CN113049324A - 一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，其步骤：向待检测样品液中依次加入吸水用盐和有机试剂后，混合均匀后静置取上层液，吸水用盐为硫酸镁、氯化钠、硫酸钠和氯化钙中的一种以上，有机试剂为乙腈、甲醇、甲酸乙腈混合液和甲酸甲醇混合液中的一种以上，甲酸乙腈混合液中甲酸的体积含量为0.1～1％，甲酸甲醇混合液中甲酸的体积含量为0.1～1％；向上层液中加入净化剂，振荡、离心后收集上清液，再对上清液进行过滤即完成前处理。本发明的前处理方法，降低了前处理所需的样品量、提取试剂及净化试剂的用量，成本低廉；可同时适用于现场初筛的试纸条检测和实验室仪器检测；操作简单，耗时短，极具应用前景。

Description

一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法
技术领域
本发明属于水产品中有害化学物质检测技术领域，涉及一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，特别涉及一种适用于检测多种类渔用麻醉剂或兽药的快速高效样品前处理方法。
背景技术
渔用麻醉剂，因其成本低、使用简单、见效快，可以减少运输难度、提高水产品成活率，目前已被广泛应用于鲜活水产品的保活运输中。目前国外允许使用的渔用麻醉剂为卡因类和丁香酚类，并建立了相关检测使用标准。
在我国，比之广泛检测的兽药，渔用麻醉剂则少人问津。但近来也引起了重视，据江苏省2018年水产品抽检报告显示丁香酚检出率达18.52％；2020年，有关丁香酚检测的团体标准《T/ZACA 023—2020》也正式公布。可以预见未来其他渔用麻醉剂也将逐渐纳入监管。
目前，国内外已建立起诸多动物源性产品兽药残留的检测方法，关于兽药的前处理技术较为成熟，多种乃至百种兽药同时前处理方法也见诸报道。如现行有效的《农业部1077号公告1-2008》水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的检测，采用高效液相色谱法，其样品前处理过程包括超声萃取、三次高速离心处理、旋转蒸发浓缩等步骤，整个样品处理耗时为2～2.5h。一些快速样品前处理方法如CN110988211A与CN108704626A专利，针对净化剂的种类进行改进，合成新型纳米材料以降低基质干扰，可用于检测多种食品中的化学危害物，针对色素等弱极性化合物的净化效果上有所提升，但其合成需要经材料混合溶解、干燥过夜、高温煅烧等步骤，复杂耗时。CN109001349专利公开了一种β-兴奋剂类的快速前处理方法，通过优化提取试剂、避免酶解步骤，提升了内标回收率；但提取过程需要超声萃取、固相萃取净化、氮吹浓缩等处理，耗时约1h且需要辅助设备，难以满足现场检测要求。而CN110487921A专利也存在类似问题，其开发了一种100种兽药的快速筛查方法，但需要大型离心机、氮吹仪、超声波清洗仪的辅助。CN106645507A专利则公开了一种果蔬中赤霉素的快速前处理方法，样品经有机试剂提取后直接通过固相萃取柱净化，避免了二次液液萃取，但前处理耗时仍需1h。CN105675742A和CN105334277A专利则借鉴QuEChERS技术，采用直接添加净化剂的方式代替固相萃取环节，降低了处理要求，但样品量大(>10g)，提取试剂量多(>10ml)。
此外，关于渔用麻醉剂的样品前处理方法和技术的研究则相对落后。团体标准《T/ZACA 023—2020》水产品中6种丁香酚类麻醉剂残留量的测定，采用气质联用的仪器检测方法，其样品处理需要3次高速离心处理、低温冷冻、氮吹复溶等步骤，整个过程耗时3～3.5h。当前仪器分析的渔用麻醉剂的配套前处理技术操作过程繁琐，且需要离心机或蒸发仪等设备辅助处理，耗时长难以满足现场快速检测需求。
因此，开发一种检测速度快、操作简单且成本低廉的适用于水产品麻醉剂的前处理方法极具现实意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有适用于水产品麻醉剂的前处理方法检测速度慢、操作繁琐且成本较高的缺陷，提供一种检测速度快、操作简单且成本低廉的适用于水产品麻醉剂的前处理方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，其步骤如下：
