CN111748536A - 一种纯化酶、提取方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种纯化酶、提取方法及试剂盒，属于酶提取技术领域。该方法是将动物内脏器官去杂、冲洗，得到处理后的样品；在处理后的样品中加入缓冲液，先使用打碎机进行打碎，然后再使用匀浆机进行细打碎，将样品进行盐析，溶解、然后进行离心，再过滤，冻干，得到冻干样品；使用冲洗缓冲液步骤四的冻干样本进行溶解，过滤，利用凝胶层析柱进行分离，再运用中空纤维柱技术对其进行换液、浓缩，即得到纯化酶。本发明还提供包括上述纯化酶的试剂盒。本发明的试剂盒综合性能高，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于酶提取技术领域，具有涉及一种纯化酶、提取方法及试剂盒。
背景技术
天然产物，其提取来源主要为动物的器官或者组织为主。与化学方法人工合成的酶相比，天然产物具有安全性高、代谢稳定等优势，但是动物天然产物的提取获得则存在不同程度的缺陷。目前，对纯化酶的提取主要采用动物细胞破壁、凝胶层析分离及浓缩等提取方式，主要分为机械破壁、生物化学破壁、凝胶层析技术、中空纤维柱技术等技术手段。
机械破壁主要以匀浆打碎法为主，借助破碎机、打碎机以及匀浆机等外力达到破壁使其原酶逸出的目的，其优点是获得原酶的浓度活性不会被破坏，但是在前期预处理、洗涤打碎过程中损失较大、操作复杂、工作量大，提取过程步骤复杂，单次处理原料样本有限，不适合处理大量样本。
生物化学破壁法以溶酶法为主要方式，主要用于蛋白质的提取，酶法提取具有选择性高的优势但受到成本控制的影响，价格较高，限制了大规模的利用，更重要的事，溶酶法通用性较差，不同来源的原酶样本提取时所需要选择不同的酶对其进行处理，局限性较大不适合量产，也对进一步纯化造成困难。
凝胶层析法以凝胶分离法为主，凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100％。分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。但是分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格把握。因而分离操作一般较慢。而且对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。
中空纤维柱技术以超滤膜法为主，超滤技术分离效率高，对稀溶液中的微量成分的回收、低浓度溶液的浓缩均非常有效。超滤过程仅采用压力作为膜分离的动力，因此分离装置简单、流程短、操作简便、易于控制和维护。滤过程不发生相变化，无需加热，能耗低，无需添加化学试剂，无污染，是一种节能环保的分离技术。但是超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到10～50％的浓度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纯化酶、提取方法及试剂盒，该提取方法能获得浓度高、纯度高的纯化酶，且该提取方法操作简单、成本低。
本发明首先提供一种纯化酶的提取方法，该方法包括：
步骤一：将动物内脏器官去杂、冲洗，得到处理后的样品；
步骤二：在步骤一处理后的样品中加入缓冲液，调节PH至7.0-9.5，先使用打碎机进行打碎，然后再使用匀浆机进行细打碎，每次打碎10-30min，间隔1-5h，然后放置于常温静置24-72h；
步骤三：将步骤二获得的静置后的样品进行盐析，溶解8h-24h，常温放置12-24h，然后进行离心，所述的离心速率为3000-11000r/min，离心时间为5-25min，再过滤，冻干，得到冻干样品；
步骤四：使用冲洗缓冲液步骤四的冻干样本进行溶解，然后使用3000-11000r/min离心5-25min，过滤，利用凝胶层析柱进行分离，再运用中空纤维柱技术对其进行换液、浓缩，即得到纯化酶。
优选的是，所述的步骤二的缓冲液为50-200mM/L磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、TRIS盐缓冲液、磷酸缓冲液中的一种，pH在8-12之间。
优选的是，所述的步骤三中盐析所用的盐为氯化钠、硫酸铵、氯化钙、氯化镁中的一种或多种组成，浓度为0.1-150g/L。
优选的是，所述的步骤四的冲洗缓冲液为20-100mM/L磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸-柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种，pH在7-12之间。
