CN115015402B - 食品中3种紫草素类天然色素含量的测定方法 - Google Patents

食品中3种紫草素类天然色素含量的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了食品中3种紫草素类天然色素含量的测定方法，紫草素类天然色素为紫草红、乙酰紫草素、去氧紫草素，所述方法为：待测食品样品用混合提取液提取两次，上清液用玻纤滤纸过滤后合并，蒸除甲醇后，剩余液体用2wt％氢氧化钠溶液定容，取定容后液体的十分之一体积作为处理液A，用中性氧化铝粉和C18粉末净化，取上清液C，调节pH值为3～4，再加入正己烷萃取有机相，氮气吹至近干，准确加入1mL甲醇，得到供试品溶液；将供试品溶液用高效液相色谱仪进行检测，采用外标法定量，得到待测食品样品中3种紫草素类天然色素的含量。本发明针对食品样品，首次提供其中紫草素类物质的提取、净化及含量检测方法，从而能够根据国家标准，对食品中的紫草素类添加剂的含量进行监管。

Description

食品中3种紫草素类天然色素含量的测定方法
技术领域
本发明涉及食品中3种紫草素类天然色素含量的测定方法。
背景技术
目前国内外食品产业色素添加剂主要分人工合成色素和天然色素两大类。早期，天然色素由于稳定性差，成本高，生产难度大等因素应用较少，而由于部分天然色素具有一定的药用作用，且相比于合成色素，公众认为其安全性也更高，其功能性价值逐渐被推广和认可，因此，天然色素产业发展较快，食品加工产业中的应用也逐渐广泛。
紫草素类色素是一类醌类结构的天然红色素，源于紫草科多年生草本植物紫草。紫草是一种中草药，始载于《神农本草经》，列为中品，药用上具有凉血、活血、清热解毒的功效。其功效成分紫草素类物质常见的主要包括紫草红、乙酰紫草素、去氧紫草素等，因其清热消毒、消炎抗菌、防病抗癌等药用价值，早期作为中药提取物使用，后因其着色作用及药用功能，作为天然色素及功能性添加剂用于食品工业，以便于食品着色及增加功能性附加值。这类物质中，世界上包括我国在内的几十个国家允许将紫草红用于食品着色剂，我国于2012年发布了紫草红色素产品标准，GB28315-2012《食品安全国家标准食品添加剂紫草红》。
在食品添加剂相关法规方面，我国GB2760-2014《食品添加剂使用卫生标准》中规定：紫草红可用冷冻饮品、糕点、焙烤食品馅料及表面用挂浆、果蔬汁(浆)类饮料、风味饮料(仅限果味饮料)、果酒，糕点中最大使用量为0.9g/kg，焙烤食品馅料及表面用挂浆中最大使用量为1.0g/kg，其余产品最大使用量均为0.1g/kg，其中固体饮料按稀释倍数增加使用量。但现有技术并未公开如何对食品中的紫草红添加剂含量进行检测。
现有的公开报道主要集中在中草药紫草中紫草素类物质的提取及含量检测，孙建文等采用RP-HPLC法同时测定新疆紫草中紫草素、乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素的含量；施玉峰等采用反相高效液相色谱法测定紫草中紫草素衍生物含量；周心慧等公开了一种测定紫草膏中紫草素含量的前处理方法及高效液相色谱方法。相比于中药材基质，食品中含有更多的蛋白质、脂肪、色素等杂质，会对紫草素类物质的检测造成干扰，必须净化去除，检测难度更大。对于食品中紫草素类物质的提取、净化及含量检测的相关方法，还未见公开报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种能够同时检测食品中3种紫草素类天然色素含量的方法。
本发明采用的技术方案是：
食品中3种紫草素类天然色素含量的测定方法，所述的紫草素类天然色素为紫草红、乙酰紫草素、去氧紫草素，所述方法包括以下步骤：
(1)样品前处理
取待测食品样品用混合提取液A提取，离心分离得到上清液A和残渣A，残渣A加入混合提取液B提取，离心分离得到上清液B；所述混合提取液A和混合提取液B均由2wt％氢氧化钠溶液与甲醇以体积比1:1混合制得；
将上清液A和上清液B用玻纤滤纸过滤后合并，蒸除甲醇后，剩余液体用2wt％氢氧化钠溶液定容，取定容后液体的十分之一体积作为处理液A，加入中性氧化铝粉和C18粉末，涡旋振荡后离心分离，取上清液C，调节pH值为3～4，再加入正己烷，混匀后离心，取上层有机相D，氮气吹至近干，准确加入1mL甲醇，混匀后滤膜过滤，得到供试品溶液；
(2)将供试品溶液用高效液相色谱仪进行检测，采用外标法定量，得到待测食品样品中3种紫草素类天然色素的含量。
进一步，所述步骤(1)中，混合提取液A的体积用量以待测食品样品的质量计为5～20mL/g，优选10mL/g。
混合提取液B的体积用量以待测食品样品的质量计为5～20mL/g，优选10mL/g。
所述步骤(1)中的提取步骤一般为涡旋振荡1～3min，超声10～15min，再涡旋振荡5～10min。
