CN108982829B - 一种用酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的方法及其试剂盒 - Google Patents

一种用酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种酶标仪酶法定量检测乳果糖的方法及其试剂盒。本发明采用果糖建立标准曲线，解决了酶标仪检测中无法定量的技术问题，使检测方法因采用酶标仪而极大的提高的检测效率，降低了检测试剂用量。另一方面，本发明通过将葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶，NADP+与ATP分别按一定比例混合后进行冻干，将己糖激酶和葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶混合后制成悬浮液的处理方法进行检测试剂的制备，不仅不干扰检测反应及其效果，还减少了试剂添加步骤，简化了操作，提高了检测的准确性。

Description

一种用酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的方法及其试 剂盒
技术领域
本发明涉及一种采用酶标仪利用酶化学法定量测定液态奶中乳果糖的方法及其试剂盒，属于酶化学分析检测领域。
背景技术
乳果糖是乳糖在牛奶热处理过程中发生碱基异构的产物，与乳糖是同分异构体，是评估牛奶热处理程度的一项重要指标。欧盟和IDF均提议UHT灭菌乳的乳果糖含量不得超过600mg/L。因此，乳果糖的准确测定十分重要。
目前，国内外关于液态奶中乳果糖的检测方法都比较复杂，一般为高效液相色谱法和基于酶分析的分光光度法。其中高效液相色谱法因样品中乳糖含量高于乳果糖的数十倍，在分离中乳糖与乳果糖间很难达到基线分离，从而使定量检测乳果糖存在较大难度。基于酶分析的分光光度法则是采用标准摩尔吸光系数定量的方法(例如在NY/T 939-2016和ISO 11285-2004等标准中记载的酶分析分光光度法)，存在样品处理繁琐、测定时需采用比色皿分别进行测定、检测通量小、耗时长的问题，在大批量样品测定中该问题更为突出。另外，酶分析分光光度法，整个测定过程中使用的酶的种类较多，需分别进行配制，酶试剂用量大，不但检测成本高，且酶活性难以保障，直接影响测定结果。随着近年来酶标仪测定技术的不断成熟，运用酶标仪提高检测通量，降低检测成本，可能成为测定乳果糖的一种新途径，但是如何去除乳糖的干扰，对乳果糖进行准确定量仍然是一道难题。
发明内容
针对目前使用的酶分析分光光度法定量检测液态奶中乳果糖，测定步骤繁琐、检测效率低、检测成本高，对操作人员技术要求高，须经较长时间的专门培训才可独立操作等缺点，开发了利用酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的方法，以及相应的检测试剂盒。
本发明所利用的酶化学原理，与标准的分光光度法测定液态奶中乳果糖含量所用的酶化学原理相同，故标准NY/T 939-2016全文引用在本发明中作为参考。
在采用酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖含量的方法中，酶标仪无法采用分光光度计法的朗伯比尔定律定量的方法，需要建立新的定量手段。经过研究考察，本发明的发明人采用果糖为标准品，建立果糖的标准曲线，用于酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的含量，不仅解决了酶标仪法测量中无法定量的技术问题，还避免了采用其他物质为标准品，例如，以乳果糖为标准品，需经多个步骤酶解带来的方法学误差。
本发明的第一个方面是，提供一种酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的方法，其包括如下步骤：以果糖为标准品建立标准曲线。
根据本发明，所述标准曲线的建立步骤包括：在酶标仪用微孔板中加入果糖标准品溶液，使每孔中果糖质量依次呈等差增长或呈倍数增长，加入NADP+和ATP后混匀；再加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶混匀后反应，在酶标仪上340nm处读取溶液OD值，记为A1，再加入磷酸葡萄糖异构酶混匀后反应，在酶标仪上340nm读取溶液OD值，记为A2；以(A2-A1)的值为净OD值，作为纵坐标，以每孔中果糖质量为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。
优选，在微孔板中的4-10个孔中加入果糖标准品溶液。
优选，每孔中的果糖质量以μg为单位。
优选，每孔中的果糖质量依次呈等差增长，例如，以0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg/孔的间距增长，或以0、2.0、4.0、6.0μg/孔的间距增长。在本发明的一个具体实施方式中，在7个孔中加入果糖标准品溶液，使孔中果糖质量依次为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg/孔。
优选，每孔中的果糖质量依次呈倍数增长，例如，可以是呈2倍、3倍、4倍等倍数增长。在本发明的一个具体实施方式中，在4个孔中加入果糖标准品溶液，使孔中果糖质量依次为0、1.0、2.0、4.0μg/孔。
优选，NADP+和ATP以NADP+和ATP的混合液形式加入，所述混合液中，NADP+的浓度为7-12mg/mL，ATP的浓度为40-60mg/mL。