优选的是，所述的步骤四用中空纤维柱技术对其进行换液、浓缩中，所用的缓冲液为20-100mM/L磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸-柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种，浓缩倍数为2-15倍。
本发明还提供上述提取方法得到的纯化酶。
一种试剂盒，该试剂盒包括R1和R2试剂，其中R1包括第一缓冲液、纯化酶、表面活性剂、试剂稳定剂；
R2包括第二缓冲液、激活剂。
优选的是，所述的第一缓冲液和第二缓冲液分别为Tris、磷酸盐、碳酸盐、硼酸缓冲液中的一种，浓度为1.0-300g/L。
优选的是，所述的激活剂为EDTA-2K、EDTA-2Na中的一种，浓度为0.1-200g/L。
优选的是，所述的表面活性剂为吐温系列、曲拉通系列中的一种，浓度为1-10mL/L。
本发明的有益效果
本发明提供一种纯化酶及其提取方法，本发明的提取方法利用凝胶层析和中空纤维柱得到的目标纯化酶，操作简便，得到的酶酶纯度高，在98-99.5％之间，且能有效控制酶的浓度值。
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括上述纯化酶，本发明的试剂盒综合性能高，尤其是灵敏性、批间差以及CV等主要性能均得到了提高，适用于检测人体血清或者尿液生化指标。
具体实施方式
本发明首先提供一种纯化酶的提取方法，该方法包括：
步骤一：将动物内脏器官去杂、冲洗，得到处理后的样品；所述的动物内脏没有特殊限制，优选为猪、鸡、牛中的内脏，所述的内脏没有特殊限制，优选为猪心、猪肾、猪胰腺、猪小肠、猪肺、猪脾、鸡脆骨、牛肾、牛心、牛小肠中的一种；所述的动物内脏器官在去杂之前，优选先用0-4℃的纯化水反复冲洗5-6次，然后除去脂肪、外膜、血管等杂质，再用0-4℃的纯化水反复冲洗5-6次，得到处理后的样品；
步骤二：将步骤一处理后的样品进行裁剪，优选裁剪为1cm3的样品，然后在样品中加入缓冲液，调节PH至7.0-9.5，先使用打碎机进行打碎，然后再使用匀浆机进行细打碎，每次打碎10-30min，间隔1-5h，然后放置于常温静置24-72h；所述的缓冲液和处理后的样品的质量比为5：1，所述的缓冲液优选为50-200mM/L磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、TRIS盐缓冲液、磷酸缓冲液中的一种，pH在8-12之间；
步骤三：将步骤二获得的静置后的样品进行盐析，所用的盐优选为氯化钠、硫酸铵、氯化钙、氯化镁中的一种或多种组成，浓度为0.1-150g/L，利用磁力搅拌器对其溶解8h-24h，常温放置12-24h，然后进行离心，所述的离心速率为3000-11000r/min，离心时间为5-25min，再经过过滤，冻干，所述的冻干时间优选为7-9h，更优选为8h，得到冻干样品；
步骤四：使用冲洗缓冲液步骤四的冻干样本进行溶解，然后使用3000-11000r/min离心5-25min，过滤，利用凝胶层析柱进行分离，再运用中空纤维柱技术对其进行换液、浓缩，即得到纯化酶。所述的冲洗缓冲液优选为20-100mM/L磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸-柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种，pH在7-12之间。
按照本发明，所述的步骤四用中空纤维柱技术对其进行换液、浓缩中，所用的缓冲液为20-100mM/L磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸-柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种，浓缩倍数为2-15倍。
按照本发明，在上述得到的酶中添加稳定剂进行保存，所述的稳定剂优选为DDT、AES、海藻糖、甘露醇、甘油、葡糖糖中的一种或两种。
本发明还提供上述提取方法得到的纯化酶。
一种试剂盒，该试剂盒包括R1和R2试剂，其中R1包括第一缓冲液、纯化酶、表面活性剂、试剂稳定剂；
R2包括第二缓冲液、激活剂。
按照本发明，所述的第一缓冲液和第二缓冲液优选分别为Tris、磷酸盐、碳酸盐、硼酸缓冲液中的一种，浓度为1.0-300g/L。
