CN106770209A - 一种精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒及其应用；该试剂盒包括R1试剂、R2试剂、校准品和冻干精浆质控品；所述R1试剂为包含EDTA·2Na的Tris‑HCl缓冲液；所述的R2试剂为包含邻苯三酚的盐酸溶液；所述校准品为超氧化物歧化酶溶液；所述冻干精浆质控品为定值的含超氧化物歧化酶的精浆冻干粉。本发明的试剂盒可以与全自动生化分析仪配套使用来检测精浆中超氧化物歧化酶活性，该试剂盒在检测精浆超氧化物歧化酶时，基质效应小、需要试剂量和样本量少、结果的准确度和精密度高，同时可与精浆生化的其他项目联检。

Description

一种精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及第二类体外诊断试剂，具体涉及一种精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒及其应用。
背景技术
精液中氧自由基和抗氧化剂的平衡是保持正常生育能力的基础，这种平衡的打破可能是造成男性不育和精子质量下降的重要原因。精浆中抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase，GPX)等。抗氧化酶的主要生理功能是防止氧自由基(reactiveoxygen species，ROS)对细胞的损害，在正常情况下对细胞的生存也是必不可少的。ROS包括超氧化物阴离子(O2 -)、过氧化氢(H2O2)和羟基(OH-)，O2 -是需氧代谢的副产物，它可以自动歧化或被SOD转化为H2O2，CAT或GPX则将H2O2转为H2O和O2，从而清除ROS。在这三种主要的抗氧化酶中，SOD不仅自身能将O2 -转化为H2O2，而且对CAT或GPX将H2O2转化为H2O和O2的反应具有催化作用，因而在清除ROS的过程中具有关键的作用。当精浆中SOD活性降低时，过多的氧自由基可使精子线粒体膜、精子质膜发生脂质过氧化，从而影响精子活动力，同时，脂质过氧化产生的降解产物如丙二醛等，可抑制精子线粒体功能和包括腺苷酸环化酶在内的多种酶的活性，从而影响精子的运动功能，导致男性不育。
目前临床上尚缺乏精浆中超氧化物歧化酶的检测方法，仅在一些科研文献中报道过邻苯三酚法、黄嘌呤氧化酶法、放射免疫分析法(RIA)和四唑盐法(WST-1法)等检测方法，且均为手工法，加样程序多，操作步骤复杂，不但耗时耗力，而且人为误差也比较大，因此大大限制了其在临床上的广泛应用。在血清超氧化物歧化酶的检测中有应用到全自动生化分析仪，但是由于血清和精浆的组成和超氧化物歧化酶活性的差异，目前没有文献证明运用全自动生化分析仪检测血清中超氧化物歧化酶的试剂盒适用于检测精浆中超氧化物歧化酶。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒，该试剂盒在检测精浆超氧化物歧化酶时，基质效应小、需要试剂量和样本量少、结果的准确度和精密度高，同时可与精浆生化的其他项目联检。
本发明还提供了一种精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒的应用，该试剂盒可以在全自动生化分析仪上应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种精浆超氧化物歧化酶，包括R1试剂、R2试剂、校准品和冻干精浆质控品；所述R1试剂为包含EDTA·2Na的Tris-HCl缓冲液；所述的R2试剂为包含邻苯三酚的盐酸溶液；所述校准品为超氧化物歧化酶溶液；所述冻干精浆质控品为定值的含超氧化物歧化酶的精浆冻干粉。
其中，所述R1试剂中EDTA·2Na的浓度为0.5～5.0mmol/L，Tris的浓度0.01～0.06mol/L，pH为8.0～8.5。
所述R2试剂中邻苯三酚的浓度为0.5～2.5mmol/L，盐酸的浓度为0.005～0.015mol/L。