(1)样品提取：向待检测样品液中依次加入吸水用盐和有机试剂后，混合均匀后静置取上层液，所述吸水用盐为硫酸镁、氯化钠、硫酸钠和氯化钙中的一种以上，所述有机试剂为乙腈、甲醇、甲酸乙腈混合液和甲酸甲醇混合液中的一种以上，所述甲酸乙腈混合液中甲酸的体积含量为0.1～1％，所述甲酸甲醇混合液中甲酸的体积含量为0.1～1％；
(2)样品净化：向步骤(1)提取的上层液中加入净化剂，振荡(采用漩涡振荡器进行)、离心后收集上清液，再对上清液进行过滤即完成前处理得到净化样品液。
本发明提供了一种适用于多种类渔用麻醉剂或兽药残留的快速样品前处理方法，填补了当前渔用麻醉剂前处理技术的空白，其有机试剂使用量少，对离心设备要求较低，同时前处理全流程时长短，具有简便快速的特点，可以满足现场检测和实验室检测的需求，极具应用前景。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，所述待检测样品液是通过以下操作获取的：
将待检测水产品中可食用部分通过斩拌机等机械搅碎混匀后，取一定量的浆料并向其中加入一定量的缓冲溶液或者去离子水，振荡1min混匀后制得待检测样品液，所述浆料与缓冲溶液或者去离子水的质量体积比为1g：0.5～1ml。浆料的含量过高，会导致样品混合不够充分，难以真实反应检测结果；浆料含量过低，会导致需要添加更多的吸水用盐、检测灵敏度降低等问题。
如上所述的一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，所述缓冲溶液为pH为4～7的乙酸盐缓冲溶液或磷酸盐溶液。本发明的缓冲溶液并不仅限于此，此处仅给出一种可行的技术方案而已。
如上所述的一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，步骤(1)中，待检测样品液、吸水用盐与有机试剂的质量体积比为1g：0.1～2g：1～3ml；所述混合均匀是指在漩涡振荡的作用下1～5min。本发明相比于常规2～5g的采样量、10～20ml的提取试剂、2～10g的盐类用量，将采样量降至0.5～1g，提取试剂降至2～3ml，盐类降至0.1～0.5g，有效降低了检测成本、减少了化学试剂带来的污染处理成本。吸水用盐的添加除了去除水分，亦有助于发生盐析现象，使待提取物更多地被萃取入有机试剂中，其用量过低会导致水分去除效率差、盐析现象弱，影响最后的提取效果；过多的添加则会阻碍样品与提取试剂的充分接触，降低提取效率。有机试剂的主要作用在于提取待测物、沉淀蛋白与造成分层的作用，过少的添加量会导致分层不明显，难以回收；反之，过多的添加量会导致后续吹干时间的大幅增加，增加前处理时间和成本。漩涡振荡有助于样品和提取试剂充分接触，更好地萃取待测物，因此较短的振荡时间会导致提取效率明显下降，难以有效提取待测物；而过长的振荡时间会带来非目标待测物之外的共萃物含量上升，干扰检测以及降低前处理效率的问题。
如上所述的一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，所述净化剂为N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳、中性氧化铝和无水硫酸镁中的一种以上，本发明的净化剂并不仅限于此，此处仅给出部分可行的技术方案，本领域技术人员可根据实际需求进行选择。
如上所述的一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，步骤(2)中，上层液与净化剂的质量体积比为1ml：100～200mg。净化剂的添加主要在于去除非目标待测物之外的共萃物，使得提取液更为纯净，有助于提升最后的检测效果，因此较少的添加量可能会导致潜在的干扰上升，导致假阳性或假阴性结果的发生，过多的添加量增加了处理成本，合适的净化剂添加量在净化效果和成本上加以权衡。
