mg/L，凝血酶10ku/L。

试剂R2

Tris缓冲液100mmol/L，BSA 5g/L，PVP 10g/L，海藻糖50g/L，吐温-20 1ml/L，叠氮钠1g/L，HD-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl 2g/L。

实施例2

本实施例的抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒由下列组分组成：

试剂R1

Tris缓冲液100mmol/L，BSA 5g/L，甘露醇50g/L，硫酸铵2mol/L，曲拉通-100 1ml/L，叠氮钠1g/L，海藻糖50g/L，肝素20mg/L，凝血酶10ku/L。

试剂R2

Tris缓冲液100mmol/L，BSA 5g/L，PVP 30g/L，吐温-20 1ml/L，叠氮钠1g/L，HD-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl 2g/L。

实施例3

本实施例的抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒由下列组分组成：

试剂R1

Tris缓冲液100mmol/L，BSA 1g/L，明胶30g/L，甘露醇30g/L，硫酸铵1mol/L，曲拉通-100 1ml/L，叠氮钠1g/L，海藻糖50g/L，肝素15mg/L，凝血酶10ku/L。

试剂R2

Tris缓冲液100mmol/L，BSA 5g/L，酪蛋白5g/L，吐温-20 1ml/L，

叠氮钠1g/L，HD-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl 2g/L。

实施例4

本实施例的抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒由下列组分组成：

试剂R1

Tris缓冲液100mmol/L，BSA 2g/L，明胶10g/L，硫酸铵3mol/L，曲拉通-100 2ml/L，叠氮钠0.5g/L，海藻糖30g/L，肝素15mg/L，凝血酶10ku/L。

试剂R2

Tris缓冲液100mmol/L，BSA 8g/L，PVP 20g/L，酪蛋白1g/L，吐温-20 2ml/L，叠氮钠1g/L，HD-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl 3g/L。

对比例1

对比例1试剂R1与实施例1的区别在于，对比例1试剂R1中不含硫酸铵，试剂R2与实施例1相同。

对比例2

对比例1试剂R1与实施例1的区别在于，对比例1试剂R1中不含海藻糖，试剂R2与实施例1相同。

对比例3

对比例1试剂R1与实施例1的区别在于，对比例1试剂R1中肝素浓度为800mg/L，试剂R2与实施例1相同。

对比例4

对比例1试剂R1与实施例1的区别在于，对比例1试剂R1中硫酸铵浓度为8mol/L，试剂R2与实施例1相同。

将实施例1-4以及对比例1-4的抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒进行线性范围、准确度、抗肝素辅助因子Ⅱ干扰以及稳定性测试。

1、准确度检测

按照上述描述的检测步骤，测定国际标准物质(WHO International StandardNIBSC code:08/258d)的抗凝血酶Ⅲ活性，检测结果如表2所示。

表2实施例1-4以及对比例1-4检测的抗凝血酶Ⅲ活性％

从表2的检测结果发现，实施例1-4的相对偏差比较低，证明实施例1-4都具有很好的准确性。对比例1-4的相对偏差稍高于实施例，但是也属于正常范围内，故对比例1-4也具有较好的准确性。

2、线性范围测试

按照上述描述的检测步骤，选用接近线性范围上限的高活性样本(150％)和接近线性范围下限的低活性样本(0％)，按0/5,1/4,2/3,3/2,4/1,5/0稀释，每个浓度水平的血浆作样本测定。以测定结果为纵坐标，理论值为横坐标，计算线性回归值。发现实施例1-4和对比例3-4的相关系数接近1，说明在测试范围0-150％有较好的线性关系，而对比例1-2的相关系数为0.998。结果见表3。

表3实施例1-4和对比例1-4线性范围测试结果

3、抗肝素辅助因子Ⅱ干扰研究

将血浆样本与100u/ml的肝素辅助因子II按表4的比例混合。

表4

HCII浓度(U/ml)	空白血浆用量(ul)	HCII用量(ul)	生理盐水用量(ul)
				0	1140	0	60
1.25	1140	15	45
				2.5	1140	30	30
3.75	1140	45	15
				5	1140	60	0