所述校准品活性为30U/mL和90U/mL。
所述超氧化物歧化酶溶液的溶剂为包含酶保护剂的磷酸盐缓冲液，pH＝7.5～8.0，其中酶保护剂为D-海藻糖，浓度为0.15～0.5mol/L。选用pH＝7.5～8.0的磷酸盐缓冲液时超氧化物歧化酶的活性最好；磷酸盐缓冲液优选由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制，其中缓冲液中磷酸根浓度为0.01～0.1mol/L。
所述冻干精浆质控品在冻干前加入保护剂蔗糖、甘氨酸和NaCl，以及防腐剂山梨酸钾，使蔗糖、甘氨酸、NaCl和山梨酸钾的浓度分别为0.01～0.02mol/L、0.05～0.1mol/L、0.01～0.03mol/L和0.01～0.03g/dl，精浆已被检定HBsAg、HCV抗体、HIV1+2抗体和梅毒均为阴性。
所述冻干精浆质控品的定值范围通过以下步骤获得：
取冻干前精浆等体积的纯化水复溶该冻干精浆质控品，混匀后，分装，-25～-20℃保存，备用；从-25～-20℃中每天取出1支分装后的冻干精浆质控品，室温下自然解冻，混匀后用该试剂盒每天检测1次，连续1个月，计算这些数据的平均值、标准差、±2倍标准差，以平均值为该质控品的靶值，平均值±2倍标准差为该质控品的定值范围。
进一步地，所述精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒包括R1试剂、R2试剂、2瓶校准品、冻干精浆质控品、说明书和内衬。
本发明所述的精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒在全自动生化分析仪上的应用。
所述应用的检测步骤为：
(1)试剂和样本的准备：采集精液、液化，3000～10000r/min离心5～10min分离精浆，即刻用于检测；试剂盒从2～8℃取出后，于室温下平衡30～60min；其中优选通过手淫法采集禁欲2～7天的精液于采样杯中，置37℃水浴箱中液化；精浆量应大于0.5mL，液化良好；不能立即检测的精浆样本于-20℃可保存1个月，避免反复冻融；
(2)全自动生化分析仪的主、副波长分别为330～340nm、660～700nm，R1/样本/R2加样量按体积比40:1:12，范围为(120～200μl):(3～5μl):(36～60μl)；优选200/5/60μl；全自动生化分析仪选自迈瑞BS-380型全自动生化分析仪、劳拉Faith-1000型全自动生化分析仪、奥林巴斯AU400型全自动生化分析仪或科华310型全自动生化分析仪；
(3)检测方法：速率法，加入R1和样品后混匀，37℃孵育5min，加入R2后混匀，37℃孵育2～5min，连续测定2～5min内的吸光度变化，仪器自动计算吸光度变化率△A/min；
(4)计算公式：
样本中SOD活性(U/mL)＝K×△A/min+B
式中，K和B分别为校准曲线的斜率和截距，通过全自动生化仪自动测定校准品得到；
△A/min通过全自动生化仪自动测定样本得到。
(5)取冻干前精浆等体积的纯化水复溶冻干精浆质控品，混匀后，分装，-25～-20℃保存，备用；从-25～-20℃中取出一支分装后的冻干精浆质控品，在室温下自然解冻、混匀，将此冻干精浆质控品随着样本一起检测，根据质控品结果是否在定值范围内以判断样本结果是否在控。
本发明中所使用的试剂和药品均由市售可得。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明提供一种与全自动生化分析仪配套使用的检测精浆中超氧化物歧化酶活性的试剂盒，该试剂盒在检测精浆超氧化物歧化酶时，基质效应小、需要试剂量和样本量少、结果的准确度和精密度高，同时可与精浆生化的其他项目联检。
2、该试剂盒中不仅提供双校准品，还配备定值的质控品。校准品是保证临床检测准确一致的主要工具，同时也是量值有效传递的计量实物标准。质控品是临床实验室质量管理体系的重要环节，同时也是实验室发出检验报告的准确性和可靠性的保证。试剂盒中的双定标液和质控品可保证临床检验结果的准确性和室间一致性。
