CN111912916A - 一种佛手制剂中指标成分含量的测定方法 - Google Patents

一种佛手制剂中指标成分含量的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种佛手制剂中指标成分含量的测定方法，包括以下步骤：步骤1、制备混合对照品溶液和供试品溶液；步骤2、高效液相色谱检测；步骤3、建立三种指标成分标准曲线；步骤4、测定香叶木苷、橙皮苷、5，7‑二甲氧基香豆素三种指标成分在供试品溶液中的含量。该方法同时检测了佛手制剂中香叶木苷、橙皮苷、5，7‑二甲氧基香豆素三种指标成分，准确高效，可用于对佛手制剂进行进一步的质量控制，该方法具有检测结果准确，精准度高，重复性好的优点，相比于现有测定方法更能体现佛手及相关制剂有效成分的含量情况。

Description

一种佛手制剂中指标成分含量的测定方法
技术领域
本发明属于中药质量控制技术领域，具体涉及了一种佛手制剂中指标成分含量的测定方法。
背景技术
佛手为芸香科柑橘属植物佛手的干燥果实。具有疏肝理气，和胃止痛，燥湿化痰的功效。用于肝胃气滞，胸胁胀痛，胃脘痞满，食少呕吐，咳嗽痰多。佛手可以制成多种中药材制剂，久服有保健益寿的作用。
但是市场上佛手制剂的质量标准仅部分制剂进行了橙皮苷的含量测定，而佛手中的橙皮苷相比于同属其它中药材如陈皮来说，含量极低，仅测试橙皮苷含量不能有效体现佛手药材的质量。只有进一步的测定佛手制剂中指标成分的含量，才能从根本上保证佛手的药效。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术存在的仅测试橙皮苷含量来评价和控制佛手制剂的品质，导致佛手制剂品质判断标准单一而无法从根本上保证制剂药效的技术问题，提供一种佛手制剂中指标成分含量的测定方法，该方法同时检测了佛手制剂中香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素三种指标成分，准确高效，可用于对佛手制剂进行进一步的质量控制，该方法具有检测结果准确，精度度高，重复性好的优点，相比于现有测定方法更能体现佛手及相关制剂有效成分的含量情况。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种佛手制剂中指标成分含量的测定方法，包括以下步骤：
步骤1、制备混合对照品溶液和供试品溶液
制备混合对照品溶液：
称取香叶木苷对照品，用二甲基亚砜溶解，定容，摇匀，制得香叶木苷对照品溶液；
分别称取橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素对照品，分别用甲醇溶解，定容，摇匀，分别制得橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素对照品溶液；
然后，分别量取香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素的对照品溶液，混合，加甲醇定容，得到混合对照品储备液；
最后，将混合对照品储备液按照倍比稀释法逐级稀释成一系列不同浓度的混合对照品溶液；
制备供试品溶液：
将质量为M的佛手制剂与体积为V的甲醇溶液混合，称量混合溶液，超声处理，然后用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，得到供试品溶液；
步骤2、高效液相色谱检测
色谱条件包括：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A相为0.05％磷酸水，流动相B相为乙腈；流速为0.8mL/min～1.2mL/min，柱温为25℃～35℃，进样体积为5～10μL，检测波长254nm；
在所述色谱条件下，将步骤1制备的供试品溶液及不同浓度的混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中，分别获得供试品溶液及不同浓度混合对照品溶液的高效液相色谱图；
步骤3、建立三种指标成分标准曲线
以步骤2得到的不同浓度混合对照品溶液的高效液相色谱图中三种指标成分的峰面积为纵坐标(Y)，以进样量为横坐标(X)，分别建立三种指标成分香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素的标准曲线，得到线性回归方程。
步骤4、测定三种指标成分在供试品溶液中的含量
根据步骤2得到的供试品溶液的高效液相色谱图中三种指标成分的峰面积、步骤3得到的线性回归方程，分别计算出供试品溶液中香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素的含量。
0.05％磷酸是指1000ml溶液中含有0.5ml磷酸。
进一步的，所述佛手制剂为佛手药材粉末或以佛手为主的单方制剂。
进一步的，所述以佛手为主的单方制剂为佛手固体制剂、佛手液体制剂或佛手外用制剂。
进一步的，所述佛手固体制剂为颗粒制剂、片制剂、散制剂或丸制剂；所述佛手液体制剂是口服液或糖浆剂；所述外用制剂为乳膏剂或软膏剂。