优选，己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的混合悬浮液的形式加入，所述悬浮液中己糖激酶的浓度为200-350U/mL，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度为200-350U/mL。
优选，加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶混匀后放于37℃下反应10min。
优选，磷酸葡萄糖异构酶溶液的浓度为700-900U/mL。
优选，加入磷酸葡萄糖异构酶混匀后于37℃下反应15min。
在本发明的一个具体实施方式中，所述果糖标准曲线的建立步骤为：在微孔板中加入果糖标准品溶液，使果糖质量分别为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg/孔，加入缓冲液B(140.0g/L三乙醇胺盐酸盐、2.5g/L硫酸镁，pH 7.5～7.7)、NADP+和ATP混合液后混匀放置；再加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，混匀后放于37℃下反应10min后，在酶标仪上340nm处读取溶液OD值，记为A1，再加入磷酸葡萄糖异构酶混匀放于37℃下反应15min后，在酶标仪上340nm读取溶液OD值，记为A2；以(A2-A1)的值为净OD值，作为纵坐标，果糖质量(μg/孔)为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。
根据本发明，所述检测方法还包括，检测奶样的(A2-A1)的值，根据果糖标准曲线换算出奶样中乳果糖的含量。
根据本发明，所述换算公式为：
式中：
X：样品中乳果糖含量，单位为mg/L；
C：由标准曲线或回归方程计算得到的奶样微孔中果糖含量，单位为μg；
f：转换系数；
V1：检测开始时吸取的奶样体积，单位为mL，数值可以为0.3-1。在本发明的一个实施方式中，其数值为0.50，即检测开始时吸取的奶样体积为0.50mL。
V2：样品前处理过程中沉淀样品中脂肪和蛋白质离心后的体积，单位为mL，数值可以为1.2-4，在本发明的一个实施方式中，其数值为2.00，即沉淀离心后的体积为2mL。
V3：吸取离心后上清液的体积，单位为mL，数值可以为0.3-1，优选和V1的数值相同。在本发明的一个实施方式中，其数值为0.50，即，吸取离心后上清液的体积为0.50mL。
V4：葡萄糖氧化步骤后的试样液的总体积，单位为mL，数值可以为0.606-2.02，在本发明的一个实施方式中，其数值为1.01，即，葡萄糖氧化步骤后的试样液的总体积为1.01mL。
V5：进行酶标仪测定时，加入微孔板中的试样液的体积，单位为mL，数值可以是0.06-0.2，在本发明的一个实施方式中，其数值为0.10，即，进行酶标仪测定时，加入微孔板中的试样液的体积为0.10mL。
ML：乳果糖的摩尔质量，342.3g/mol
MF：果糖的摩尔质量，180.16g/mol
所述转换系数f，根据检测过程中对应步骤液体的体积数，会发生相应变化，在本发明的一个实施方式中，根据对应步骤的液体体积数计算出的转换系数f＝153.52。
本发明的检测方法，还进一步包括样品前处理步骤。
根据本发明，所述样品前处理步骤包括：采用硫酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液沉淀液态奶样品中的蛋白与脂肪，离心后，取上清液，加入β-半乳糖苷酶溶液水解上清液中的乳糖和乳果糖，然后加入葡萄糖氧化酶溶液和过氧化氢酶溶液氧化葡萄糖。
优选，所述硫酸锌溶液的浓度为168g/L。
优选，所述亚铁氰化钾溶液的浓度为130g/L。
优选，所述β-半乳糖苷酶溶液的浓度为(1.5-3.0)×103U/mL。
优选，β-半乳糖苷酶溶液水解上清液中的乳糖和乳果糖的反应条件为50℃培养箱或水浴1h。
优选，所述葡萄糖氧化酶溶液的浓度为(3.0-5.0)×103U/mL。
优选，所述过氧化氢酶溶液的浓度为(4.0-6.0)×105U/mL。
优选，所述葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶制成混合酶溶液使用，其中葡萄糖氧化酶的浓度为(3.0-5.0)×103U/mL，过氧化氢酶的浓度为(4.0-6.0)×105U/mL。
优选，葡萄糖氧化酶溶液和过氧化氢酶溶液氧化葡萄糖的反应条件为40℃培养箱或水浴培养3h。
在本发明的一个具体实施方式中，样品前处理的操作方法为：吸取液态奶样品0.5mL，加入蒸馏水1.3mL、168g/L的硫酸锌溶液0.1mL、130g/L的亚铁氰化钾溶液0.1mL，混合，5000rpm离心10分钟。吸取上清液，分为三份，每份500μL，其中两份分别加入缓冲液A(48g/L磷酸氢二钠、8.6g/L磷酸二氢钠、1g/L硫酸镁，pH 7.4～7.6)200μL与β-半乳糖苷酶(2.0×103U/mL)20μL作为测定样品；另一份中加入缓冲液A 200μL与蒸馏水20μL，作为空白对照，涡旋震荡混合后，50℃培养箱或水浴1h后，再分别加入缓冲液C(缓冲液B进行2.5倍稀释得到)200μL、0.33mol/L NaOH溶液50μL、辛醇10μL、葡萄糖氧化酶(4.0×103U/mL)和过氧化氢酶(5.0×105U/mL)混合液20μL、30％的H2O2 10μL，混匀，在40℃培养箱或水浴培养3h，取出于5000rpm离心10分钟。
本发明的检测方法，还进一步包括样品测定步骤。