所述中性氧化铝粉的质量用量以处理液A的体积计为0.3～0.5g/mL。
所述中性氧化铝粉末粒度优选60-100目。
所述C18粉末的质量用量以处理液A的体积计为0.1～0.3g/mL。
所述C18粉末粒度优选40-60目。
所述正己烷的体积用量为处理液A的体积的2～3倍。
所述步骤(1)中的离心一般为5000～6000r/min。
上清液A和上清液B过滤一般采用玻纤滤纸过滤。
滤膜过滤一般采用0.22μm聚四氟乙烯(PTFE)滤膜过滤。
所述方法中，混合提取液A和混合提取液B用来分别指代不同提取步骤中的混合提取液，A和B起区分作用，不具有化学意义。
进一步，所述步骤(1)的样品前处理优选按以下步骤进行：
称取待测食品样品2.00g，加入20mL混合提取液A，涡旋振荡1min，超声10min，再涡旋振荡5min，离心分离得到上清液A和残渣A；残渣A加入20mL混合提取液B，涡旋振荡1min，超声10min，再涡旋振荡5min，离心分离得到上清液B；上清液A和上清液B经玻纤滤纸过滤，合并，旋转蒸发去除甲醇，将剩余液体用2wt％氢氧化钠溶液定容至50mL，取5mL作为处理液A，加入1.5g中性氧化铝粉和0.5gC18粉末，涡旋振荡5min，离心分离，取上清液C，用盐酸调节pH值至3-4，加入10mL正己烷，涡旋振荡5min，离心取上层有机相D，氮气吹至近干，准确加入1mL甲醇，涡旋振荡1min，0.22μm聚四氟乙烯滤膜过滤，得到供试品溶液。
所述步骤(2)中，高效液相色谱仪的检测条件为：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相A：2mmol/L甲酸铵+0.1vt％甲酸的甲醇-水溶液，其中甲醇、水体积比为95:5；流动相B：含有2mmol//L甲酸铵+0.1vt％甲酸的水溶液；采用流动相A、流动相B体积比为90:10，等度洗脱；DAD检测器波长范围：190-800nm；
进一步，高效液相色谱仪的流速为1.0mL/min；进样量：10μL；
所述步骤(2)中，外标法定量的操作步骤为：将供试品溶液用高效液相色谱仪进行检测，得到供试品溶液的液相色谱图，供试品溶液的各待测成分的的峰面积与与其对应的标准品的标准曲线比较，计算得到供试品溶液中各待测成分的浓度，相应换算得到待测食品样品中3种紫草素类天然色素的含量。标准品的标准曲线按以下方法得到：将紫草红、乙酰紫草素、去氧紫草素的标准品配制成不同浓度的标准工作液，按照步骤(2)用高效液相色谱仪在相同条件下进行检测，按照浓度和所测得的峰面积，绘制得到标准曲线。
待测食品样品中待测成分的含量根据如下计算公式得到：
Figure BDA0003556099260000041
式中：
X－试样中待测物含量，单位为mg/kg；
C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为mg/L
V—定容体积，单位为mL；
m－试样体积或质量，单位为g；
f－稀释倍数。
本发明的有益效果在于：
与现有技术相比，现有公开的关于紫草素类物质的含量检测方法，主要针对中药材紫草、功能性护肤品等基质，对于食品中紫草素类物质的提取、净化及含量检测的相关方法，还未见报道。
在检测技术方面，本方法结合紫草素类物质的化学结构特性，采用碱性溶液和甲醇按一定配比的混合提取液进行提取，一方面有效提取基质中的紫草素类物质目标物，另一方面可对基质中的蛋白质杂质进行变性沉淀，同时起到了一次净化效果；经玻纤滤纸过滤，可将提取液中细微颗粒及漂浮油层去除，并且不对目标物产生吸附性损失；旋转蒸发去除提取液中的甲醇后，取总量的十分之一，在保证方法定量限符合检测要求的前提下，有效降低了杂质含量；提取液中加入一定配比的中性氧化铝和C18粉末，可有效吸附提取液中残存的脂肪、合成色素等干扰杂质；将提取液pH值调成3-4，使目标物在溶液体系中溶解度降低，加入有机溶剂正己烷后，目标物快速溶解进入有机相，完成萃取和溶剂交换，便于后续浓缩；正己烷相溶剂交换成甲醇，与流动相溶剂相近，减少仪器检测时产生的溶剂效应。
本发明检测食品中的三种紫草素类物质，定量限在10mg/kg，回收率范围均在83.2％-102.1％之间，精密度范围在3.2％-6.2％，基本满足方法学验证要求。本发明针对食品样品，首次提供其中紫草素类物质的提取、净化及含量检测方法，从而能够根据国家标准，对食品中的紫草素类添加剂的含量进行监管。
附图说明
图1三种紫草素类目标物的液相色谱图。
图2紫草红的DAD检测器特征光谱图。
图3乙酰紫草素的DAD检测器特征光谱图。
图4去氧紫草素的DAD检测器特征光谱图。
具体实施方式
下面以具体实施例来对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