按照本发明，所述的激活剂优选为EDTA-2K、EDTA-2Na中的一种，浓度为0.1-200g/L。
按照本发明，所述的表面活性剂优选为吐温系列、曲拉通系列中的一种，浓度为1-10mL/L。
按照本发明，所述的试剂稳定剂优选为DDT、AES、海藻糖、甘露醇、甘油或葡糖糖，浓度优选为0.5-50g/L。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1丙氨酸氨基转移酶纯化酶的提取：
(1)预处理：将新鲜牛小肠用4℃的纯化水反复冲洗5次，然后除去脂肪、外膜、血管等杂质，处理后在使用用4℃的纯化水反复冲洗5次。
(2)处理样本：将去杂后的样品剪成规格为1cm3的样本，然后按照缓冲液：样本为5:1的质量比例加入pH为8.2、150mM/L碳酸盐缓冲液，调节PH至9.5.先使用打碎机进行打碎然后再使用匀浆机进行细打碎，每次打碎10min，间隔1h，然后放置于常温静置48h。
(3)粗提取：用浓度为43.5g/L的氯化镁对其进行盐析，利用磁力搅拌器对其进行溶解，溶解8h。常温放置24h。然后进行离心，使用11000r/min离心15min，过滤。
得到样本进行冻干，冻干8h。
(4)细提取：使用pH为7.6、85mM/L甘氨酸-柠檬酸缓冲液对样本进行溶解，然后使用4500r/min离心20min，过滤。利用凝胶层析柱进行分离，得到目标样本。在运用中空纤维柱技术使用pH为7.6、85mM/L甘氨酸-柠檬酸缓冲液对其进行换液、浓缩，即得到目标纯化酶。
(5)保存：在目标纯化酶中添加稳定剂DDT、AES。
实施例2天门冬氨酸氨基转移酶纯化酶的提取
(1)预处理：将新鲜鸡脆骨用2℃的纯化水反复冲洗5次，然后除去脂肪、外膜、血管等杂质，处理后在使用用2℃的纯化水反复冲洗5次。
(2)处理样本：将去杂后的样品剪成规格为1cm3的样本，然后按照缓冲液：样本为5:1的质量比例加入pH为10.7、135mM/L磷酸盐缓冲液,调节PH至8.3.先使用打碎机进行打碎然后再使用匀浆机进行细打碎，每次打碎10min，间隔1h，然后放置于常温静置48h。
(3)粗提取：用浓度为1.52g/L的氯化钙对其进行盐析，利用磁力搅拌器对其进行溶解，溶解16h，常温放置16h。然后进行离心，使用5350r/min离心9min，过滤，得到样本进行冻干，冻干约8h。
(4)细提取：使用pH为10.2、115mM/L柠檬酸缓冲液对样本进行溶解，然后使用11000r/min离心25min，过滤。利用凝胶层析柱进行分离，得到目标样本。在运用中空纤维柱技术使用pH为10.2、115mM/L柠檬酸缓冲液对其进行换液、浓缩，即得到目标纯化酶。
(5)保存：在目标纯化酶中添加稳定剂DDT。
实施例3碱性磷酸酶纯化酶的提取
(1)预处理：将新鲜猪脾用3℃的纯化水反复冲洗5次，然后除去脂肪、外膜、血管等杂质，处理后在使用用3℃的纯化水反复冲洗5次。
(2)处理样本：将去杂后的样品剪成规格为1cm3的样本，然后按照缓冲液：样本为5:1的质量比例加入pH为11.6、105mM/L碳酸缓冲液,调节PH至8.8.先使用打碎机进行打碎然后再使用匀浆机进行细打碎，每次打碎10min，间隔1h。然后放置于常温静置48h。
(3)粗提取：用浓度为145.0g/L的硫酸铵对其进行盐析。利用磁力搅拌器对其进行溶解，溶解12h。常温放置12h。然后进行离心，使用7500r/min离心13min，过滤，得到样本进行冻干，冻干约8h。
(4)细提取：使用pH为8.9、45mM/L硼酸缓冲液对样本进行溶解，然后使用6500r/min离心17min，过滤。利用凝胶层析柱进行分离，得到目标样本。在运用中空纤维柱技术使用pH为8.9、45mM/L硼酸缓冲液对其进行换液、浓缩，即得到目标纯化酶。
(5)保存：在目标纯化酶中添加稳定剂海藻糖、甘露醇。
实施例4
丙氨酸氨基转移酶试剂盒
试剂盒包括R1和R2试剂，其中R1包括第一缓冲液、实施例1制备的酶、表面活性剂、稳定剂，R2包括第二缓冲液、激活剂。
所述的第一缓冲液为Tris缓冲液，浓度为12.114g/L；第二缓冲液为Tris缓冲液，浓度为15.965g/L。
所述的酶为丙氨酸氨基转移纯化酶，浓度为0.09g/L。
所述的表面活性剂为曲拉通X-100，浓度为3mL/L。
所述的稳定剂为海藻糖，浓度为23.4g/L。
所述的激活剂为EDTA-Na，浓度为0.13g/L。
配制R1的具体操作为：量取975mL纯化水于烧杯中，分别加入12.114g Tris、0.09g丙氨酸氨基转移纯化酶，搅拌溶解；在加入3mL曲拉通X-100、23.4g海藻糖，搅拌混匀，即得到R1试剂。