根据本发明，所述样品测定步骤包括：在微孔板的微孔中，分别加入处理后的试样液(例如空白对照、测定样品)、NADP+和ATP，混匀后，加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，混匀后反应后，在酶标仪上340nm处读取溶液OD值，记为A1；再加入磷酸葡萄糖异构酶，混匀后反应后，在酶标仪上340nm处读取溶液OD值，记为A2。
优选，NADP+和ATP以NADP+和ATP的混合液形式加入，所述混合液中，NADP+的浓度为7-12mg/mL，ATP的浓度为40-60mg/mL。
优选，己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的混合悬浮液的形式加入，所述悬浮液中己糖激酶的浓度为200-350U/mL，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度为200-350U/mL。
优选，加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶混匀后，在37℃下反应10min。
优选，所述磷酸葡萄糖异构酶溶液的浓度为700-900U/mL。
优选，加入磷酸葡萄糖异构酶混匀后，在37℃下反应15min。
优选，所述样品测定步骤包括：在微孔板的微孔中，分别加入处理后的试样液(例如空白对照、测定样品)、蒸馏水、缓冲液B(140.0g/L三乙醇胺盐酸盐、2.5g/L硫酸镁，pH7.5～7.7)、NADP+和ATP，混匀后，加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，混匀后37℃下反应10min后，在酶标仪上340nm处读取溶液OD值，记为A1；再加入磷酸葡萄糖异构酶，混匀后37℃下反应15min后，在酶标仪上340nm处读取溶液OD值，记为A2。
在本发明的一个具体实施方式中，样品测定方法为：取96孔微孔板，在每个微孔中分别加入下列物质：样液(例如空白对照、测定样品)100μL、蒸馏水100μL、缓冲液B 20μL、NADP+(10mg/mL)和ATP(50mg/mL)混合液10μL后混匀，放置3min；再加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶悬浮液(各为260U/mL)5μL，混匀后放于37℃培养箱中培养10min，取出在酶标仪上340nm处读取溶液OD值(A1)；再加入磷酸葡萄糖异构酶(800U/mL)5μL后混匀放于37℃培养箱中培养15min，取出在酶标仪上340nm读取溶液OD值(A2)；(A2-A1)即为净OD值。
本发明检测方法的检测限为液态奶中乳果糖含量为4.6mg/L。
按照酶法检测反应，本发明检测方法的线性检测范围为0.03～6μg果糖，相当于按照标准检测过程，可测定液态奶中乳果糖含量范围为4.6～920mg/L。
由于酶法检测液态奶中乳果糖的方法，所涉及的酶以及试剂很多，为了提高试剂添加操作的便宜性，本发明的发明人通过分析酶法反应过程的原理，研究各试剂之间的配伍适应性和禁忌，提出了用于酶法检测液态奶中乳果糖的检测试剂组合以及相应的试剂盒，所述试剂组合也适用于前述酶标仪法定量检测液态奶中乳果糖的含量，可减少试剂添加的操作次数，提高工作效率，降低样品间因试剂添加时间差异导致的结果差异。
本发明的第二个方面是，提供一种酶法检测液态奶中乳果糖的检测试剂盒，所述试剂盒包括：葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的混合物冻干粉，NADP+与ATP的混合物冻干粉。
根据本发明，葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的混合物冻干粉中，葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的活性比为1:80～1:600，优选为1:125。
根据本发明，NADP+与ATP的混合物冻干粉中，NADP+与ATP的质量比为1:3～1:10，优选为1:5。
可采用本领域已知的冷冻干燥技术制备本发明的葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的混合物冻干粉，以及NADP+与ATP的混合物冻干粉。
在本发明的一个具体实施方式中，葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的混合物冻干粉的制备方法如下：取活性为40KU的葡萄糖氧化酶与活性为5000KU的过氧化氢酶于10毫升无菌试管中，加入6mL无菌水使其全部溶解，用分液器吸取100μL分装于50个4mL棕色试剂瓶中，放于冻干机中，在200Torr的低真空环境下，使酶溶液在-20℃～-35℃的温度条件下冷冻后再以升华的方式干燥24～72h。将冻干后的酶试剂密封后放于-20℃冰箱中保存。
在本发明的一个具体实施方式中，NADP+和ATP混合物的冻干粉的制备方法如下：分别称取3000mg 5’-腺苷三磷酸二钠盐和600mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐于10mL无菌试管中，加入6mL无菌水使其全部溶解，用分液器吸取100μL分装于50个4mL棕色试剂瓶中，放于冻干机中，在200Torr的低真空环境下，使溶液在-20℃～-35℃的温度条件下冷冻后再以升华的方式干燥24-72h。将冻干后的试剂密封后放于-20℃冰箱中保存。使用时，用1mL蒸馏水溶解，可用聚丙烯管分装后于-20℃冰箱中保存。
本发明的发明人通过研究发现，将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶混合后冻干，所得冻干粉中，两种酶的活性没有相互的影响和干扰，使用时制成混合酶溶液，也不会对两种酶的活性产生影响和干扰。而将两者制成混合试剂，一步加入反应体系中，可减少试剂添加的操作次数。NADP+和ATP混合物的冻干粉也具有同样的技术优点。
