CN104483487B - 检测人血液中1,5‑脱水山梨醇的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测人血液中1,5‑脱水山梨醇的试剂盒，R1：缓冲液20～200mM4‑氨基安替比林1～10mMATP0.2～2mMPEP1～10mM,ATP‑HK 1～50KU/L,丙酮酸激酶1～50KU/L抗坏血酸氧化酶1～50KU/L钒酸钠0.05～10mM表面活性剂0.01～5％稳定剂0.1～10％防腐剂0.01～1％；R2:缓冲液20～200mM，TOOS 1～10mM，POD 1～100KU/L，PROD 10～200KU/L，表面活性剂0.01～5％，稳定剂0.1～10％，防腐剂0.01～1％。具有效防止葡萄糖、胆红素、抗坏血酸、血脂等内源性干扰，稳定性好的优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种检测人血液中1,5-脱水山梨醇的试剂盒。
背景技术
糖尿病属于临床常见病、多发病，原因是胰岛素分泌不足引起，血液中1，5-脱水山梨醇(1，5-AG)与葡萄糖(GLU)、糖化血红蛋白(HbAlc)、糖化白蛋白(GA)呈显著的负相关。有资料表明，血浆葡萄糖(GLU)＞8.3mmol/L者，无一例伴有高水平的血浆1，5-脱水山梨醇(1，5-AG)。
1，5-脱水山梨醇(1，5-AG)与现有的糖尿病指标均呈现出显著的负相关，血液中1，5-脱水葡萄糖醇的减少程度与糖尿病的严重程度显著相关。1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)与其他指标最显著的区别是反映糖尿病病情变化的周期不同，血糖(GLU)反映病人当时血糖状况，糖化白蛋白(GA)反应病人半个月内血糖的平均状况，糖化血红蛋白(HbAlc)反映病人最近2～3个月左右的血糖平均水平，而1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)可以反映近几天至1周的平均血糖水平。
测定1，5-脱水山梨醇有高效液项色谱、微柱层析法、化学发光法等。这些方法比较准确，但操作费事难以批量检测，并且这些方法只能现配现用，不能长期保存。而酶法测定由于其无污染，并可试用与生化仪，操作简单等特点，有利于大规模推广。目前国内外主要采用酶法测定1，5-脱水山梨醇(1，5-AG)，主要有氧化酶法与脱氢酶法两种方法。氧化酶法的原理为，通过吡喃糖氧化酶(PROD)催化1，5-脱水山梨醇(1，5-AG)生成1，5-脱水果糖和H2O2，H2O2在过氧化物酶的作用下使4-AAP和TOOS反应生成醌类有色物质。脱氢酶法的原理为：1，5-脱水山梨醇在ADP依赖性己糖激酶(ADP-HK)的作用下生成AG-6磷酸(AG-6-P)。AG-6-P再和NADP进行反应，生成 NADPH。NADPH具有还原性，和显色剂作用生成显色物质。但目前市场上的酶法试剂盒存在着稳定性差，易受葡萄糖、胆红素、抗坏血酸、血脂等内源性干扰。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提供一种能有效防止葡萄糖、胆红素、抗坏血酸、血脂等内源性干扰，稳定性好的检测人血液中1,5-脱水山梨醇的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种检测人血液中1,5-脱水山梨醇的试剂盒，该试剂盒包含试剂1和试剂2，试剂1和试剂2中的组分和含量包括：
试剂1：
试剂2：
作为优选，本发明上述的试剂盒，其中试剂1和试剂2中的各组分和含量包括：
试剂1：
试剂2：
本发明上述的缓冲液为磷酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液，MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)，MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)，HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)中的一种。
