CN107167439A - 一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒，包括蛇静脉酶、发色底物、含有达比加群的人血浆标准品和稀释液；蛇静脉酶的工作浓度为0.05～1U/ml；发色底物的工作浓度为0.05～3mmol/L。本发明将蛇静脉酶加入样本血浆后会作用在凝血酶原上，产生一种具有活性的酶，这种酶裂解其发色底物产生吸光度信号。所述试剂盒基于发色底物法实现监测血浆中达比加群含量变化。由于所述试剂盒能够特异性反映达比加群对酶的抑制，从而实现快速准确检测达比加群含量，达比加群在0～500ng/ml范围内，R≥0.99，线性关系较好，所述试剂盒相对偏差小于1％，准确性高。

Description

一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒
技术领域
本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒。
背景技术
达比加群酯(dabigatran etexilate)是一种新型口服抗凝药，通过直接抑制凝血酶(凝血因子FIIa)发挥抗凝作用，可用于预防髓关节/膝关节置换术后静脉血栓栓塞形成，或预防心房颤动导致脑卒中等。虽然抗凝作用的药物有很多，例如华法林，但是达比加群酯具有明显的优势：起效快、抗凝疗效可预期等，但是如同所有抗凝剂，达比加群酯会导致出血事件。目前还未开发出针对达比加群酯的特异性拮抗剂。而临床上服用达比加群酯的患者一旦出现大出血，或者需要手术后者侵入性处理，一般会采取紧急逆转抗凝活性的措施来应对。该方法不仅不利于提前预防出血症状，还会给患者带来生理和心理的双重伤害，因此，严重影响了患者的健康和恢复。
虽然达比加群酯较华法林和依诺肝素相比具有较高的安全性，但是该药在被医院和患者使用时，随着使用人数的增加，人们发现对达比加群血液浓度的监测和调整剂量是必要的，对其密切监测可使严重出血风险大幅度降低,从而提高用药的安全性。活化部分凝血活酶时间(aPTT)是测定内源性凝血系统的筛选试验,也可以作为内源性途径凝血因子的定量试验.此法可以用来检测达比加群的血液含量；其原理为将待测血浆加入部分凝血活酶溶液，在钙离子参与下纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白，测定凝固所需的时间，即为待测血浆活化部分凝血活酶时间；使用了达比加群的血浆活化部分凝血活酶时间会延长，此法可用来监测达比加群的血液含量。活化部分凝血活酶时间(aPTT)是测定内源性凝血系统的筛选试验，也可以作为内源性途径凝血因子的定量试验；凝血时间，即从加入部分凝血活酶溶液到血浆凝固的时间是整个实验的基础，因此凝血时间必须精确，否则实验结果难以准确，在待测血浆加入部分凝血活酶溶液，激活了整条内源性凝血途径，导致血浆凝固。整条内源性凝血途径所牵涉的凝血因子众多，所以此法受到的干扰因素较多，达比加群的血液浓度和活化部分凝血活酶时间的相关系数不强，难以进行精确的量化。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供迅速准确，可以实现自动化测量的达比加群含量的试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒，包括蛇静脉酶(Ecarin)、发色底物、含有达比加群的人血浆标准品和稀释液；
蛇静脉酶的工作浓度为0.05～1U/ml；
发色底物的工作浓度为0.05～3mmol/L。
优选的，所述蛇静脉酶的工作浓度为0.1～0.5U/ml。
优选的，所述发色底物的工作浓度为0.5～2mmol/L。
优选的，所述发色底物为H-D-CHG-Ala-Arg-pNA·2AcOH、Tos-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-D-CHG-But-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHG-Pro-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHA-Ala-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHA-Gly-Arg-pNA·2AcOH、CH3OCO-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-β-Ala-Gly-Arg-pNA·2AcOH、H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl、pyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl或-D-Ala-Pro-Arg-pNA·2HCl。
优选的，所述稀释液的组分包括缓冲液、无机盐、稳定剂、表面活性剂和防腐剂。