根据本发明，所述试剂盒中还包括己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的混合物的悬浮液，所述悬浮液中，己糖激酶的浓度为200-350U/mL，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度为200-350U/mL。
根据本发明，所述试剂盒中还包括：β-半乳糖苷酶悬浮液，所述悬浮液中，β-半乳糖苷酶的浓度为(1.5-3.0)×103U/mL。
根据本发明，所述试剂盒中还包括：磷酸葡萄糖异构酶溶液，所述溶液中，磷酸葡萄糖异构酶的浓度为700-900U/mL。
所述己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的混合物的悬浮液，β-半乳糖苷酶悬浮液和磷酸葡萄糖异构酶溶液，可以按照NY/T939-2016中酶法-分光光度法乳果糖含量测定方法中对应溶液的配制方法进行配制。
根据本发明，所述试剂盒中还包括：缓冲液A和缓冲液B，其中，缓冲液A的组成为：48g/L磷酸氢二钠、8.6g/L磷酸二氢钠、1g/L硫酸镁，pH 7.4～7.6。缓冲液B的组成为：140.0g/L三乙醇胺盐酸盐、2.5g/L硫酸镁，pH 7.5～7.7。
根据本发明，所述试剂盒中还包括：硫酸锌溶液。优选所述硫酸锌溶液中硫酸锌的浓度为168g/L。
根据本发明，所述试剂盒中还包括：亚铁氰化钾溶液。优选所述亚铁氰化钾溶液中亚铁氰化钾的浓度为130g/L。
根据本发明，所述试剂盒中还包括：果糖标准溶液，所述果糖标准溶液中果糖的浓度为50μg/mL。
根据本发明，所述试剂盒中还包括：30％H2O2。
根据本发明，所述试剂盒中还包括：0.33M的NaOH溶液。
根据本发明，所述试剂盒中还包括：辛醇。
根据本发明，所述试剂盒中还包括：适用于酶标仪的微孔板。所述微孔板可以是本领域已知的各类微孔板，例如96孔板，24孔板，48孔板，256孔板等。从检测样品的通量以及样品体积的适宜性角度出发，优选96孔板。
在本发明的一个具体实施方式中，所述试剂盒包括：用于一份96孔板检测用量的如下的上述试剂：
1)样品前处理用试剂：168g/L的硫酸锌溶液5mL；130g/L的亚铁氰化钾溶液5mL；缓冲液A 20mL；β-半乳糖苷酶悬浮液1mL；缓冲液B 12mL；0.33M的NaOH溶液5mL；辛醇2mL；葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的混合物冻干粉；30％的H2O2 2mL；
2)检测用试剂：NADP+和ATP混合物冻干粉；己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶混合物的悬浮液0.6mL；磷酸葡萄糖异构酶0.6mL；果糖标准溶液50μg/mL 2mL。
在本发明第一方面的检测方法中，优选的或者具体的实施方式中所采用的样品体积、试剂体积，以及第二方面的检测试剂盒中试剂的量，都是以96孔板检测样品为例所使用的样品体积、试剂体积以及试剂盒中的包装体积，本领域技术人员可以根据具体检测时使用的微孔板的具体孔数和孔容积，成倍扩大或者缩小所用的样品体积或者试剂体积，试剂盒厂家也可以根据配套试剂盒中的微孔板的孔数及孔容积，来成倍扩大或缩小试剂盒中试剂的包装体积。
本发明的优点：
1、本发明通过建立果糖标准曲线，解决了利用酶标仪法进行酶法检测液态奶中乳果糖含量的技术问题，并且酶标仪检测法，与标准的分光光度法相比，结果一致性强，可以替代现有的标准方法。
2、由于使用了酶标仪，可采用微孔板作为检测载体，大大降低了试剂用量，节约了成本；并且，使用微孔板提高了检测的样品通量，大大提高了检测效率。
3、本发明的试剂盒中提供了酶法测定所用试剂中的数种试剂的混合物制剂，使得样品处理及测定中添加试剂的步骤减少，不但简化了样品处理，而且其测定更为简单方便，避免了因加入试剂的时间差导致的反应差异，最终影响OD值的问题。
附图说明
图1为本发明所述的用于酶法定量检测乳果糖的检测用果糖标准曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。需要说明的是，实施例不能作为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员理解，任何在本发明基础上所作的改进和变化都在本发明的保护范围之内。
以下实施例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。
实施例1检测用试剂的配制
1.葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的混合物冻干粉，NADP+和ATP的混合物冻干粉的制备
(1)葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的混合物冻干粉的制备：取活性为40KU的葡萄糖氧化酶与活性为5000KU的过氧化氢酶于10毫升无菌试管中，加入6mL无菌水使其全部溶解，立即用分液器吸取100μL分装于50个4mL棕色试剂瓶中，放于冻干机中，在200Torr的低真空环境下，使酶溶液在-20℃～-35℃的温度条件下冷冻后再以升华的方式干燥24～72h。将冻干后的酶试剂密封后放于-20℃冰箱中保存。
检测前，将所述混合物冻干粉用无菌水制备成悬浮液使用。