主要试剂和材料：
如非特别说明，所列试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水。
甲醇：HPLC级；氢氧化钠、盐酸、甲酸、甲酸铵：分析纯；中性氧化铝粉末：60-100目，C18粉末：40-60目；玻纤滤纸：孔径1-3μm。
2wt％氢氧化钠溶液：称取2.0g氢氧化钠，用超纯水定容至100mL。混合提取液：2wt％氢氧化钠溶液与甲醇以体积比1:1混合。0.1vt％甲酸：取1mL甲酸，用超纯水定容至1000mL。
流动相A：2mmol/L甲酸铵+0.1vt％甲酸的甲醇-水溶液：取0.126g甲酸铵，1mL甲酸，用甲醇+超纯水(体积比95:5)定容至1000mL；流动相B：含有2mmol/L甲酸铵+0.1vt％甲酸的水溶液：取0.126g甲酸铵，1mL甲酸，用超纯水定容止1000mL。
标准物质：紫草红、乙酰紫草素、去氧紫草素。
仪器设备
LC-20A高效液相色谱仪配有DAD检测器；C18色谱柱(250mmx4.6mm，5μm)；电子天平：感量分别为0.1mg和0.01g；超纯水器；旋涡混合仪；超声波清洗仪；旋转蒸发仪。
(1)配制标准工作液：
分别称取适量的紫草红、乙酰紫草素、去氧紫草素标准品，用甲醇配制成浓度为1000ng/mL的标准混合工作液；
分别吸取适量混合工作液，用甲醇稀释，配制成浓度为2ng/mL，4ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL的系列标准混合工作液。
(2)高效液相色谱仪测定
色谱柱：C18色谱柱，型号为250mmx4.6mm，5μm；
流动相A：2mmol/L甲酸铵+0.1vt％甲酸的甲醇-水溶液：流动相B：含有2mmol/L甲酸铵+0.1vt％甲酸的水溶液；采用流动相A：流动相B体积比为90:10，等度洗脱。
流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
DAD检测器波长范围：190-800nm；
(3)测定过程：
将不同浓度的系列标准混合工作液分别注入高效液相色谱仪，并按照系列标准混合工作液的浓度和所测得的峰面积，绘制标准曲线，分别得到3种标准品的标准工作曲线，所得结果如下表1所示。
表1标准品的方法参数
Figure BDA0003556099260000061
实施例2方法学验证
分别选取月饼、混合果蔬汁空白基质，吸取适量混合标准溶液，使样品中目标物浓度为定量限的1、2、10倍，按以下方法进行检测：
(1)样品前处理
称取样品2.00g于50mL离心管中，加入20mL混合提取液，涡旋振荡1min，超声10min，再涡旋振荡5min，以5000r/min离心5min，上清液经玻纤滤纸过滤，转移至鸡心瓶；残渣加入20mL混合提取液，涡旋振荡1min，超声10min，再涡旋振荡5min，以5000r/min离心5min，上清液经玻纤滤纸过滤合并至鸡心瓶；旋转蒸发去除甲醇，将剩余液体转移至刻度离心管，2wt％氢氧化钠溶液定容至50mL，取5mL，加入1.5g中性氧化铝粉和0.5gC18粉末，涡旋振荡5min，以5000r/min离心5min，取上清液至50mL离心管中，用盐酸将溶液调节PH至3-4，加入10mL正己烷，涡旋振荡5min，以5000r/min离心5min，取上层有机相溶液，氮吹至近干，准确加入1mL甲醇，涡旋振荡1min，0.22μm聚四氟乙烯(PTFE)滤膜过滤，得到供试品溶液供HPLC检测。
(2)供试品溶液按照实施例1步骤(2)相同条件进行高效液相色谱仪测定，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。
根据供试品溶液测得的各待测成分的峰面积以及实施例1测得的对应的标准品的标准曲线，计算出供试品溶液中各待测成分的浓度，再按照如下计算公式得到待测样品中各待测成分的含量。
Figure BDA0003556099260000071
式中：
X－试样中待测物含量，单位为mg/kg；
C－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为mg/L
V—定容体积，单位为mL；
m－试样体积或质量，单位为g；
f－稀释倍数
测定后计算样品添加的回收率及相对标准偏差，所得结果见表2。
表2加标回收结果
Figure BDA0003556099260000072
结果显示，所有上述化合物回收率范围均在83.2％-102.1％之间，精密度范围在3.2％-6.2％，除个别实验结果存在偏差，基本满足方法学验证要求。

Claims (9)