优选的，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液或磷酸缓冲液；所述缓冲液的pH值为7.2～7.8。
优选的，所述无机盐为氯化钠或氯化钾；所述无机盐的质量浓度为0.15～0.25mol/L；所述表面活性剂为聚乙二醇-8000或吐温-20；所述表面活性剂的质量浓度为0.05％～0.15％。
优选的，所述稳定剂为小牛血清或酪蛋白；所述稳定剂的质量浓度为0.08％～0.15％；所述防腐剂为Proclin 300或叠氮钠；所述防腐剂的质量浓度为0.1～1mg/ml。
优选的，所述试剂盒还包括凝血酶原。
优选的，凝血酶原的质量浓度为50～150μg/ml。
本申请提供了一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒，包括蛇静脉酶、发色底物、含有达比加群的人血浆标准品和稀释液；蛇静脉酶的工作浓度为0.05～1U/ml；发色底物的工作浓度为0.05～3mmol/L。所述试剂盒的检测机理是蛇静脉酶加入样本血浆后会作用在凝血酶原上，产生一种具有裂解活性的酶，这种酶裂解其发色底物，得到吸光度信号。血浆中的达比加群抑制这种酶,而达比加群含量越高,对这种酶的抑制越强，得到的吸光度信号越弱。所以在一定的范围之内,达比加群的含量和吸光度的信号是负相关关系,可以根据标准曲线达到定量检测的目的。本发明所述试剂盒基于发色底物法实现监测血浆中达比加群含量变化，由于所述试剂盒能够特异性反映达比加群对酶的抑制情况，从而实现快速准确检测达比加群含量，研究发现，达比加群浓度在0～500ng/ml时，R≥0.99，线性关系较好，同时所述试剂盒相对偏差小于1％，准确性较好。
同时，本发明提供的试剂盒经过多次测量时，CV值小于2％，重复性较好。所述试剂盒可以检测到低至15ng/ml的达比加群。
进一步的，本发明提供的试剂盒适合内源性凝血酶原的表达量很低的重病患者，通过体外补充凝血酶原实现了达比加群含量快速准确检测。
附图说明
图1为实施例3中绘制的标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒，包括蛇静脉酶、发色底物、含有达比加群的人血浆标准品和稀释液；
蛇静脉酶的工作浓度为0.05～1U/ml；
发色底物的工作浓度为0.05～3mmol/L。
本发明提供了一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒，研究发现，达比加群浓度在0～500ng/ml时，R≥0.99，线性关系较好，同时所述试剂盒相对偏差小于1％，准确性较好。
本发明提供的一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒包括蛇静脉酶。所述蛇静脉酶的工作浓度为0.05～1U/ml，优选为0.1～0.5U/ml，更优选为0.2U/ml。所述蛇静脉酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的蛇静脉酶即可。本发明中，所述蛇静脉酶购自西格马(Sigma)。
本发明提供的一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒包括发色底物。所述发色底物的工作浓度为0.05～3mmol/L，优选为0.5～2mmol/L，更优选为1mmol/L。所述发色底物为H-D-CHG-Ala-Arg-pNA·2AcOH、Tos-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-D-CHG-But-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHG-Pro-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHA-Ala-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHA-Gly-Arg-pNA·2AcOH、CH3OCO-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-β-Ala-Gly-Arg-pNA·2AcOH、H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl、pyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl或D-Ala-Pro-Arg-pNA·2HCl。所述发色底物的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的凝血酶的发色底物即可。
本发明提供的一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒包括稀释液。所述稀释液的作用是对蛇静脉酶和发色底物进行稀释，得到蛇静脉酶溶液和发色底物溶液。