3、质控品在冻干前，加入了一定比例的防腐剂和保护剂。保护剂、防腐剂和冻干过程都是确保质控品中极易失活的超氧化物歧化酶稳定的重要举措。
4、本发明提供了一种在全自动生化分析仪上配套使用的检测精浆超氧化物歧化酶试剂盒的检测方法，该方法操作简便，适用于目前市场上所有的全自动生化分析仪，从而弥补了精浆全自动生化在检测超氧化物歧化酶方面的空白。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒，包括如下成分：
R1试剂：含EDTA·2Na和Tris-HCl的缓冲液，每升R1试剂中含有5.0mmol EDTA·2Na和0.01mol Tris，该溶液用浓盐酸调整pH至8.00。
R2试剂：含邻苯三酚的盐酸溶液，每升R2溶液中含有0.5mmol邻苯三酚和0.015mol盐酸。
校准品1为活性30U/mL的超氧化物歧化酶溶液，校准品2为活性90U/mL的超氧化物歧化酶溶液，该超氧化物歧化酶溶液为包含酶保护剂D-海藻糖的磷酸盐缓冲液，每升超氧化物歧化酶溶液中含0.15mol D-海藻糖和0.01mol磷酸根，该磷酸盐缓冲液由0.01mol/L磷酸二氢钠溶液调节0.01mol/L磷酸氢二钠溶液，使其pH值在7.5。
冻干精浆质控品在冻干前加入保护剂蔗糖、甘氨酸和NaCl，以及防腐剂山梨酸钾，使蔗糖、甘氨酸、NaCl和山梨酸钾的浓度分别为0.01mol/L、0.05mol/L、0.01mol/L和0.01g/dl，精浆已被检定HBsAg、HCV抗体、HIV1+2抗体和梅毒均为阴性，混匀后分装，冻干。
该质控品的定值方法：取冻干前精浆等体积的纯化水复溶该冻干精浆质控品，混匀后，分装，-20℃保存，备用；从-20℃每天取出1支分装后质控品，室温下自然解冻，混匀后用该试剂盒每天检测1次，连续1个月，计算这些数据的平均值、标准差、±2倍标准差，以平均值为该质控品的靶值，平均值±2倍标准差为该质控品的定值范围。
实施例2
精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒，包括如下成分：
R1试剂：含EDTA·2Na和Tris-HCl的缓冲液，每升R1试剂中含有0.5mmol EDTA·2Na和0.06mol Tris，该溶液用浓盐酸调整pH至8.50。
R2试剂：含邻苯三酚的盐酸溶液，每升R2溶液中含有2.5mmol邻苯三酚和0.005mol盐酸；
校准品1为活性30U/mL的超氧化物歧化酶溶液，校准品2为活性90U/mL的超氧化物歧化酶溶液，该超氧化物歧化酶溶液为包含酶保护剂D-海藻糖的磷酸盐缓冲液，每升超氧化物歧化酶溶液中含0.5mol D-海藻糖和0.1mol磷酸根，该磷酸盐缓冲液由0.1mol/L磷酸二氢钠溶液调节0.1mol/L磷酸氢二钠溶液，使其pH值在8.0；
冻干精浆质控品在冻干前加入保护剂蔗糖、甘氨酸和NaCl，以及防腐剂山梨酸钾，使蔗糖、甘氨酸、NaCl和山梨酸钾的浓度分别为0.02mol/L、0.1mol/L、0.03mol/L和0.03g/dl，精浆已被检定HBsAg、HCV抗体、HIV1+2抗体和梅毒均为阴性，混匀后分装，冻干。
该质控品的定值方法：取冻干前精浆等体积的纯化水复溶该冻干精浆质控品，混匀后，分装，-25℃保存，备用；从-25℃每天取出1支分装后质控品，室温下自然解冻，混匀后用该试剂盒每天检测1次，连续1个月，计算这些数据的平均值、标准差、±2倍标准差，以平均值为该质控品的靶值，平均值±2倍标准差为该质控品的定值范围。
实施例3
精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒，包括如下成分：
R1试剂：含EDTA·2Na和Tris-HCl的缓冲液，每升R1试剂中含有2.5mmol EDTA·2Na和0.03molTris，该溶液用浓盐酸调整pH至8.20。
R2试剂：含邻苯三酚和盐酸，每升R2溶液中含有1.5mmol邻苯三酚和0.01mol盐酸。