本发明所述表面活性剂为SDS(十二烷基硫酸钠)，吐温，曲拉通，司班，Brij35中的一种。
本发明所述稳定剂为海藻糖，蔗糖，甘露醇中的一种。
本发明所述防腐剂为叠氮钠，proclin300，G418(遗传霉素)，苯甲酸钠中的一种。
本发明还提供一种利用上述试剂盒测定血液中1，5-脱水山梨醇的方法，该方法是依据氧化酶法为基础，利用吡喃糖氧化酶(PROD)催化1，5-脱水山梨醇(1，5-AG)生成1，5-脱水果糖和H2O2，H2O2在过氧化物酶的作用下使4-AAP和TOOS反应生成醌类有色物质。利用比色分析原理可以得出血液中1，5-脱水山梨醇(1，5-AG)水平；
其原理示意如下：
本发明所述的缓冲液可以为磷酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液，MES，MOPS，HEPES中的一种，经试验证明，其在合适的浓度范围内均有良好的反应，例如当缓冲液的浓度在20～200mM之间时，其能够提高合适的缓冲能力，同时又有较高的酶活反应。另外对于缓冲液的pH值，通过试验发现，在pH处于5.0～9.0之间时，酶处于合理的pH范围中，其稳定性好，试剂盒的灵敏度高。
本发明提供的测定1,5-脱水山梨醇的方法，具有排除血液更高浓度葡萄糖影响的能力，其原理是，利用了酶法将样本中的葡萄糖先消除反应掉，使得PROD只能与1,5- 脱水山梨醇反应。在这一点上专利CN 102154442A是利用己糖激酶将葡萄糖催化生成葡萄糖6磷酸和一磷酸腺苷，再用磷酸己糖异构酶将葡萄糖6磷酸转换成果糖6磷酸，再利用6磷酸果糖异构酶将果糖6磷酸转换成果糖1,6二磷酸，从而去除葡萄糖干扰。而专利CN 102175670B中则是用葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化成葡萄糖酸内酯和过氧化氢，再利用过氧化氢酶将过氧化氢分解，以去除葡萄糖干扰。而本发明专利的原理完全不同于上述现有技术的两种，创造性的先是利用己糖激酶将葡萄糖和ATP催化生成葡萄糖6磷酸和ADP，再利用丙酮酸激酶将ADP和磷酸烯醇式丙酮酸催化生成ATP和丙酮酸，进而消除葡萄糖干扰。本发明相对于上述两现有技术，具有彻底去除葡萄糖干扰，同时成本低廉的优势，本发明的反应原理如下：
为了更有效地去除葡萄糖的干扰，可在试剂1中加入0.1～100mM钾离子，或者0.1～100mM镁离子。以此激活丙酮酸激酶，能更有效地去除ADP，从而使反应向消除葡萄糖的方向进行。本发明的试剂1中还含有0.1～100mM钾离子，或者0.1～100mM镁离子，所述钾离子为KCl，所述镁离子为MgCl2。
本发明所提供的试剂盒具有良好的抗干扰性能，包括抗维生素C干扰，抗胆红素干扰等。由于本发明的试剂2中添加了抗坏血酸氧化酶(维生素C氧化酶)，能够使得样本中的维生素C能够以极快的速度被氧化分解掉，进而不会影响后续的Tridner反应，使得维生素C对检测系统的干扰被彻底排除在外。这里所述的抗坏血酸氧化酶应当具有合理的浓度，例如1～50KU/L之间，才能使得维生素C被快速地氧化分解掉。
对于临床检验来说胆红素干扰一直是一个头痛的问题，会使得检验结果不准确。人们通过不同的方式提出改进，例如专利CN 102175670B中提出利用亚铁氰化钾和表面活性剂的组合能够有效地去除胆红素干扰。本发明所提供的试剂盒由于利用了偏钒酸 钠和表面活性剂的组合，出人意料地发现，其抗胆红素干扰的性能尤其良好。发现，当偏钒酸钠在0.05～10mM之间，表面活性剂在0.01～5％之间时，其抗胆红素干扰作用明显。这里所述的表面活性剂可以是SDS，吐温，曲拉通，司班，Brij35中的一种。
本发明所提供的试剂盒中，含有稳定剂和防腐剂，所述稳定剂可以是海藻糖，蔗糖，甘露醇中的一种或几种，所述防腐剂可以是叠氮钠，proclin300，G418，苯甲酸钠中的一种或几种。这使得试剂盒具有良好的稳定性。
本发明的创新点在于以下几个方面，首先，利用里己糖激酶和丙酮酸激酶系统，以除去样本中葡萄糖的干扰；其次，利用抗坏血酸氧化酶去除维生素干扰，利用偏钒酸钠和表面活性剂的组合去除胆红素干扰；最后，利用稳定剂和防腐剂提高了试剂盒稳定性，延长了试剂盒有效期。