1.食品中3种紫草素类天然色素含量的测定方法，所述的紫草素类天然色素为紫草红、乙酰紫草素、去氧紫草素，其特征在于所述方法包括以下步骤：
（1）样品前处理
取待测食品样品用混合提取液A提取，离心分离得到上清液A和残渣A，残渣A加入混合提取液B提取，离心分离得到上清液B；所述混合提取液A和混合提取液B均由2 wt%氢氧化钠溶液与甲醇以体积比1:1混合制得；
将上清液A和上清液B用玻纤滤纸过滤后合并，蒸除甲醇后，剩余液体用2wt %氢氧化钠溶液定容，取定容后液体的十分之一体积作为处理液A，加入中性氧化铝粉和C18粉末，涡旋振荡后离心分离，取上清液C，调节pH值为3~4，再加入正己烷，混匀后离心，取上层有机相D，氮气吹至近干，准确加入1 mL甲醇，混匀后滤膜过滤，得到供试品溶液；
（2）将供试品溶液用高效液相色谱仪进行检测，采用外标法定量，得到待测食品样品中3种紫草素类天然色素的含量；
所述高效液相色谱仪的检测条件为：
色谱柱： C18色谱柱；
流动相A：2 mmol/L甲酸铵+0.1 vt%甲酸的甲醇-水溶液，其中甲醇、水体积比为95:5；流动相B：含有2 mmol//L甲酸铵+0.1vt%甲酸的水溶液；采用流动相A、流动相B体积比为90:10，等度洗脱；DAD检测器波长扫描范围：190-800 nm。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于高效液相色谱仪的流速为1.0 mL/min；进样量：10μL。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中，外标法定量的操作步骤为：将供试品溶液用高效液相色谱仪进行检测，得到供试品溶液的液相色谱图，供试品溶液的各待测成分的的峰面积与与其对应的标准品的标准曲线比较，计算得到供试品溶液中各待测成分的浓度，相应换算得到待测食品样品中3种紫草素类天然色素的含量；标准品的标准曲线按以下方法得到：将紫草红、乙酰紫草素、去氧紫草素的标准品配制成不同浓度的标准工作液，按照步骤（2）用高效液相色谱仪在相同条件下进行检测，按照浓度和所测得的峰面积，绘制得到标准曲线；
待测食品样品中待测成分的含量根据如下计算公式得到：
X=
Figure QLYQS_1
，式中：
X－ 试样中待测物含量，单位为mg/kg；
C－ 试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为mg/L
V— 定容体积，单位为mL；
m－试样体积或质量，单位为g；
f － 稀释倍数。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，混合提取液A的体积用量以待测食品样品的质量计为5~20 mL/g；混合提取液B的体积用量以待测食品样品的质量计为5~20 mL/g。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中的提取步骤为涡旋振荡1~3min，超声10~15 min，再涡旋振荡5~10 min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，中性氧化铝粉的质量用量以处理液A的体积计为0.3~0.5 g/mL，所述中性氧化铝粉末粒度为60-100目。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述C18粉末的质量用量以处理液A的体积计为0.1~0.3 g/mL，所述C18粉末粒度为40-60目。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述正己烷的体积用量为处理液A的体积的2~3倍。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）的样品前处理按以下步骤进行：
称取待测食品样品2.00 g，加入20 mL混合提取液A，涡旋振荡1 min，超声10 min，再涡旋振荡5 min，离心分离得到上清液A和残渣A；残渣A加入20 mL混合提取液B，涡旋振荡1min，超声10 min，再涡旋振荡5 min，离心分离得到上清液B；上清液A和上清液B经玻纤滤纸过滤，合并，旋转蒸发去除甲醇，将剩余液体用2 wt %氢氧化钠溶液定容至50 mL，取5 mL作为处理液A，加入1.5 g中性氧化铝粉和0.5 g C18粉末，涡旋振荡5 min，离心分离，取上清液C，用盐酸调节pH值至3-4，加入10 mL正己烷，涡旋振荡5 min，离心取上层有机相D，氮气吹至近干，准确加入1 mL甲醇，涡旋振荡1 min，0.22 μm聚四氟乙烯滤膜过滤，得到供试品溶液。
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