校准品1为活性30U/mL的超氧化物歧化酶溶液，校准品2为活性90U/mL的超氧化物歧化酶溶液，该超氧化物歧化酶溶液为包含酶保护剂D-海藻糖的磷酸盐缓冲液，每升超氧化物歧化酶溶液中含0.3mol D-海藻糖和0.05mol磷酸根，该磷酸盐缓冲液由0.05mol/L磷酸二氢钠溶液调节0.05mol/L磷酸氢二钠溶液，使其pH值在7.8；
冻干精浆质控品在冻干前加入保护剂蔗糖、甘氨酸和NaCl，以及防腐剂山梨酸钾，使蔗糖、甘氨酸、NaCl和山梨酸钾的浓度分别为0.015mol/L、0.075mol/L、0.02mol/L和0.02g/dl，精浆已被检定HBsAg、HCV抗体、HIV1+2抗体和梅毒均为阴性，混匀后分装，冻干。
该质控品的定值方法：取冻干前精浆等体积的纯化水复溶该冻干精浆质控品，混匀后，分装，-20℃保存，备用；从-20℃每天取出1支分装后质控品，室温下自然解冻，混匀后用该试剂盒每天检测1次，连续1个月，计算这些数据的平均值、标准差、±2倍标准差，以平均值为该质控品的靶值，平均值±2倍标准差为该质控品的定值范围。
实施例4
实施例1-3的精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒各成分采用如下步骤制得，其中不同实施例的各物质的质量或体积根据最终的浓度分别计算配制：
1、R1的制备工艺方法
称定三羟甲基氨基甲烷(Tris)、二水合乙二胺四乙酸二钠，加适量纯化水溶解，然后用盐酸调pH值为8.0～8.5，定容，混匀后分装，贴标签，检验，置于2～8℃保存。
2、R2的制备工艺方法
精密量取盐酸置烧杯中，加入纯化水中，搅拌至混匀，再将称定好的焦性没食子酸(邻苯三酚)加入烧杯中，用配好的盐酸溶液溶解、定容、混匀，分装，贴标签，检验，置于2～8℃避光保存。
3、校准品的制备工艺方法
3.1称定二水合磷酸二氢钠、D-海藻糖，加纯化水搅拌至溶解，得到磷酸二氢钠溶液，置于2～8℃保存。
3.2称定十二水合磷酸氢二钠、D-海藻糖，加纯化水搅拌至溶解，得到磷酸氢二钠溶液，置于2～8℃保存。
3.3用磷酸二氢钠溶液调磷酸氢二钠溶液，使其pH在7.5-8.0，得到校准品的溶剂，置于2～8℃保存。
3.4精密量取0.1mL 7500U/mL超氧化物歧化酶溶液置烧杯中，加24.9mL pH7.5～8.0磷酸盐缓冲液搅拌至混匀，得到30U/mL超氧化物歧化酶校准品1，置于2～8℃避光保存。
3.5精密量取0.3mL 7500U/mL超氧化物歧化酶溶液置烧杯中，加24.7mL pH7.5～8.0磷酸盐缓冲液搅拌至混匀，得到90U/mL超氧化物歧化酶校准品2，置于2～8℃避光保存。
4、质控品的制备工艺方法
收集已完全液化且HCV抗体、HIV1+2抗体、HBsAg和梅毒检测均为阴性的男性新鲜精液样本，离心后取上清液、混合，加入NaCl、蔗糖、甘氨酸和山梨酸钾，搅拌、溶解、混匀、分装、冻干。
真空冷冻干燥机的冻干步骤：设置冻干程序，如表1。启动真空冷冻干燥机，-30℃预冻6h后，启动冻干程序。冻干结束，放气取出，封盖，得到干粉状的精浆超氧化物歧化酶质控品。
表1冻干精浆质控品冻干程序
温度(℃) 时间(min)
-20 900
-15 360
-10 360
-5 180
0 180
10 180
15 180
20 249
实施例5
用精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒检测精浆中超氧化物歧化酶活性，具体步骤为：
一、样本准备及要求
手淫法采集禁欲7天的精液于采样杯中，置37℃水浴箱中液化，3000r/min离心10min分离精浆，即刻用于检测。精浆量0.8mL，液化良好。不能立即检测的精浆样本于-20℃可保存1个月，避免反复冻融。
二、试剂准备
选取实施例1至3中任意一组试剂盒。
将R1、R2和校准品从2℃取出，室温下平衡30min。
三、检测方法
1、基本参数：
采用迈瑞BS-380型全自动生化分析仪，主/副波长：340nm/660nm；温度：
37℃；方法：速率法；反应方向：上升