配制R2的具体操作为：量取975mL纯化水于烧杯中，分别加入15.965g Tris搅拌溶解；在加入0.13g EDTA-Na搅拌混匀，即得到R2试剂。
试剂盒在生化仪上的应用
测试试剂盒：实施例4的试剂盒、对比例1的丙氨酸氨基转移酶试剂盒(由北京迈瑞生物有限公司生产)
测试仪器：日立7100生化分析仪
具体操作为，设置参数：测试方法：两点终点法；主波长：340nm；副波长：405nm；测光点：16-34；样本量：3uL；试剂量R1:R2＝240:40；校准方法：spline标准曲线的设定：分别将已知浓度的标准品，即0、200、300、400、600IU/mL放在校准盘里，设置校准品位置及浓度，得到以下数据：
表1(实施例4)
表2(对比例1)
取30例不同浓度的临床样本与对比例平行进行检测，得到以下数据如表3：
表3
表3的结果表明，本发明提取的丙氨酸氨基转移纯化酶制备的试剂盒与对比例1相关性较好，测值一致，相关性大于0.99。
校准通过后，测定同一血清样本，测10次，通过检测10次的浓度结果求得平均值、SD值、计算出CV值。结果见表4：
表4
从表4数据可以看出，实施例4对同一样本的测定结果，重复性和对比例1相比，略优于对比例1，说明本试剂测定样本具有很好的精确度。
实施例5
天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒
试剂盒包括R1和R2试剂，其中R1包括第一缓冲液、实施例2制备的酶、表面活性剂、稳定剂，R2包括第二缓冲液、激活剂。
所述的第一缓冲液为Tris缓冲液，浓度为21.2g/L；第二缓冲液为Tris缓冲液，浓度为78.4g/L。
所述的酶为天门冬氨酸氨基转移酶纯化酶，浓度为2.65g/L。
所述的表面活性剂为曲拉通X-200，浓度为6.5mL/L。
所述的稳定剂为甘露醇，浓度为12.5g/L。
所述的激活剂为EDTA-2K，浓度为11.2g/L。
配制R1的具体操作为：量取975mL纯化水于烧杯中，分别加入21.2g Tris、2.56g天门冬氨酸氨基转移酶纯化酶，搅拌溶解；在加入6.5mL曲拉通X-200、12.5g甘露醇，搅拌混匀，即得到R1试剂。
配制R2的具体操作为：量取975mL纯化水于烧杯中，分别加入78.2g Tris搅拌溶解；在加入11.2g EDTA-2K搅拌混匀，即得到R2试剂。
试剂盒在生化仪上的应用
测试试剂盒：实施例5的试剂盒、对比例2的天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒(由北京迈瑞生物有限公司生产)
测试仪器：日立7100生化分析仪
具体操作为，设置参数：测试方法：两点终点法；主波长：405nm；副波长：560nm；测光点：19-25；样本量：5.5uL；试剂量R1:R2＝210:70；校准方法：spline标准曲线的设定：分别将已知浓度的标准品，即0、150、300、600、900IU/mL放在校准盘里，设置校准品位置及浓度，得到以下数据：
表5(实施例5)
表6(对比例2)
取30例不同浓度的临床样本与对比例平行进行检测，得到以下数据如表7：
表7
表7的结果表明，本发明提取的天门冬氨酸氨基转移酶纯化酶制备的试剂盒与对比例2相关性较好，测值一致，相关性大于0.99。
校准通过后，测定同一血清样本，测10次，通过检测10次的浓度结果求得平均值、SD值、计算出CV值。结果见表8：
表8
从表8数据可以看出，实施例5对同一样本的测定结果，重复性和对比例2相比，略优于对比例2，说明本试剂测定样本具有很好的精确度。
实施例6
碱性磷酸酶试剂盒
试剂盒包括R1和R2试剂，其中R1包括第一缓冲液、实施例3制备的酶、表面活性剂、稳定剂，R2包括第二缓冲液、激活剂。
所述的第一缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为88.6g/L；第二缓冲液为Tris缓冲液，浓度为49.6g/L。
所述的酶为碱性磷酸酶纯化酶，浓度为15.625g/L。
所述的表面活性剂为曲拉通X-100，浓度为0.56mL/L。
所述的稳定剂为DTT，浓度为0.8652g/L。
所述的激活剂为EDTA-2Na，浓度为6.89g/L。
配制R1的具体操作为：量取975mL纯化水于烧杯中，分别加入88.6g磷酸盐、15.625g碱性磷酸酶纯化酶，搅拌溶解；在加入0.56mL曲拉通X-100、0.8652g DTT，搅拌混匀，即得到R1试剂。