用实施例1-4以及对比例1-4，按照描述的检测步骤，分别检测表4中含有不同浓度肝素辅助因子II的血浆样本中的抗凝血酶活性。抗干扰测试结果见表5。

表5实施例1-4和对比例1-4抗HCII干扰测试结果

如表5所示，实施例1-4在HCII浓度在5U/ml以下时，有很好的抗干扰效果，显著优于对比例1-4。

4、稳定性检测

(1)热稳定性检测

用实施例1-4与对比例1-4进行37℃热稳定性准确度检测。

将试剂按R1:4ml，R2：2ml分装在玻璃瓶中，加盖密封。每种试剂放18只于37℃水浴箱进行破坏。每天各取一支，测定国际标准物质的抗凝血酶Ⅲ活性，看其测量结果准确度变化。结果见表6所示，经37℃破坏15天后，实施例1-4准确度最大偏差不超过5％，说明试剂在37℃下可以稳定15天以上。而对比例1-4在水浴到6天的时候就出现了较大偏差，结果差距非常明显。

表6实施例1-4和对比例1-4 37℃热稳定性准确度检测

(2)冷藏稳定性检测

用实施例1-4与对比例1-4进行4℃稳定性准确度检测。

将试剂按R1：4ml，R2：2ml分装在玻璃瓶中，加盖密封。每种试剂放15只于4℃冰箱保存。每个月各取一支，测定国际标准物质抗凝血酶Ⅲ活性，看其测量结果准确度变化。结果如表7所示，经4℃保存13个月后，实施例1-4准确度最大偏差不超过5％，说明试剂在4℃下可以稳定12个月以上。而对比例在4个月的时候就出现了较大偏差，则停止实验。结果差距非常明显。

表7实施例1-4和对比例1-4 4℃稳定性准确度检测

综上所述，实施例1-4的线性范围满足临床应用的需求，且具有较高的准确度、显著降低肝素辅助因子Ⅱ的干扰、在37℃和冷藏环境下具有较好的稳定性。而对比例1-4试剂盒的抗肝素辅助因子Ⅱ干扰效果差，稳定差。

另外，本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (10)

1.一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其中：

试剂R1包括缓冲液、稳定剂、盐、表面活性剂、防腐剂、海藻糖、肝素和凝血酶；

试剂R2包括缓冲液、稳定剂、表面活性剂、防腐剂和发色底物。

2.根据权利要求1所述的一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的稳定剂为牛血清蛋白、酪蛋白、明胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、甘露醇、山梨醇中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的稳定剂为0.5-10g/L牛血清蛋白、1-50g/L明胶、1-50g/L甘露醇的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒，其特征在于，试剂R1中的盐为氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸铵的一种或多种。

5.根据权利要求1或4所述的一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒，其特征在于，试剂R1中的盐为0.05-5mol/L硫酸铵。

6.根据权利要求1所述的一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒，其特征在于，试剂R1中海藻糖的浓度为10-50g/L。

7.根据权利要求1所述的一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒，其特征在于，试剂R1中肝素浓度为1-500mg/L。

8.根据权利要求1所述的一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2的稳定剂为牛血清蛋白、明胶、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、乙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇中的一种或几种。

9.根据权利要求8所述的一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2的稳定剂为0.5-10g/L牛血清蛋白、1-50g/L聚乙烯吡咯烷酮、0.1-10g/L酪蛋白和10-100g/L海藻糖中的一种或几种。

10.如权利要求1-9任一要求所述的一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

将样本和去离子水以体积比1:(3-5)混合，得稀释后样本；取稀释后样本，孵育30-60s，加入试剂R1，混匀，孵育60-100s，加入试剂R2，其中，稀释后样本、试剂R1和试剂R2的体积比为1:20:5，混匀后，于405nm波长处读取吸光度，根据标准曲线，得出样本中抗凝血酶Ⅲ的活性。