2、操作步骤
3、计算公式：
样本中SOD活性(U/mL)＝K×△A/min+B
式中，K和B分别为校准曲线的斜率和截距，通过全自动生化仪自动测定校准品得到；
△A/min通过全自动生化分析仪自动测定样本得到。
4、质控品的检测：取冻干前精浆等体积的纯化水复溶该冻干精浆质控品，混匀后，分装，-20℃保存，备用；从-20℃中取出一支分装后的冻干精浆质控品，在室温下自然解冻、混匀，将此冻干精浆质控品随着样本一起检测，根据质控品结果是否在定值范围内以判断样本结果是否在控。
四、该试剂盒的主要性能指标
1.试剂空白吸光度变化率(ΔA/min)≤0.2；
2.线性范围：[5～160]U/mL，r≥0.990；
3.重复性：CV≤8％；
4.批间差：R≤10％；
5.准确度(相对偏差)：B≤±10％。
五、报告结果
样本检测结束后，以汇总报告的形式输出。
六、参考区间
根据正常生育男性精浆超氧化物歧化酶检测结果，以第5百分位数确定正常参考值区间，精浆超氧化物歧化酶的参考区间≥27.26U/mL。
七、临床适用症状
本试剂盒用于体外检测精浆中超氧化物歧化酶(SOD)的活性。
精浆中的SOD能有效地清除O2 -类自由基，对抗脂质过氧化反应。在维护精液中的抗氧化系统和抗氧化产生的损伤方面起着关键性的作用。如果样本中SOD活性过低，无法有效地清除O2 -类自由基，可能导致精子功能受损，进而引起不育。
实施例6
用精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒检测精浆中超氧化物歧化酶活性，具体步骤为：
一、样本准备及要求
手淫法采集禁欲2天的精液于采样杯中，置37℃水浴箱中液化，10000r/min离心5min分离精浆，即刻用于检测。精浆量3mL，液化良好。不能立即检测的精浆样本于-20℃可保存1个月，避免反复冻融。
二、试剂准备
选取实施例1至3中任意一组试剂盒。
将R1、R2和校准品从8℃取出，室温下平衡60min。
三、检测方法
1、基本参数：
采用奥林巴斯AU400型全自动生化分析仪，主/副波长：330nm/700nm；温度：37℃；方法：速率法；反应方向：上升
2、操作步骤
3、计算公式：
样本中SOD活性(U/mL)＝K×△A/min+B
式中，K和B分别为校准曲线的斜率和截距，通过全自动生化仪自动测定校准品得到；
△A/min通过全自动生化分析仪自动测定样本得到。
4、质控品的检测：取冻干前精浆等体积的纯化水复溶该冻干精浆质控品，混匀后，分装，-25℃保存，备用；从-25℃中取出一支分装后的冻干精浆质控品，在室温下自然解冻、混匀，将此冻干精浆质控品随着样本一起检测，根据质控品结果是否在定值范围内以判断样本结果是否在控。
四、该试剂盒的主要性能指标
1.试剂空白吸光度变化率(ΔA/min)≤0.2；
2.线性范围：[5～160]U/mL，r≥0.990；
3.重复性：CV≤8％；
4.批间差：R≤10％；
5.准确度(相对偏差)：B≤±10％。
五、报告结果
样本检测结束后，以汇总报告的形式输出。
六、参考区间
根据正常生育男性精浆超氧化物歧化酶检测结果，以第5百分位数确定正常参考值区间，精浆超氧化物歧化酶的参考区间≥27.26U/mL。
七、临床适用症状
本试剂盒用于体外检测精浆中超氧化物歧化酶(SOD)的活性。
精浆中的SOD能有效地清除O2 -类自由基，对抗脂质过氧化反应。在维护精液中的抗氧化系统和抗氧化产生的损伤方面起着关键性的作用。如果样本中SOD活性过低，无法有效地清除O2 -类自由基，可能导致精子功能受损，进而引起不育。
试验例1
采用实施例5的检测方法，采用实施例1所制备的试剂盒确认该试剂盒的线性范围，线性范围确认：取超氧化物歧化酶标准液，配制成理论活性为5、10、20、40、60、80、100、120、140、150、160U/mL超氧化物歧化酶标准品进行检测，相应活性的标准品放入样本盘，仪器先定标，主/副波长：340/660nm，光径1cm下，每个活性测试3次，分别求出每个活性检测结果的均值。以理论活性为自变量，以每个理论活性检测结果均值为因变量作出线性图，求出线性回归方程，并计算线性回归的相关系数。用上述方法中理论活性代入线性回归方程，计算理论活性的计算值及检测均值与计算值的相对偏差，结果如表2。