如上所述的一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，步骤(2)中，所述振荡的时长为1～3min，振荡的频率为50～60Hz；
所述离心的时长为1～3min，离心的功率为20W，对离心设备的要求较低，可采用掌上离心机代替大型离心设备，同时一次离心即可，大大缩短了样品前处理时间；
所述过滤是指使用0.22um针式过滤器进行过滤。
如上所述的一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，将净化样品液作为仪器分析样品，使用仪器进行检测。
除此之外，本发明还可采用试纸条进行检测，具体操作如下
将净化样品液置于20～55℃的温水浴中使用洗耳球吹干有机试剂后加入磷酸盐缓冲液复溶，待试纸条检测。其采用洗耳球结合温水浴方式代替氮吹仪，同时减少有机试剂体积，节省了常规氮吹数小时的耗时。
有益效果：
(1)本发明的适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，填补了水产品渔用麻醉剂前处理技术的空白，对我国未来相关检测领域的发展有积极的意义；
(2)本发明的适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，降低了前处理所需的样品量、提取试剂及净化试剂的用量，能较好地降低成本，减少对环境地污染；
(3)本发明的适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，可以同时适用于现场初筛的试纸条检测和实验室仪器检测，应用范围广，同时适用于多种水产品基质的检测，广谱性强；
(4)本发明的适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，操作简单，耗时短，整个前处理步骤可在15min内完成，且回收率不亚于传统方法，可有效提升检测效率；
(5)本发明的适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，设备门槛低，成本低廉，极具应用前景。
附图说明
图1为实施例4测试后的三卡因试纸条的示意图；
图2为实施例5测试后的结晶紫试纸条的示意图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式做进一步阐述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
以下实施例中用到的样品如海鲈鱼、南美白对虾、黑鱼等均采购自市场，并向每克样品中分别添加10uL(浓度为100ug/ml、500ug/ml、1000ug/ml)的多种渔用麻醉剂或兽药(结晶紫)，渔用麻醉剂具体为三卡因、苯佐卡因、丁香酚、乙酸丁香酚酯、丙泊酚和2-苯氧乙醇，并混合均匀，即样品中分别含有1ug/g、5ug/g、10ug/g的渔用麻醉剂或兽药(结晶紫)。
以下实施例中用到的试纸条是自行制备的：
MS-222磁性免疫试纸条(即三卡因试纸条)包括底板和底板表面依次粘贴的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；硝酸纤维素膜包被有3-氨基苯甲酸-BSA完全抗原(检测线T线)及羊抗鼠IgG(质控线C线)；
结晶紫磁性免疫试纸条(即结晶紫试纸条)包括底板和底板表面依次粘贴的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；硝酸纤维素膜包被有四甲基代二氨基三苯甲烷-BSA完全抗原(检测线T线)及羊抗鼠IgG(质控线C线)。
实施例1
一种适用于水产品麻醉剂的前处理方法，其步骤如下：
(1)采样制备：将待检测的海鲈鱼(包括各组海鲈鱼样品)可食用部分通过手动斩拌机搅碎混匀，取1g浆料至15ml离心管中加入0.5ml去离子水后涡旋振荡，制成匀浆液；
(2)样品提取：在步骤(1)中的匀浆液中依次加入0.5g氯化钠、2ml乙腈，经过3min振荡混合均匀后，静置1～2min，吸取1ml上层液体；