(2)NADP+和ATP混合物冻干粉的制备：分别称取3000mg 5’-腺苷三磷酸二钠盐和600mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐于10mL无菌试管中，加入6mL无菌水使其全部溶解，立即用分液器吸取100μL分装于50个4mL棕色试剂瓶中，放于冻干机中，在200Torr的低真空环境下，使溶液在-20℃～-35℃的温度条件下冷冻后再以升华的方式干燥24-72h。将冻干后的试剂密封后放于-20℃冰箱中保存。
检测前，将所述混合物冻干粉用无菌水制备成溶液使用。
2.果糖标准溶液的制备
准确称取果糖标准物质500mg溶于1000mL无菌水中，即为果糖质量浓度为500μg/mL的标准果糖储备液；吸取标准果糖储备液100mL于1000mL容量瓶中，加入0.2g叠氮化钠后用无菌水定容混匀，即为果糖质量浓度为50μg/mL的果糖标准溶液，然后分装于4mL棕色试剂瓶中。
3.乳果糖标准溶液的制备
准确称取乳果糖标准物质50mg溶于100mL无菌水中，即为乳果糖质量浓度为500μg/mL的标准乳果糖溶液，然后分装于4mL棕色试剂瓶中。
4.硫酸锌溶液(168g/L)、亚铁氰化钾溶液(130g/L)、氢氧化钠溶液(0.33mol/L)的制备
称取168g硫酸锌溶于800mL水中，定容至1L。按5mL/瓶分装于8mL的棕色塑料瓶中。
称取130g亚铁氰化钾溶于800mL水中，定容至1L。按5mL/瓶分装于8mL的棕色塑料瓶中。
称取13.2g氢氧化钠溶于800mL水中，定容至1L。按5mL/瓶分装于8mL的棕色塑料瓶中。
5.缓冲液A(pH为7.5)的制备：
称48g磷酸氢二钠、8.6g磷酸二氢钠和1g硫酸镁溶解于800mL水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH到7.5±0.1(20℃)，再定容到1L。按20mL/瓶分装于30mL的玻璃试剂瓶中。
6.缓冲液B(pH为7.6)的制备：
称取140.0g三乙醇胺盐酸盐和2.5g硫酸镁溶解于800mL水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH到7.6±0.1(20℃)，再定容到1L。按12mL/瓶分装于30mL的玻璃试剂瓶中。
7.缓冲溶液C的制备：取缓冲液B 6mL，用蒸馏水稀释至15mL。
8.β-半乳糖苷酶悬浮液的制备：用3.2mol/L的硫酸铵溶液将β-半乳糖苷酶制备成浓度为2.0×103U/mL的悬浮液。
9.己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的悬浮液：用3.2mol/L的硫酸铵溶液将己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶制成悬浮液，己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度分别为260U/mL和260U/mL。
10.磷酸葡萄糖异构酶悬浮液：用3.2mol/L的硫酸铵溶液将磷酸葡萄糖异构酶制成浓度为800U/mL的悬浮液。
11.无菌水制备
将双蒸水在121℃高压灭菌15分钟，每瓶30ml。
在制备试剂盒时，每个试剂盒中可以包含3瓶无菌水。用于配制上述标准溶液、酶溶液等。
12.其它
其他试剂包括：30％H2O2、辛醇，可按购买的原液使用。在制备试剂盒时，这些试剂可以按照购买的原液进行直接分装。
实施例2灭菌乳中乳果糖的测定
1)样品处理：
吸取奶样0.5mL于2mL的聚丙烯离心管，分别加入蒸馏水1.3mL、168g/L硫酸锌溶液0.1mL、130g/L亚铁氰化钾溶液0.1mL，扣紧盖后涡旋震荡混合，5000rpm离心10分钟。
水解乳糖和乳果糖：取出每个样品分别小心吸取上清液两份，每份500μL于2个2mL的聚丙烯带螺帽的微管中，其中一个管中分别加入缓冲液A 200μL与β-半乳糖苷酶(2.0×103U/mL)20μL作为测定样品；另一管中分别加入缓冲液A200μL与蒸馏水20μL，作为空白对照。涡旋震荡混合后，50℃水浴1h。
葡萄糖氧化：在每个管中分别加入缓冲液C 200μL、0.33M NaOH溶液50μL、辛醇10μL、葡萄糖氧化酶(4.0×103U/mL)和过氧化氢酶(5.0×105U/mL)混合液20μL、30％H2O2 10μL，立刻盖上管帽混匀，在40℃培养箱或水浴中培养3h，取出于5000rpm离心10分钟。
2)样品测定：
取96孔微孔板，在每个微孔中分别加入下列物质：样液(空白对照或测定样品)100μL、蒸馏水100μL、缓冲液B 20μL、NADP+(10mg/mL)和ATP(50mg/mL)混合液10μL后混匀，放置3min；
加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶悬浮液(两者的活性浓度均为260U/mL)5μL，混匀后放于37℃培养箱中培养10min，取出在酶标仪上340nm读取溶液OD值(A1)；
加入磷酸葡萄糖异构酶(800U/mL)5μL后混匀放于37℃培养箱中培养15min，取出在酶标仪上340nm读取溶液OD值(A2)；(A2-A1)即为净OD值。
3)标准曲线绘制：
分别吸取果糖标准溶液0、20、40、60、80、100、120μL于微孔中，用蒸馏水分别补充至200μL，果糖质量分别为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg/孔。再加入缓冲液B 20μL、NADP+(10mg/mL)和ATP(50mg/mL)混合液10μL后混匀，放置3min；加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶悬浮液(两者的活性浓度均为260U/mL)5μL，混匀后放于37℃培养箱中培养10min，取出在酶标仪上340nm读取溶液OD值(A1)；加入磷酸葡萄糖异构酶(800U/mL)5μL后混匀放于37℃培养箱中培养15min，取出在酶标仪上340nm读取溶液OD值(A2)。以(A2-A1)为纵坐标，果糖质量(μg)/孔为横坐标绘制标准曲线或计算回归方程。所述标准曲线图见附图1。