表2试剂盒的线性范围检测结果
由表2可知，通过该试验例说明试剂盒在[5-160]U/mL内检测结果准确，因为该试剂盒的参考区间为：≥27.26U/mL，说明该试剂盒在检测正常和异常样本的结果方面都是可靠的。同时采用实施例2和3的试剂盒或者实施例6的检测方法，结果与上述类似。
试验例2
采用实施例5的检测方法，分别采用实施例1～3所制备的试剂盒进行试剂盒的重复性检测，重复性检测方法：包括样本收集、准备，然后上机测试，分别用试剂盒测定同一份精浆，重复检测10次，取平均值按下列公式计算重复性变异系数(CV)，式中：重复检测10次所得结果的平均值；S：重复检测10次所得结果的标准差；CV：变异系数；其结果如表3所示。
表3试剂盒的重复性检测结果
由表3的结果可知，该试剂盒检测结果的精密度较好，同时采用实施例6的检测方法，结果与上述类似。
试验例3
采用实施例5的检测方法，分别采用实施例1～3所制备的试剂盒进行试剂盒的准确性检测，准确度使用分别试剂盒检测质控品，重复检测3次，计算测试结果的平均值(M)，按下列公式计算相对偏差(B)，
式中：M：测试结果的平均值；T：质控品定值；结果如表4。
表4.试剂盒准确度的检测结果
由表3的结果可知，试剂盒的测试准确度比较好，同时采用实施例6的检测方法，结果与上述类似。
试验例4
基质效应的评估采用实施例5的检测方法以及实施例2的试剂盒，选择1个精浆样本，按照表5的方法制备基础样本，分析样本1，分析样本2和分析样本3；
表5基质效应样本的制备方法
将制备的样本在迈瑞BS380全自动生化分析仪上重复检测3次，对结果进行分析，如表6所示。
表6基质效应样本检测结果
通过表6可知，该试剂盒的回收率差值(≤±10％)和比例系统误差(≤5％)都符合要求，说明该试剂盒的基质效应小。同时采用实施例1和3的试剂盒或者实施例6的检测方法，结果与上述类似。
试验例5
与其他项目联检
采用实施例5的检测方法以及使用实施例1的试剂盒对一精浆样本中超氧化物歧化酶活性进行检测；
同时使用南京欣迪生物药业工程有限责任公司已上市的四个全自动试剂盒：精浆果糖定量检测试剂盒(果糖脱氢酶法)(注册证号：苏食药监械(准)字2014第2400712号)(简称FDH)、精浆锌定量检测试剂盒(PAN法)(注册证号：苏食药监械(准)字2014第2400711号)(简称ZN)、精浆α-葡糖苷酶定量检测试剂盒(速率法)(注册证号：苏食药监械(准)字2014第2400709号)(简称TAG)和精浆γ-L-谷氨酰转肽酶定量检测试剂盒(速率法)(注册证号：苏食药监械(准)字2014第2400710号)(简称GGT)在全自动生化分析仪上对该精浆样本中精浆果糖、精浆锌、精浆α-葡糖苷酶和精浆γ-L-谷氨酰转肽酶进行检测，检测方法参考四种试剂盒的使用说明书。
在全自动生化分析仪上将精浆超氧化物歧化酶检测项目与精浆果糖、精浆锌、精浆α-葡糖苷酶和精浆γ-L-谷氨酰转肽酶项目同时申请检测同一精浆样本，重复10次，检测结果如表7：
表7项目联检的检测结果
由表7的结果能看出，该试剂盒与其他几个试剂盒同时检测同一样本，该试剂盒的重复性满足性能指标中要求；同时采用实施例2和3的试剂盒或者实施例6的检测方法，结果与上述类似。
结论：通过以上的试验结果表明，该试剂盒在检测精浆超氧化物歧化酶活性时，基质效应小、结果的准确度和精密度高，同时可与精浆生化的其他项目联检；同时R1/样本/R2最大加样量只需为200/5/60μl，所以需要试剂量和样本量少。

Claims (10)

1.一种精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂、校准品和冻干精浆质控品；所述R1试剂为包含EDTA·2Na的Tris-HCl缓冲液；所述的R2试剂为包含邻苯三酚的盐酸溶液；所述校准品为超氧化物歧化酶溶液；所述冻干精浆质控品为定值的含超氧化物歧化酶的精浆冻干粉。