(3)样品净化：取步骤(3)中上层液体至含有100mgMgSO4、50mgPSA、50mgC18粉末(其中MgSO4用于去除水分，造成盐析现象；PSA用于吸附油脂、有机酸等干扰；C18粉末为十八烷基碳链，主要用于可以吸附非极性和中等极性的杂质)的2ml离心管中，依次在60Hz的频率下漩涡振荡2min、掌上离心机在20W功率下离心3min后，取上清液经0.22um针式过滤器过滤为净化样品液；
(4)仪器检测：取步骤(3)中的净化样品液在高效液相色谱仪以280nm波长下检测。
对比例1
一种前处理方法，其与实施例1基本相同，不同在于，其步骤(2)并未添加氯化钠。
对比例2
一种前处理方法，其与实施例1基本相同，不同在于，将其步骤(2)添加的氯化钠替换为硫酸铵。
对比例3
一种前处理方法，其与实施例1基本相同，不同在于，将其步骤(2)添加的乙腈替换为丙酮。
实施例2
一种适用于水产品麻醉剂的前处理方法，其步骤与实施例1基本相同，不中在于，将步骤(1)中待检测的海鲈鱼换成待检测的南美白对虾。
实施例3
一种适用于水产品麻醉剂的前处理方法，其步骤与实施例1基本相同，不中在于，将步骤(1)中待检测的海鲈鱼换成待检测的黑鱼。
计算实施例1～3及对比例1～3的前处理所得的回收率，结果如下表所示，下表中浓度的单位为ug/ml；
Figure BDA0002936877660000081
Figure BDA0002936877660000091
从对比例1和对比例2的回收率可以看出，在吸水用盐不起作用的情况下，回收率普遍降低了10％以上，这是由于缺乏了吸水作用和盐析作用，导致提取液被稀释、萃取的效率下降，致使回收率较低。在对比例3中，采用了丙酮作为提取液，其效果差于以乙腈作为提取试剂，这可能是因为丙酮对于蛋白质的沉淀效果不及乙腈，与吸水用盐的盐析作用交互效果差，致使在回收率上低于乙腈。综上所述，以本发明所使用的特定的吸水盐类结合特定有机试剂有着良好的提取渔用麻醉剂或兽药的效果。
实施例4
一种适用于水产品麻醉剂的前处理方法，其步骤如下：
(1)采样制备：将待检测的海鲈鱼(包括各组添加有三卡因的海鲈鱼样品)可食用部分通过手动斩拌机搅碎混匀，取0.5g浆料至15ml离心管中加入0.5ml去离子水后涡旋振荡，制成匀浆液；
(2)样品提取：在步骤(1)中的匀浆液中依次加入0.5gMgSO4、2ml乙腈，经过3min漩涡振荡混合均匀后，静置2min，吸取1ml上层液体；
(3)样品净化：取步骤(3)中上层液体至含有60mgMgSO4、20mgPSA、20mgC18、6mgGCB(GCB为石墨化碳黑，用于去除色素类及其他杂质)的2ml离心管中，依次在50Hz下漩涡振荡2min、掌上离心机在20W功率下离心3min后，取上清液经0.22um针式过滤器过滤为净化样品液；
(4)试纸条检测：取步骤(3)中的净化样品液于2ml离心管中，置于50℃的温水浴中，使用洗耳球吹干有机试剂，再加入10mmol/LPBS溶液(磷酸盐缓冲液)复溶，待三卡因试纸条检测，其结果如图1所示。
三卡因试纸条基于竞争检测原理，T线越浅，说明三卡因浓度越高。由图1可知，随着三卡因含量的提升，T线的颜色逐渐变淡，至不可见，可见提取效果符合预期。
实施例5
一种适用于兽药的前处理方法，其步骤如下：
(1)采样制备：将待检测的南美白对虾(包括各组添加有结晶紫的南美白对虾样品)可食用部分通过手动斩拌机搅碎混匀，取0.5g浆料至15ml离心管中加入0.5ml去离子水后涡旋振荡，制成匀浆液；
(2)样品提取：在步骤(1)中的匀浆液中依次加入0.5gMgSO4、2ml乙腈，经过3min漩涡振荡混合均匀后，静置2min，吸取1ml上层液体；
(3)样品净化：取步骤(3)中上层液体至含有60mgMgSO4、20mgPSA、20mgC18、6mgGCB的2ml离心管中，依次在60Hz下漩涡振荡2min、掌上离心机在20W功率下离心3min后，取上清液经0.22um针式过滤器过滤为净化样品液；
(4)试纸条检测：取步骤(3)中的净化样品液于2ml离心管中，置于50℃的温水浴中，使用洗耳球吹干有机试剂，再加入10mmol/LPBS溶液(磷酸盐缓冲液)复溶，待结晶紫试纸条检测，其结果如图2所示。