对同一灭菌乳样品进行6次同步实验，根据标准曲线和计算公式，获得样品中乳果糖的含量结果如表1。
式中：
X：样品中乳果糖含量，单位为mg/L
c：由标准曲线或回归方程计算得到的微孔中果糖含量，单位为μg
f：转换系数
V1：吸取奶样的体积，0.50mL；
V2：沉淀离心后的体积，2.00mL；
V3：吸取离心后上清液的体积，0.50mL；
V4：葡萄糖氧化后的体积，1.01mL；
V5：吸取样液进行比色测定的体积，0.10mL；
ML—乳果糖的摩尔质量，342.3g/mol；
MF—果糖的摩尔质量，180.16g/mol；
计算得到转换系数f＝153.52。
表1同一种灭菌乳中乳果糖含量的测定
序号 净OD值 乳果糖含量(mg/L)
1 0.425 502
2 0.431 509
3 0.447 528
4 0.435 514
5 0.419 495
6 0.428 505
由表1结果计算得到的相对标准偏差RSD＝2.24％
由上述可得，相对标准偏差为2.24％，则表明其重现性良好。
实施例3测定方法的回收率
利用液态奶作为基质进行加标，采用实施例2相同的检测方法，检验本发明测定方法的回收率，结果如表2所示：
表2回收率测定结果
实施例4用乳果糖绘制标准曲线和用果糖绘制标准曲线结果对比
1)果糖标准曲线绘制：分别吸取果糖标准溶液0、20、40、60、80、100、120μL于微孔中，用蒸馏水分别补充至200μL，果糖质量分别为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg/孔。再加入缓冲液B 20μL、NADP+(10mg/mL)和ATP(50mg/mL)混合液10μL后混匀，放置3min；加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶悬浮液(均为260U/mL)5μL，混匀后放于37℃培养箱中培养10min，取出在酶标仪上340nm读取溶液OD值(A1)；加入磷酸葡萄糖异构酶(800U/mL)5μL后混匀放于37℃培养箱中培养15min，取出在酶标仪上340nm读取溶液OD值(A2)。以(A2-A1)为纵坐标，果糖质量(μg)/孔为横坐标绘制标准曲线或计算回归方程。
2)乳果糖标准曲线绘制：分别吸取乳果糖标准溶液0、40、80、120、160、200、240μL于2mL的聚丙烯带螺帽的微管中，用蒸馏水分别补充至500μL，乳果糖质量分别为0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0μg/管。分别加入缓冲液A 200μL与β-半乳糖苷酶(2.0×103U/mL)20μL，涡旋震荡混合后，50℃水浴1h。在每个管中分别加入缓冲液C 200μL、0.33MNaOH溶液100μL、辛醇10μL、葡萄糖氧化酶(4.0×103U/mL)和过氧化氢酶(5.0×105U/mL)混合液20μL、30％H2O210μL，立刻盖上管帽混匀，在40℃培养箱或水浴中培养3h，取出于5000rpm离心10分钟。取96孔微孔板，在每个微孔中分别加入下列物质：上述离心后的标准样液100μL、蒸馏水100μL、缓冲液B 20μL、NADP+(10mg/mL)和ATP(50mg/mL)混合液10μL后混匀，放置3min；加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶悬浮液(均为260U/mL)5μL，混匀后放于37℃培养箱中培养10min，取出在酶标仪上340nm读取溶液OD值(A1)；加入磷酸葡萄糖异构酶(800U/mL)5μL后混匀放于37℃培养箱中培养15min，取出在酶标仪上340nm读取溶液OD值(A2)；(A2-A1)即为净OD值。以(A2-A1)为纵坐标，乳果糖质量(μg)/孔为横坐标绘制标准曲线或计算回归方程。
3)样品测定：同实施例2。
选取7个液态奶样品，分别采用乳果糖绘制标准曲线和果糖绘制标准曲线进行定量，结果对比如下表3。
表3乳果糖绘制标准曲线和果糖绘制标准曲线定量结果对比
样品编号 乳果糖标准曲线 果糖标准曲线 相对相差(％)
1 807.1 780.6 3.3
2 785.3 743.5 5.5
3 567.7 536.0 5.8
4 605.4 583.7 3.6
5 664.4 687.4 3.4
6 483.8 442.9 8.8
7 387.7 388.3 0.2
由上表可见，本发明用果糖绘制标准曲线和用乳果糖绘制标准曲线的定量结果一致性很好。但是用果糖做标准曲线，可以省去半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶等酶解过程，大大简化了操作步骤，减少了检测试剂使用，节约了成本。
实施例5酶标仪法与分光光度法的对比
选取7个液态奶样品，分别采用实施例2的酶标仪法和NY/T 939-2016的酶法-分光光度法进行检测，结果如下表：
由上表可见，本发明的酶标仪检测法和标准的分光光度法的一致性很好。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (41)