进一步的，所述步骤1中，制备供试品溶液过程中，超声处理的时间为20～40min。
进一步的，所述步骤1中，制备供试品溶液过程中，用微孔滤膜进行过滤处理。
进一步的，所述步骤1中，制备供试品溶液过程中，用0.22μm或0.45μm微孔滤膜进行过滤处理。优选地，用0.22μm微孔滤膜进行过滤处理。
进一步的，所述步骤2中，流速为1.0mL/min。
进一步的，所述步骤2中，进样体积为8μL～10μL。
进一步的，所述步骤2中，柱温为30℃，进样体积为10μL。
进一步的，所述步骤2中，还包括梯度洗脱：0～8min，20％B；8～10min，20％～30％B；10～15min，30％B～50％B；15～23min，50％B；23～25min，50％B～95％B。
进一步的，所述供试品溶液中香叶木苷含量的具体计算方法如下：
将步骤2得到的香叶木苷的峰面积代入步骤3得到的香叶木苷的线性回归方程，得到进样量X1(μg)；记所述步骤2中进样体积为X2(μL)，供试品溶液中香叶木苷浓度为C＝X1/X2；
记所述步骤2中所用的供试品溶液的体积为V1，供试品溶液中香叶木苷质量m＝C×V1；
记步骤1佛手制剂质量为M，则供试品液中香叶木苷的含量为m/M。
进一步的，所述供试品溶液中橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素含量分别由上述计算方法得到的。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明提供了一种佛手制剂中指标成分含量的测定方法，该方法同时检测了佛手制剂中香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素三种指标成分，准确高效，可用于对佛手制剂进行进一步的质量控制，该方法具有检测结果准确，精度度高，重复性好的优点，相比于现有测定方法更能体现佛手及相关制剂有效成分的含量情况。
附图说明
图1是实施例1中线性关系考察过程中混合对照品溶液A的HPLC图。
图2是实施例1中线性关系考察过程中混合对照品溶液B的HPLC图。
图3是实施例1中线性关系考察过程中混合对照品溶液C的HPLC图。
图4是实施例1中线性关系考察过程中混合对照品溶液D的HPLC图。
图5是实施例1中线性关系考察过程中混合对照品溶液E的HPLC图。
图6是实施例2中线性关系考察过程中混合对照品溶液A2的HPLC图。
图7是实施例2中线性关系考察过程中混合对照品溶液B2的HPLC图。
图8是实施例2中线性关系考察过程中混合对照品溶液C2的HPLC图。
图9是实施例2中线性关系考察过程中混合对照品溶液D2的HPLC图。
图10是实施例2中线性关系考察过程中混合对照品溶液E2的HPLC图。
图11是实施例2中线性关系考察过程中混合对照品溶液F2的HPLC图。
图12是实施例2中线性关系考察过程中混合对照品溶液G2的HPLC图。
图13是实施例3中线性关系考察过程中混合对照品溶液A3的HPLC图。
图14是实施例3中线性关系考察过程中混合对照品溶液B3的HPLC图。
图15是实施例3中线性关系考察过程中混合对照品溶液C3的HPLC图。
图16是实施例3中线性关系考察过程中混合对照品溶液D3的HPLC图。
图17是实施例3中线性关系考察过程中混合对照品溶液E3的HPLC图。
图18是实施例3中线性关系考察过程中混合对照品溶液F3的HPLC图。
图19是实施例3中线性关系考察过程中混合对照品溶液G3的HPLC图。
图20是对比例1中供试品溶液的HPLC图。
图21是对比例2中供试品溶液的HPLC图。
图22是实施例1中C1药材制备的供试品溶液的HPLC图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
注：以下实施例中的HPLC图中的1指香叶木苷的峰；2指橙皮苷的峰；3指5,7-二甲氧基香豆素的峰。
实施例1
佛手药材的含量测定
1仪器与试药
1.1仪器
Thermo Ultimate 3000型高效液相色谱仪，包括LPG-3400SDN型泵、WPS-3000SL型进样器、TCC-3000SD型柱温箱、DAD-3000型检测器以及Chromeleon 7色谱处理软件)[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；Discovery DV215CD十万分之一天平(Ohaus Corporation公司，美国)；BS124S型万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2试药
对照品香叶木苷(批号PCL-#-Di130)、橙皮苷(批号PCL-#-H633)、5，7-二甲氧基香豆素(批号PCL-#-Dn023)均购于英国Pure Chem Land公司，纯度均>98％。
甲醇(分析纯，成都市科隆化学品有限公司)，乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)，磷酸(色谱纯，成都市科龙化工试剂厂)，水为纯净水(怡宝)。