结晶紫试纸条基于竞争检测原理，T线越浅，说明结晶紫浓度越高。由图2可知，随着三卡因含量的提升，T线的颜色逐渐变淡，至不可见，可见提取效果符合预期。
实施例6～9
一种适用于水产品麻醉剂的前处理方法，其步骤与实施例1基本相同，不同在于，吸水用盐和有机试剂，具体如下表所示；
Figure BDA0002936877660000111
经验证，本发明的适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，填补了水产品渔用麻醉剂前处理技术的空白，对我国未来相关检测领域的发展有积极的意义；降低了前处理所需的样品量、提取试剂及净化试剂的用量，能较好地降低成本，减少对环境地污染；可以同时适用于现场初筛的试纸条检测和实验室仪器检测，应用范围广，同时适用于多种水产品基质的检测，广谱性强；操作简单，耗时短，整个前处理步骤可在15min内完成，且回收率不亚于传统方法，可有效提升检测效率；设备门槛低，成本低廉，极具应用前景。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应该理解，这些仅是举例说明，在不违背本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。

Claims (8)

1.一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)样品提取：向待检测样品液中依次加入吸水用盐和有机试剂后，混合均匀后静置取上层液，所述吸水用盐为硫酸镁、氯化钠、硫酸钠和氯化钙中的一种以上，所述有机试剂为乙腈、甲醇、甲酸乙腈混合液和甲酸甲醇混合液中的一种以上，所述甲酸乙腈混合液中甲酸的体积含量为0.1～1％，所述甲酸甲醇混合液中甲酸的体积含量为0.1～1％；
(2)样品净化：向步骤(1)提取的上层液中加入净化剂，振荡、离心后收集上清液，再对上清液进行过滤即完成前处理得到净化样品液。
2.根据权利要求1所述的一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，其特征在于，所述待检测样品液是通过以下操作获取的：
将待检测水产品中可食用部分机械搅碎混匀后，取一定量的浆料并向其中加入一定量的缓冲溶液或者去离子水，振荡混匀后制得待检测样品液，所述浆料与缓冲溶液或者去离子水的质量体积比为1g：0.5～1ml。
3.根据权利要求2所述的一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，其特征在于，所述缓冲溶液为乙酸盐缓冲溶液或磷酸盐溶液。
4.根据权利要求1所述的一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，其特征在于，步骤(1)中，待检测样品、吸水用盐与有机试剂的质量体积比为1g：0.1～2g：1～3ml；
所述混合均匀是指在漩涡振荡的作用下1～5min。
5.根据权利要求1所述的一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，其特征在于，所述净化剂为N-丙基乙二胺、石墨化碳、中性氧化铝和无水硫酸镁中的一种以上。
6.根据权利要求5所述的一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，其特征在于，步骤(2)中，上层液与净化剂的质量体积比为1ml：100～200mg。
7.根据权利要求6所述的一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，其特征在于，步骤(2)中，所述振荡的时长为1～3min，振荡的频率为50～60Hz；
所述离心的时长为1～3min，离心的功率为20W；
所述过滤是指使用0.22um针式过滤器进行过滤。
8.根据权利要求1所述的一种适用于水产品麻醉剂或兽药的前处理方法，其特征在于，将净化样品液作为仪器分析样品，使用仪器进行检测。
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