2.根据权利要求1所述的精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中EDTA·2Na的浓度为0.5～5.0mmol/L、Tris的浓度0.01～0.06mol/L，pH为8.0～8.5。
3.根据权利要求1所述的精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中邻苯三酚的浓度为0.5～2.5mmol/L，盐酸的浓度为0.005～0.015mol/L。
4.根据权利要求1所述的精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒，其特征在于，所述校准品活性为30U/mL和90U/mL。
5.根据权利要求1所述的精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒，其特征在于，所述超氧化物歧化酶溶液的溶剂为包含酶保护剂的磷酸盐缓冲液，pH＝7.5～8.0，其中酶保护剂为D-海藻糖，浓度为0.15～0.5mol/L。
6.根据权利要求1所述的精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒，其特征在于，所述冻干精浆质控品在冻干前加入保护剂蔗糖、甘氨酸和NaCl，以及防腐剂山梨酸钾，使蔗糖、甘氨酸、NaCl和山梨酸钾的浓度分别为0.01～0.02mol/L、0.05～0.1mol/L、0.01～0.03mol/L和0.01～0.03g/dl。
7.根据权利要求6所述的精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒，其特征在于，所述冻干精浆质控品的定值范围通过以下步骤获得：
取冻干前精浆等体积的纯化水复溶该冻干精浆质控品，混匀后，分装，-25～-20℃保存，备用；从-25～-20℃中每天取出1支分装后冻干精浆质控品，室温下自然解冻，混匀后用该试剂盒每天检测1次，连续1个月，计算这些数据的平均值、标准差、±2倍标准差，以平均值为该质控品的靶值，平均值±2倍标准差为该质控品的定值范围。
8.根据权利要求1所述的精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂、2瓶校准品、冻干精浆质控品、说明书和内衬。
9.如权利要求1所述的精浆超氧化物歧化酶检测试剂盒在全自动生化分析仪上的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用的检测步骤为：
(1)试剂和样本的准备：采集精液，液化，3000～10000r/min离心5～10min分离精浆，即刻用于检测，试剂盒从2～8℃取出后，于室温下平衡30～60min；
(2)设置全自动生化分析仪的主、副波长分别为330～340nm、660～700nm，R1/样本/R2加样量按体积比40:1:12，范围为(120～200μl)：(3～5μl)：(36～60μl)；
(3)检测方法：速率法，加入R1和样品后混匀，37℃孵育5min，加入R2后混匀37℃孵育2～5min，连续测定2～5min内的吸光度，仪器计算吸光度变化率△A/min；
(4)计算公式：
样本中SOD活性(U/mL)＝K×△A/min+B
式中，K和B分别为校准曲线的斜率和截距，通过全自动生化仪自动测定校准品得到；
△A/min通过全自动生化仪自动测定样本得到；
(5)取冻干前精浆等体积的纯化水复溶冻干精浆质控品，混匀后，分装，-25～-20℃保存，备用；从-25～-20℃中取出一支分装后的冻干精浆质控品，在室温下自然解冻、混匀，将此冻干精浆质控品随着样本一起检测，根据质控品结果是否在定值范围内以判断样本结果是否在控。
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