使用本发明提供的检测试剂测定血液中1，5-脱水山梨醇(1，5-AG)含量，具有操作简单、安全，具有特异性好、灵敏度高等特点，并且试剂1与待测样本先作用几分钟后即可清除血液中葡萄糖，维生素C，胆红素等的干扰，有效提高了本发明试剂检测的特异性和准确度。为临床提供准确有效的诊断信息。可以很好有效地作为糖尿病检测的重要指标。
附图说明
图1实施例1(配方1)与对照试剂测定对比图。
横坐标为按照配方1进行配制的试剂来测定40份血清样本的值，纵坐标为进口的试剂盒(GlycoMark)测定相同40份血清样本的值。由图可知，本试剂与进口试剂具有良好相关性，测样本值准确。
具体实施方式
下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。
实施例一
1,5-脱水山梨醇检测试剂的配制。
1、按照下表1的配方进行配制
表1 1,5-脱水山梨醇检测试剂配方
2、制备1，5-脱水山梨醇校准品、质控品：称所需量纯品(Sigma公司购买)溶于纯净水中，并加入0.1％的叠氮钠做防腐剂，封闭储存备用。
3、在全自动生化仪上设定如下参数：反应10min，反应温度37℃，主波长546nm，副波长700nm，样本：试剂1：试剂2＝6ul：180ul：60ul，反应类型：终点法。
实施例二
1,5-脱水山梨醇检测试剂盒性能验证
1、灵敏度与精密度试验
用浓度为152.3uM的1，5AG纯品作为标准品，进行测试,其中S1点为水，S2
点为152.3uM的1,5AG，具体见表2：
表2
| 吸光度(S1) | 吸光度(S2) | |
| 配方1 | 0.0122 | 0.0648 |
| 配方2 | 0.0118 | 0.0639 |
| 配方3 | 0.0128 | 0.0650 |
表3精密度检测
| 批内精密度 | 批间精密度 | |
| 配方1 | 2.5％ | 3.8％ |
| 配方2 | 3.1％ | 4.2％ |
| 配方3 | 3.6％ | 4.9％ |
2、抗干扰性能见表4
表4
由上表可以看出，以下干扰物质对本试剂盒无明显干扰：维生素C小于20mg/dL，结合胆红素小于30mg/L，非结合胆红素小于20mg/L，葡萄糖小于30mmol/L，血红蛋白小于200mg/dL。因此本发明所提供的试剂盒具有良好的抗干扰性能。
对比试验见图1
以本发明的配方1试剂为例，选用进口的1,5AG试剂盒(GlycoMark)作为对照试剂，分别同时测定40个随机样本。由上可知，本发明试剂盒与对照试剂盒具有良好的相关性，相关系数达0.998。
3、稳定性试验，见表5
表5
由上表可以看出，试剂盒在37℃，7天后，空白吸光度(S1)变化不明显，同时灵敏变化也不大，由此可以看出试剂盒具有良好的稳定性。
Claims (1)
1.一种检测人血液中1,5-脱水山梨醇的试剂盒，其特征在于：该试剂盒由试剂1和试剂2组成，上述两试剂中的各组分和含量为：
试剂1：
缓冲液 100mM
4-氨基安替比林 5mM
ATP 1mM
磷酸烯醇式丙酮酸 5mM
ATP依赖性己糖激酶 20KU/L
丙酮酸激酶 20KU/L
抗坏血酸氧化酶 20KU/L
偏钒酸钠 2mM
表面活性剂 0.1%
稳定剂 1%
防腐剂 0.1%
钾离子 0.1~100mM;
试剂2：
缓冲液 100mM
TOOS 5mM
过氧化物酶 30KU/L
吡喃糖氧化酶 50KU/L
表面活性剂 0.1%
稳定剂 1%
防腐剂 0.1%；
所述表面活性剂为SDS，吐温，曲拉通，司班，Brij35中的一种；
所述的缓冲液为磷酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液，MES，MOPS，HEPES中的一种；试剂1和试剂2中的缓冲液的pH值为5.0~9.0；所述稳定剂为海藻糖，蔗糖，甘露醇中的一种；所述防腐剂为叠氮钠，proclin300，G418，苯甲酸钠中的一种。
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