1.一种酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的方法，其包括如下步骤：以果糖为标准品建立标准曲线，所述标准曲线的建立步骤包括：在酶标仪用微孔板中加入果糖标准品溶液，使每孔中果糖质量依次呈等差增长或呈倍数增长，加入NADP+和ATP后混匀；再加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶混匀后反应，在酶标仪上340nm处读取溶液OD值，记为A1，再加入磷酸葡萄糖异构酶混匀后反应，在酶标仪上340nm读取溶液OD值，记为A2；以(A2-A1)的值为净OD值，作为纵坐标，以每孔中果糖质量为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在微孔板中的4-10个孔中加入果糖标准品溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每孔中的果糖质量以μg为单位。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每孔中的果糖质量依次呈等差增长。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，孔中果糖质量依次为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg/孔。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每孔中的果糖质量依次呈倍数增长。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，还包括检测奶样的(A2-A1)的值，根据果糖标准曲线换算出奶样中乳果糖的含量，所述换算公式为：
式中：
X：样品中乳果糖含量，单位为mg/L；
C：由标准曲线或回归方程计算得到的奶样微孔中果糖含量，单位为μg；
f：转换系数；
V1：检测开始时吸取的奶样体积，单位为mL；
V2：样品前处理过程中沉淀样品中脂肪和蛋白质离心后的体积，单位为mL；
V3：吸取离心后上清液的体积，单位为mL；
V4：葡萄糖氧化步骤后的试样液的总体积，单位为mL；
V5：进行酶标仪测定时，加入微孔板中的试样液的体积，单位为mL；
ML：乳果糖的摩尔质量，342.3g/mol；
MF：果糖的摩尔质量，180.16g/mol。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，进一步包括样品前处理步骤，所述样品前处理步骤包括：采用硫酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液沉淀液态奶样品中的蛋白与脂肪，离心后，取上清液，加入β-半乳糖苷酶溶液水解上清液中的乳糖和乳果糖，然后加入葡萄糖氧化酶溶液和过氧化氢酶溶液氧化葡萄糖。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述硫酸锌溶液的浓度为168g/L。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述亚铁氰化钾溶液的浓度为130g/L。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶溶液的浓度为(1.5-3.0)×103U/mL。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于，β-半乳糖苷酶溶液水解上清液中的乳糖和乳果糖的反应条件为50℃培养箱或水浴1h。
13.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶溶液的浓度为(3.0-5.0)×103U/mL。
14.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述过氧化氢酶溶液的浓度为(4.0-6.0)×105U/mL。
15.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶制成混合酶溶液使用，其中葡萄糖氧化酶的浓度为(3.0-5.0)×103U/mL，过氧化氢酶的浓度为(4.0-6.0)×105U/mL。
16.如权利要求8所述的方法，其特征在于，葡萄糖氧化酶溶液和过氧化氢酶溶液氧化葡萄糖的反应条件为40℃培养箱或水浴培养3h。
17.如权利要求8所述的方法，其特征在于，进一步包括样品测定步骤，所述样品测定步骤包括：在微孔板的微孔中，分别加入处理后的试样液、NADP+和ATP混匀后，加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，混匀后反应，在酶标仪上340nm处读取溶液OD值，记为A1；再加入磷酸葡萄糖异构酶，混匀后反应后，在酶标仪上340nm处读取溶液OD值，记为A2。
18.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述NADP+和ATP以NADP+和ATP的混合液形式加入，所述混合液中，NADP+的浓度为7-12mg/mL，ATP的浓度为40-60mg/mL。
19.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的混合悬浮液的形式加入，所述悬浮液中己糖激酶的浓度为200-350U/mL，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度为200-350U/mL。
20.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶混匀后，在37℃下反应10min。