1.3样品
佛手样品信息见表1，共31批，其中川佛手17批，广佛手8批，金佛手6批。经成都中医药大学药学院龙飞副教授鉴定为佛手Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle的干燥果实。
表1佛手样品信息
Figure BDA0002583846310000051
Figure BDA0002583846310000061
2方法与结果
2.1溶液的制备
2.1.1混合对照品溶液的制备
分别精密称取对照品香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素、适量，其中香叶木苷加二甲基亚砜溶解，其余2个对照品加甲醇溶解，定容至10mL，制成各单一对照品储备液。从各单一对照品储备液中分别精密吸取适量，置同一10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即香叶木苷、橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素质量浓度分别为52.1、57.9、52.4μg/mL的混合对照品溶液。
2.1.2供试品溶液的制备
取佛手粉末(过2号筛)约1g，精密称定，置于50mL锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声(40kHz，150W)处理30min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.2色谱条件
色谱柱为Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为0.05％磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～8min，20％B；8～10min，20％～30％B；10～15min，30％B～50％B；15～23min，50％B；23～25min，50％B～95％B)，流速1mL·min-1，柱温30℃，进样体积10μL，检测波长254nm。
2.3方法学考察
2.3.1专属性考察
分别精密吸取空白溶液、混合对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按“2.2”项下的色谱条件进行检测，记录色谱图。结果显示，与混合对照品溶液和供试品溶液的色谱图相比，空白溶液没有干扰，表明该方法具有专属性。
2.3.2线性关系考察
以2.1.1项制备的混合对照品溶液作为混标A溶液，配制5个不同质量浓度的混合对照品溶液。分别取混标A溶液1mL，置10mL与50mL容量瓶中，用甲醇定容，得到混标B和混标C溶液。分别取混标2溶液1mL，置10mL与50mL容量瓶中，用甲醇定容，得到混标D与混标E溶液(香叶木苷、橙皮苷和5,7-二甲氧基香豆素3种成分浓度详细信息见表2)。按2.2项色谱条件，对各个溶液进行测定，进样体积分别为混标E溶液10μL，混标D溶液10μL，混标C溶液10μL、20μL，混标B溶液10μL、20μL，混标A溶液20μL，不同浓度混合对照品溶液A-E的HPLC图分别如图1-5所示。以对照品进样量(ng)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得到各被测成分的线性范围、回归方程和相关系数(r)，结果见表3。
表2不同浓度混合对照品溶液中3种成分浓度情况(μg/mL)
Figure BDA0002583846310000071
表3线性关系考察结果
Figure BDA0002583846310000072
2.3.3定量限与检测限
取“2.1.1”项混合对照品溶液进行稀释和测定，以信噪比(S/N)为3时各被测成分的相应浓度为检测限，以S/N为10时的相应浓度为定量限，测定结果见表4。
表4各被测成分的检测限与定量限
Figure BDA0002583846310000073
Figure BDA0002583846310000081
2.3.4精密度试验
取同一混合对照品溶液，按“2.2”项下的色谱条件进行测定，连续进样6次，每次进样10μl，记录色谱峰面积。计算香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素色谱峰峰面积的RSD值分别为2.01％，3.36％，0.10％，表明仪器的精密度良好。
2.3.5稳定性试验
取S9号川佛手样品粉末，制备1份供试溶液，分别于2、4、8、12、24、38h进样分析，记录各测定成分的色谱峰面积。计算香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素峰面积的RSD值分别为0.85％，1.22％，0.79％，表明供试溶液在38h内稳定。
2.3.6重复性试验
取S9号川佛手样品粉末，按2.1.2项方法平行制备6份供试溶液，按2.2项色谱条件进样分析，记录色谱峰并计算各测定成分的含量。结果香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素含量的RSD值分别为3.58％，2.72％，2.49％，表明该方法重复性良好。