本发明中，所述稀释液的组分包括缓冲液、无机盐、稳定剂、表面活性剂和防腐剂。所述缓冲液优选为三羟甲基氨基甲烷缓冲液或磷酸缓冲液，更优选为三羟甲基氨基甲烷缓冲液；所述缓冲液的pH值为7.2～7.8，更优选为7.5。所述无机盐优选为氯化钠或氯化钾，更优选为氯化钠；所述无机盐的质量浓度优选为0.15～0.25mol/L，更优选为0.2mol/L；所述表面活性剂优选为聚乙二醇-8000或吐温-20，更优选为聚乙二醇-8000；所述表面活性剂的质量浓度优选为0.05％～0.15％，更优选为0.1％。所述稳定剂优选为小牛血清或酪蛋白，更优选为小牛血清；所述稳定剂的质量浓度优选为0.08％～0.15％，更优选为0.1％；所述防腐剂优选为Proclin 300或叠氮钠；所述防腐剂的质量浓度优选为0.1～1mg/ml，更优选为0.5mg/ml。
本发明中，所述试剂盒优选还包括凝血酶原。凝血酶原的质量浓度优选为50～150μg/ml，更优选为80μg/ml。所述凝血酶原的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知凝血酶原即可。本发明中，所述凝血酶原购自西格马(Sigma)。
本发明中，一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒在检测达比加群含量中的应用，包括以下步骤：
1)用稀释液将蛇静脉酶和发色底物稀释，得到蛇静脉酶和发色底物溶液；
2)将待测样品与蛇静脉酶溶液混合、孵育，得到孵育后的混合液；
3)将孵育后的混合液与发色底物溶液混合、孵育后，读取待测样品中发色底物的信号强度；
4)将得到的计算信号强度与已知浓度标准品的标准曲线比对，得到血液中达比加群含量。
本发明中，所述步骤2)中待测样品与蛇静脉酶溶液的体积比为1～2:1，更优选为1:1。
所述步骤2)中孵育的温度优选为37℃。所述孵育的时间优选为2分钟。
本发明中，所述孵育后混合液与发色底物溶液的体积比为1～2:1，更优选为1:1。
本发明中，所述步骤3)中信号强度的检测波长为405nm。
达比加群浓度在0～500ng/ml范围内容，具有较好的线性关系，在此范围内能够准确检测血浆中达比加群的含量。本发明提供的试剂盒经过多次检测时，CV值小于2％，重复性非常好。本发明提供的试剂盒可以检测到低至15ng/ml的达比加群。
本发明除了可以检测达比加群含量，还可以检测其他直接凝血酶抑制剂。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
浓度为20mmol/L的Tris缓冲液，再加入盐酸调节pH值至7.5；再加入氯化钠，聚乙二醇-8000，小牛血清和叠氮钠，搅拌后得到终浓度分别为氯化钠0.2mol/L，聚乙二醇-80000.1％，小牛血清0.1％，叠氮钠0.5mg/ml的稀释液。
取蛇静脉酶溶于稀释液中，形成工作浓度为0.05U/ml、0.1U/ml、0.2U/ml、0.5U/ml和1U/ml的蛇静脉酶溶液。
取发色底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl溶于稀释液中，形成工作浓度为0.05mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L和3mmol/L的发色底物溶液。
实施例2
样品检测：
取100μL样本与100μl蛇静脉酶溶液混合均匀，37℃孵育2分钟，然后加入200μl发色底物溶液，37℃反应在405nm波长测量吸光度5分钟。蛇静脉酶溶液和发色底物溶液的工作浓度选择如表1所示。记录试验结果，计算信号强度，得到标准曲线。
表1检测达比加群测定的结果
由表2可以看出，上述方案均能准确地测定达比加群的含量变化，其中蛇静脉酶工作浓度为0.2U/ml与发色底物工作浓度为1mmol/L的方案检测效果最佳。
实施例3
达比加群标准品的制备：配制多个不同浓度的已知达比加群浓度的人血浆标准品，其浓度分别为0ng/ml，15ng/ml，30ng/ml，60ng/ml,120ng/ml，250ng/ml，500ng/ml。
标准曲线制作：
(1)取100μL标准液与100μL蛇静脉酶溶液混合均匀，并孵育2分钟，孵育和反应的温度均为37℃。
(2)然后加入200μL发色底物溶液，混合均匀(蛇静脉酶工作浓度为0.2U/ml，发色底物工作浓度为1mmol/L)，在405nm波长测量吸光度5分钟。
(3)根据达比加群标准液梯度浓度与所对应吸光值，采用线性方程绘制标准曲线，请见图1，其标准曲线公式为y＝-0.9318x+0.2524(R2＝0.9925)。
表2检测达比加群测定试剂盒线性范围
由表1可知，达比加群浓度在0～500ng/ml范围内容，具有较好的线性关系，在此范围内能够准确检测血浆中达比加群的含量。
实施例4
按照实施例3中的检测方法，蛇静脉酶工作浓度为0.2U/ml与发色底物工作浓度为1mmol/L的方案对不同梯度达比加群浓度进行检测，得到不同梯度达比加群浓度下吸光度值，得到本试剂盒的检测灵敏度。