21.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述磷酸葡萄糖异构酶溶液的浓度为700-900U/mL。
22.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，加入磷酸葡萄糖异构酶混匀后，在37℃下反应15min。
23.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述NADP+和ATP以NADP+和ATP的混合液形式加入，所述混合液中，NADP+的浓度为7-12mg/mL，ATP的浓度为40-60mg/mL。
24.如权利要求17所述的方法，其特征在于，己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的混合悬浮液的形式加入，所述悬浮液中己糖激酶的浓度为200-350U/mL，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度为200-350U/mL。
25.如权利要求17所述的方法，其特征在于，加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶混匀后，在37℃下反应10min。
26.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述磷酸葡萄糖异构酶溶液的浓度为700-900U/mL。
27.如权利要求17所述的方法，其特征在于，加入磷酸葡萄糖异构酶混匀后，在37℃下反应15min。
28.一种用于权利要求1-27任一项检测方法的酶法定量检测液态奶中乳果糖含量的检测试剂盒，所述试剂盒包括：葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的混合物冻干粉，NADP+与ATP的混合物冻干粉；所述葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的混合物冻干粉中，葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的活性比为1:80～1:600；所述NADP+与ATP的混合物冻干粉中，NADP+与ATP的质量比为1:3～1:10；
己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的混合物的悬浮液，所述悬浮液中，己糖激酶的浓度为200-350U/mL，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的浓度为200-350U/mL；
果糖标准溶液，所述果糖标准溶液中果糖的浓度为50μg/mL。
29.如权利要求28所述的检测试剂盒，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的混合物冻干粉中，葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的活性比为1:125。
30.如权利要求28所述的检测试剂盒，其特征在于，所述NADP+与ATP的混合物冻干粉中，NADP+与ATP的质量比为1:5。
31.如权利要求28-30任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：β-半乳糖苷酶悬浮液，所述悬浮液中，β-半乳糖苷酶的浓度为1.5×103-3.0×103U/mL。
32.如权利要求28-30任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：磷酸葡萄糖异构酶溶液，所述溶液中，磷酸葡萄糖异构酶的浓度为700-900U/mL。
33.如权利要求28-30任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：缓冲液A和缓冲液B，其中，缓冲液A的组成为：48g/L磷酸氢二钠、8.6g/L磷酸二氢钠、1g/L硫酸镁，pH7.4～7.6；缓冲液B的组成为：140.0g/L三乙醇胺盐酸盐、2.5g/L硫酸镁，pH7.5～7.7。
34.如权利要求28-30任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：硫酸锌溶液。
35.如权利要求34所述的检测试剂盒，其特征在于，所述硫酸锌溶液中硫酸锌的浓度为168g/L。
36.如权利要求28-30任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：亚铁氰化钾溶液。
37.如权利要求36所述的检测试剂盒，其特征在于，所述亚铁氰化钾溶液中亚铁氰化钾的浓度为130g/L。
38.如权利要求28-30任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：30％H2O2。
39.如权利要求28-30任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：0.33M的NaOH溶液。
40.如权利要求28-30任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：辛醇。
41.如权利要求28-30任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：适用于酶标仪的微孔板。
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