2.3.7加样回收率试验
取已知含量的S13号川佛手样品共6份，每份约0.5g，精密称定，每份分别精密加入一定量的相应被测成分对照品，按“2.1.2”项下的方法分别制备并进样分析，记录峰面积。计算得香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素的平均回收率分别为98.82％，96.34％，98.06％，RSD分别为2.29％，1.99％，1.46％，结果见表5。
表5加样回收率试验测定结果
Figure BDA0002583846310000082
Figure BDA0002583846310000091
2.4样品含量测定
取31批佛手样品粉末，按2.1.2项方法制备佛手样品供试品溶液，并按2.2项色谱条件进样测定。根据表2各测定成分的回归方程计算样品中的含量，结果见表6，其中，将C1药材用2.1.2的供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液的HPLC图如图22所示。
表6 31批样品中3种成分含量测定结果(mg/g，n＝2)
Figure BDA0002583846310000092
Figure BDA0002583846310000101
对比例1
将C1药材用2.1.2的供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，改变实施例1的色谱条件中的梯度洗脱过程：A：0～12min，5％～15％B；12～23min，15％B；23～33min，15％～38％B；33～40min，38％B～65％B；40～50min，65％～100％B。
A：0.05％磷酸B：乙腈
得到液相色谱条件如图20所示，图20中1.香叶木苷2.橙皮苷3.5,7-二甲氧基香豆素，从图中可以看出，香叶木苷与橙皮苷的分离效果不好。
对比例2
将C1药材用2.1.2的供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，改变实施例1的色谱条件中的梯度洗脱过程：0～17min，5％～17％B；17～26min，17％B；26～43min，17％B～35％B；43～45min，35％～73％B；45～50min，73％B～100％B；50～60min，100％B。
得到液相色谱条件如图21所示，图21中1.香叶木苷2.橙皮苷3.5,7-二甲氧基香豆素，从图中可以看出，香叶木苷与橙皮苷基本能分开，但是5,7-二甲氧基香豆素的分离效果不好。
实施例2
川佛手颗粒剂的含量测试(醇提取)
1仪器与试药
BT25S型十万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，其余仪器与试药与实施例1相同。
1.3样品
制备川佛手颗粒剂(醇提取)
(1)将川佛手饮片破碎，粒径约为0.2cm；
(2)将破碎后的川佛手饮片加12倍量70％乙醇，提取3次，每次1.5h，在首次提取时，多加0.6倍量70％乙醇以补足吸醇量；提取液过滤合并，滤液减压浓缩成60℃时相对密度为1.18的清膏，备用；
(3)将步骤(2)所得清膏加入混合辅料糊精-蔗糖(8:1)，按清膏与混合辅料为1:3的比例制软材，使用16目筛网，湿法制粒；
(4)所得颗粒在60℃干燥，得川佛手颗粒剂。
川佛手颗粒样品信息见表7。
表7川佛手颗粒样品信息
Figure BDA0002583846310000111
2方法与结果
2.1溶液的制备
2.1.1对照品溶液的制备
精密称取对照品香叶木苷5.39mg、橙皮苷6.71mg、5，7-二甲氧基香豆素7.74mg，分别置于10ml容量瓶中，香叶木苷加二甲基亚砜溶解，橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，制成各单一对照品储备液。从各单一对照品储备液中分别精密吸取1ml，置同一10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得各对照品质量浓度分别为0.0539、0.0671、0.0774mg/mL的混合对照品溶液。
2.1.2供试品溶液的制备
取川佛手醇提物颗粒约1g，精密称定，置于50mL锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声(40kHz，150W)处理30min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.2色谱条件
色谱柱为Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为0.05％磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～8min，20％B；8～10min，20％～30％B；10～15min，30％B～50％B；15～23min，50％B；23～25min，50％B～95％B)，流速1mL·min-1，柱温30℃，进样体积10μL，检测波长254nm。