表3检测达比加群测定试剂盒灵敏度
达比加群浓度(ng/ml) 0 15 30 60 120 250 500
405nm吸光度 1.873 1.721 1.619 1.503 1.418 1.072 0.605
由表3所示，本发明提供的试剂盒检测灵敏度的计算方法如下：根据国家标准，灵敏度为标准曲线的斜率，即用已知浓度或活性的样品测试试剂盒，记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度改变，其中标准曲线的斜率为-0.9318log(吸光度)/(ng/l)。由表3所示，本发明提供的试剂盒可以检测到低至15ng/ml的达比加群。
实施例5
按照实施例4的检测方法将达比加群标准品的浓度为30ng/ml和250ng/ml多次检测吸光度值。
表4检测达比加群测定试剂盒重复性
由表4可知，本发明提供的试剂盒经过多次检测时，CV值小于2％，重复性非常好。
实施例6
按照实施例3中的检测方法，蛇静脉酶工作浓度为0.2U/ml与凝血酶的工作浓度为发色底物1mmol/L的方案对不同稀释液进行检测，得到利用不同稀释液的标准曲线。
表5检测不同稀释液对试剂盒的影响
由表5可以看出，三羟甲基氨基甲烷缓冲液和磷酸盐缓冲液的标准曲线R2与碳酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液相比，均高于0.99，因此三羟甲基氨基甲烷缓冲液或磷酸缓冲液有利于提高所述检测试剂盒的准确性和精确度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于发色底物法检测达比加群含量的试剂盒，包括蛇静脉酶、发色底物、含有达比加群的人血浆标准品和稀释液；
蛇静脉酶的工作浓度为0.05～1U/ml；
发色底物的工作浓度为0.05～3mmol/L。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛇静脉酶的工作浓度为0.1～0.5U/ml。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发色底物的工作浓度为0.5～2mmol/L。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的发色底物为H-D-CHG-Ala-Arg-pNA·2AcOH、Tos-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-D-CHG-But-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHG-Pro-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHA-Ala-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHA-Gly-Arg-pNA·2AcOH、CH3OCO-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-β-Ala-Gly-Arg-pNA·2AcOH、H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl、pyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl或H-D-Ala-Pro-Arg-pNA·2HCl。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液的组分包括缓冲液、无机盐、稳定剂、表面活性剂和防腐剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液或磷酸缓冲液；所述缓冲液的pH值为7.2～7.8。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述无机盐为氯化钠或氯化钾；所述无机盐的摩尔浓度为0.15～0.25mol/L；所述表面活性剂为聚乙二醇-8000或吐温-20；所述表面活性剂的质量百分比为0.05％～0.15％。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为小牛血清或酪蛋白；所述稳定剂的质量百分比为0.08％～0.15％；所述防腐剂为Proclin300或叠氮钠；所述防腐剂的质量浓度为0.1～1mg/ml。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括凝血酶原。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，凝血酶原的质量浓度为50～150μg/ml。
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