配制R2的具体操作为：量取975mL纯化水于烧杯中，分别加入49.6g Tris搅拌溶解；在加入6.89g EDTA-2Na搅拌混匀，即得到R2试剂。
试剂盒在生化仪上的应用
测试试剂盒：实施例6的试剂盒、对比例3的碱性磷酸酶试剂盒(由北京迈瑞生物有限公司生产)
测试仪器：日立7100生化分析仪
具体操作为，设置参数：测试方法：两点终点法；主波长：340nm；副波长：750nm；测光点：16-25；样本量：4.5uL；试剂量R1:R2＝200:100；校准方法：spline
标准曲线的设定：分别将已知浓度的标准品，即0、100、300、500、700IU/mL放在校准盘里，设置校准品位置及浓度，得到以下数据：
表9(实施例6)
表10(对比例3)
取30例不同浓度的临床样本与对比例平行进行检测，得到以下数据如表11：
表11
表11的结果表明，本发明提取的丙氨酸氨基转移纯化酶制备的试剂盒与对比例3相关性较好，测值一致，相关性大于0.99。
校准通过后，测定同一血清样本，测10次，通过检测10次的浓度结果求得平均值、SD值、计算出CV值。结果见表12：
表12
从表2数据可以看出，实施例6对同一样本的测定结果，重复性和对比例3相比，略优于对比例3，说明本试剂测定样本具有很好的精确度。
Claims (10)
1.一种纯化酶的提取方法，其特征在于，该方法包括：
步骤一：将动物内脏器官去杂、冲洗，得到处理后的样品；
步骤二：在步骤一处理后的样品中加入缓冲液，调节PH至7.0-9.5，先使用打碎机进行打碎，然后再使用匀浆机进行细打碎，每次打碎10-30min，间隔1-5h，然后放置于常温静置24-72h；
步骤三：将步骤二获得的静置后的样品进行盐析，溶解8h-24h，常温放置12-24h，然后进行离心，所述的离心速率为3000-11000r/min，离心时间为5-25min，再过滤，冻干，得到冻干样品；
步骤四：使用冲洗缓冲液步骤四的冻干样本进行溶解，然后使用3000-11000r/min离心5-25min，过滤，利用凝胶层析柱进行分离，再运用中空纤维柱技术对其进行换液、浓缩，即得到纯化酶。
2.根据权利要求1所述的一种纯化酶的提取方法，其特征在于，所述的步骤二的缓冲液为50-200mM/L磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、TRIS盐缓冲液、磷酸缓冲液中的一种，pH在8-12之间。
3.根据权利要求1所述的一种纯化酶的提取方法，其特征在于，所述的步骤三中盐析所用的盐为氯化钠、硫酸铵、氯化钙、氯化镁中的一种或多种组成，浓度为0.1-150g/L。
4.根据权利要求1所述的一种纯化酶的提取方法，其特征在于，所述的步骤四的冲洗缓冲液为20-100mM/L磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸-柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种，pH在7-12之间。
5.根据权利要求1所述的一种纯化酶的提取方法，其特征在于，所述的步骤四用中空纤维柱技术对其进行换液、浓缩中，所用的缓冲液为20-100mM/L磷酸盐缓冲液、硼酸缓冲液、甘氨酸-柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种，浓缩倍数为2-15倍。
6.权利要求1-5任一项所述的方法得到的纯化酶。
7.包括权利要求6所述的纯化酶的一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括R1和R2试剂，其中R1包括第一缓冲液、纯化酶、表面活性剂、试剂稳定剂；
R2包括第二缓冲液、激活剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的第一缓冲液和第二缓冲液分别为Tris、磷酸盐、碳酸盐、硼酸缓冲液中的一种，浓度为1.0-300g/L。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的激活剂为EDTA-2K、EDTA-2Na中的一种，浓度为0.1-200g/L。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的表面活性剂为吐温系列、曲拉通系列中的一种，浓度为1-10mL/L。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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