2.3方法学考察
2.3.1线性关系考察
精密吸取“2.1.1”项制备的混合对照品溶液适量，按照倍比稀释法逐级稀释制成不同浓度的混合对照品溶液(3种成分浓度详细信息见表8)，分别进样10μl，按“2.2”项下的色谱条件进行测定，不同浓度混合对照品溶液A2-G2的HPLC图分别如图6-12所示。以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，分别绘制标准曲线，得到各被测成分的线性范围、回归方程和相关系数(r)，结果见表9。
表8不同浓度混合对照品溶液中3种成分浓度情况(mg/mL)
Figure BDA0002583846310000121
表9线性关系考察结果
Figure BDA0002583846310000122
Figure BDA0002583846310000131
2.3.2定量限与检测限
取“2.1.1”项混合对照品溶液进行稀释和测定，以信噪比(S/N)为3时各被测成分的相应浓度为检测限，以S/N为10时的相应浓度为定量限，测定结果见表10。
表10各被测成分的检测限与定量限
Figure BDA0002583846310000132
2.3.3精密度试验
取“2.3.2”项下同一混合对照品溶液，按“2.2”项下的色谱条件进行测定，连续进样6次，每次进样10μl，记录色谱峰面积。计算得香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素色谱峰峰面积的RSD值分别为0.16％，0.49％，0.26％，表明仪器的精密度良好。
2..3.4稳定性试验
取佛手醇提物颗粒(编号：BE1)约1g，精密称定，按“2.1.2”项下的方法制备，分别在0，1.5，3，4.5，6，7.5，9，36h进样分析，每次进样10μl，记录色谱峰面积。计算得香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素峰面积的RSD值分别为3.29％，0.85％，0.49％，表明供试溶液在36h内稳定。
2.3.5重复性试验
取佛手醇提物颗粒(编号：BE1)共6份，每份约1g，精密称定，按“2.1.2”项下的方法制备，分别进样10μl，记录色谱峰面积。计算得香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素含量的RSD值分别为3.80％，1.02％，1.01％，说明该方法的重复性较好。
2.3.6加样回收率试验
取已知含量的佛手水提物颗粒(编号：BE1)约0.5g，共6份，精密称定，分别精密加入适量的相应被测成分对照品，按“2.1.2”项下的方法分别制备并进样分析，记录峰面积。计算得香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素的平均回收率分别为102.47％，103.30％，105.69％，RSD分别为2.20％，1.76％，1.30％，结果见表11。
表11加样回收率试验测定结果
Figure BDA0002583846310000133
Figure BDA0002583846310000141
2.4样品含量测定
取10批样品各约1g，精密称定，按“2.1.2”项下的方法制备，进样分析，记录峰面积。根据表8各测定成分的回归方程计算样品中的含量，结果见表12。
表12 10批样品中3种成分含量测定结果(mg/g)
Figure BDA0002583846310000142
Figure BDA0002583846310000151
实施例3
川佛手颗粒剂的含量测定(水提取)
1仪器与试药
BT25S型十万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，其余仪器与试药与实施例1相同。
1.3样品
制备川佛手颗粒剂(水提取)
(1)将川佛手饮片破碎，粒径约为0.2cm；
(2)将破碎后的川佛手饮片加12倍量水，提取3次，每次2h，在首次提取时，多加3.5倍量水以补足吸水量；提取液过滤合并，滤液减压浓缩成60℃时相对密度为1.15～1.18的清膏，备用；
(3)将步骤(2)所得清膏加入混合辅料糊精-蔗糖(8:1)，按清膏与混合辅料为1:3的比例制软材，使用16目筛网，湿法制粒；
(4)所得颗粒在60℃干燥，得川佛手颗粒剂。
川佛手颗粒样品信息见表13。
表13川佛手水提颗粒样品信息
Figure BDA0002583846310000152
2方法与结果
2.1溶液的制备
2.1.1对照品溶液的制备
精密称取对照品香叶木苷5.39mg、橙皮苷6.71mg、5，7-二甲氧基香豆素7.74mg，分别置于10ml容量瓶中，香叶木苷加二甲基亚砜溶解，橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，制成各单一对照品储备液。从各单一对照品储备液中分别精密吸取1ml，置同一10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得各对照品质量浓度分别为0.0539、0.0671、0.0774mg/mL的混合对照品溶液。
2.1.2供试品溶液的制备
取佛手水提物颗粒约1g，精密称定，置于50mL锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声(40kHz，150W)处理30min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.2色谱条件
色谱柱为Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为0.05％磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～8min，20％B；8～10min，20％～30％B；10～15min，30％B～50％B；15～23min，50％B；23～25min，50％B～95％B)，流速1mL·min-1，柱温30℃，进样体积10μL，检测波长254nm。
2.3方法学考察
2.3.1线性关系考察
精密吸取“2.1.1”项制备的混合对照品溶液适量，按照倍比稀释法逐级稀释制成不同浓度的混合对照品溶液(3种成分浓度详细信息见表14)，分别进样10μl，按“2.2”项下的色谱条件进行测定，不同浓度混合对照品溶液A3-G3的HPLC图分别如图13-19所示。以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，分别绘制标准曲线，得到各被测成分的线性范围、回归方程和相关系数(r)，结果见表15。
表14不同浓度混合对照品溶液中3种成分浓度情况(mg/mL)
Figure BDA0002583846310000161
表15线性关系考察结果
Figure BDA0002583846310000162
Figure BDA0002583846310000171
2.3.2定量限与检测限
取“2.1.1”项混合对照品溶液进行稀释和测定，以信噪比(S/N)为3时各被测成分的相应浓度为检测限，以S/N为10时的相应浓度为定量限，测定结果见表16。
表16各被测成分的检测限与定量限
Figure BDA0002583846310000172
2.3.3精密度试验
取“2.3.2”项下同一混合对照品溶液，按“2.2”项下的色谱条件进行测定，连续进样6次，每次进样10μl，记录色谱峰面积。计算得香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素色谱峰峰面积的RSD值分别为0.16％，0.49％，0.26％，表明仪器的精密度良好。
2..34稳定性试验
取佛手水提物颗粒(编号：BW1)约1g，精密称定，按“2.1.2”项下的方法制备，分别在0，3，6，9，12，24h进样分析，每次进样10μl，记录色谱峰面积。计算得香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素峰面积的RSD值分别为0.91％，0.95％，0.57％，表明供试溶液在24h内稳定。
2.3.5重复性试验
取佛手水提物颗粒(编号：BW1)共6份，每份约1g，精密称定，按“2.1.2”项下的方法制备，分别进样10μl，记录色谱峰面积。计算得香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素含量的RSD值分别为0.84％，0.82％，0.51％，说明该方法的重复性较好。
2.3.6加样回收率试验
取已知含量的佛手水提物颗粒(编号：BW1)约1g，共6份，精密称定，分别精密加入适量的相应被测成分对照品，按“2.1.2”项下的方法分别制备并进样分析，记录峰面积。计算得香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素的平均回收率分别为100.85％，104.23％，97.50％，RSD分别为3.44％，0.98％，0.97％，结果见表17。
表17加样回收率试验测定结果
Figure BDA0002583846310000173
Figure BDA0002583846310000181
2.4样品含量测定
取10批样品各约1g，精密称定，按“2.1.2”项下的方法制备，进样分析，记录峰面积。根据表14各测定成分的回归方程计算样品中的含量，结果见表18。
表18 10批样品中3种成分含量测定结果(mg/g)
Figure BDA0002583846310000182
Figure BDA0002583846310000191
本发明提供的佛手制剂中指标成分含量的测定方法，该方法同时检测了佛手制剂中香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素三种指标成分，准确高效，可用于对佛手制剂进行进一步的质量控制，该方法具有检测结果准确，精准度高，重复性好的优点，相比于现有测定方法更能体现佛手及相关制剂有效成分的含量情况。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种佛手制剂中指标成分含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、制备混合对照品溶液和供试品溶液
制备混合对照品溶液：
称取香叶木苷对照品，用二甲基亚砜溶解，定容，摇匀，制得香叶木苷对照品溶液；
分别称取橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素对照品，分别用甲醇溶解，定容，摇匀，分别制得橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素对照品溶液；
然后，分别量取香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素的对照品溶液，混合，加甲醇定容，得到混合对照品储备液；
最后，将混合对照品储备液按照倍比稀释法逐级稀释成一系列不同浓度的混合对照品溶液；
制备供试品溶液：
将质量为M的佛手制剂与体积为V的甲醇溶液混合，称量混合溶液，超声处理，然后用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，得到供试品溶液；
步骤2、高效液相色谱检测
色谱条件包括：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A相为0.05％磷酸水，流动相B相为乙腈；流速为0.8mL/min～1.2mL/min，柱温为25℃～35℃，进样体积为5～10μL，检测波长254nm；
在所述色谱条件下，将步骤1制备的供试品溶液及不同浓度的混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪中，分别获得供试品溶液及不同浓度混合对照品溶液的高效液相色谱图；
步骤3、建立三种指标成分标准曲线
以步骤2得到的不同浓度混合对照品溶液的高效液相色谱图中三种指标成分的峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标，分别建立三种指标成分香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素的标准曲线，得到线性回归方程；
步骤4、测定三种指标成分在供试品溶液中的含量
根据步骤2得到的供试品溶液的高效液相色谱图中三种指标成分的峰面积、步骤3得到的线性回归方程，分别计算出供试品溶液中香叶木苷、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素的含量。
2.根据权利要求1所述的佛手制剂中指标成分含量的测定方法，其特征在于，所述佛手制剂为佛手药材粉末或以佛手为主的单方制剂。
3.根据权利要求2所述的佛手制剂中指标成分含量的测定方法，其特征在于，所述以佛手为主的单方制剂为佛手固体制剂、佛手液体制剂或佛手外用制剂。
4.根据权利要求3所述的佛手制剂中指标成分含量的测定方法，其特征在于，所述佛手固体制剂为颗粒制剂、片制剂、散制剂或丸制剂；所述佛手液体制剂是口服液或糖浆剂；所述外用制剂为乳膏剂或软膏剂。
5.根据权利要求1所述的佛手制剂中指标成分含量的测定方法，其特征在于，所述步骤1中，制备供试品溶液过程中，用微孔滤膜进行过滤处理。
6.根据权利要求1所述的佛手制剂中指标成分含量的测定方法，其特征在于，所述步骤2中，流速为1.0mL/min。
7.根据权利要求1所述的佛手制剂中指标成分含量的测定方法，其特征在于，所述步骤2中，进样体积为8μL～10μL。
8.根据权利要求1所述的佛手制剂中指标成分含量的测定方法，其特征在于，所述步骤2中，柱温为30℃，进样体积为10μL。
9.根据权利要求1所述的佛手制剂中指标成分含量的测定方法，其特征在于，所述步骤2中，梯度洗脱程序如下：0～8min，20％B；8～10min，20％～30％B；10～15min，30％B～50％B；15～23min，50％B；23～25min，50％B～95％B。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的佛手制剂中指标成分含量的测定方法，其特征在于，所述供试品溶液中香叶木苷含量的具体计算方法如下：
将步骤2得到的香叶木苷的峰面积代入步骤3得到的香叶木苷的线性回归方程，得到进样量X1；记所述步骤2中进样体积为X2，供试品溶液中香叶木苷浓度为C＝X1/X2；
记所述步骤2中所用的供试品溶液的体积为V1，供试品溶液中香叶木苷质量m＝C×V1；
记步骤1佛手制剂质量为M，则供试品液中香叶木苷的含量为m/M；
所述供试品溶液中橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素含量分别由上述计算方法得到的。
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