CN115840003A - 一种同时测定乙肝扶正胶囊中3种化学成分含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙肝扶正胶囊中3种化学成分含量的测定方法，采用HPLC法，同时测定乙肝扶正胶囊中3种化学成分的含量；3种化学成分包括：丹酚酸B、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA；步骤如下：a、制备供试品溶液；b、制备对照品溶液；c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入搞笑液相色谱仪检测；d、根据检测结果计算乙肝扶正胶囊中3中化学成分的含量。本发明提供的方法具有灵敏度高、可靠性强，高效快速的特点，通过测定乙肝扶正胶囊中的3种化学成分的含量，可以更有效地对乙肝扶正胶囊中丹参药味投料质量进行考察，从而确保乙肝扶正胶囊的临床疗效。
Description
技术领域
本发明涉及中药质量检测领域，具体涉及一种乙肝扶正胶囊中3种化学成分含量的测定方法。
背景技术
乙肝扶正胶囊处方最早来源于吉林省标准，具有补肝肾，益气活血的功效，临床上用于乙型肝炎，辨证属于肝肾两虚证候。乙肝扶正胶囊主要有何首乌、虎杖、贯众、肉桂、明矾、石榴皮、当归、丹参、沙苑子、人参、麻黄共十一味药味构成。丹参为唇形科植物丹参的干燥根和根茎，为常用中药。其常用指标性成分主要为丹酚酸B和丹参酮类成分。在《中国药典》2015年一部中，丹参药材的【含量测定】项下包括丹酚酸B的HPLC含量测定方法及隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的一测多评含量测定方法，但是对于丹参饮片则未做含量测定要求，在企业生产中，一般以饮片作为原料投料，在药典中不对丹参饮片做含量测定要求则无法有效控制企业投入的丹参饮片的质量。本研究建立了HPLC法同时测定乙肝扶正胶囊中丹酚酸B、隐丹参酮和丹参酮IIA含量的方法，以考察原材料丹参的质量及投料情况。
发明内容
本发明的目的是提供一种对乙肝扶正胶囊中丹酚酸B、隐丹参酮和丹参酮IIA的含量进行同时测定的方法，以考察乙肝扶正胶囊中原材料丹参的质量及投料情况，从而实现对乙肝扶正胶囊中丹参药味的质量控制。
具体技术方案如下。
（1）制备丹酚酸B、隐丹参酮和丹参酮IIA的对照品溶液：精密称取丹酚酸B对照品、隐丹参酮对照品、丹参酮IIA对照品适量，分别加甲醇制成3种化合物的对照品储备液。
（2）制备乙肝扶正胶囊的供试品溶液：精密称取乙肝扶正胶囊样品粉末适量m，以一定体积V的80%甲醇为溶液，超声提取，摇匀，滤过，即得。
（3）分别将对照品混合溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中，按照拟定的色谱条件进行检测，得到液相色谱图。
（4）建立3种化合物的标准曲线，根据液相色谱图中得到的3种化合物的色谱峰面积，将其带入标准曲线中确定3种化合物的浓度，并计算乙肝扶正胶囊中3种化合物的含量；
根据本发明的方法，步骤（2）中所述的超声条件为：功率250W，频率42kHz；超声时间为：30分钟。
根据本发明的方法，步骤（2）中所述的滤过为采用0.45μm滤膜滤过。
根据本发明的方法，步骤（3）中所述拟定的色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，梯度洗脱；流速为1ml·min-1；检测波长为270nm；柱温30℃；进样量10μl。
根据本发明的方法，上述的用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，即为采用C18色谱柱；规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm；型号为：Agilent ZORBAX-SB C18。
根据本发明的方法，上述的梯度洗脱方法为：以乙腈为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，按以下梯度进行洗脱：0~10min，15-25%A；10~15min，25-30%A；15~25min，30-80%A；25~35min，80-82%A。
根据本发明的方法，步骤（4）中所述的建立3种化合物的标准曲线的方法为：分别精密吸取步骤（2）中所述的3种对照品储备液适量，用甲醇稀释成一系列分别含有不同已知浓度的3种化合物的对照品混合溶液，在步骤（3）中拟定的色谱条件下，各浓度的对照品混合溶液分别注入高效液相色谱仪中，获得各化合物在不同浓度下的液相色谱图及色谱峰面积；以各对照品的色谱峰峰面积Y为纵坐标，以各对照品的浓度X为横坐标，通过线性回归运算得到各化学成分的标准曲线Y=aX+b。
根据本发明的方法，步骤（4）中所述的计算含量的方法为：按下列公式分别计算出供试品中3种化学成分含量。
附图说明
图1为本发明的提供的三种化合物的对照品HPLC-UV色谱图。
图2为本发明的提供的乙肝扶正胶囊的供试品HPLC-UV色谱图。
图3为本发明的提供的制备的不含丹参药材的乙肝扶正阴性试样的HPLC-UV色谱图。
图1和图2中，各数字标号分别代表：1.丹酚酸B；2.隐丹参酮；3.丹参酮IIA。
图3中，明显可见地，乙肝扶正阴性试样的HPLC-UV色谱图中无图1所示的3种化合物色谱峰。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本法的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
首先，需要说明的是，本发明中所提及的术语“精密称定”：精密称定系指称定重量应准确至所取重量的千分之一。 “精密吸取”：系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该计量器具的精确度要求。
1 仪器与试剂
Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪，二极管阵列检测器（美国安捷伦公司）；BP211D型电子天平（美国赛多利斯公司），超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。色谱柱：Agilent ZORBAX-SB C18(4.6mm×250 mm，5μm)；
丹酚酸B（中国食品药品检定研究院；批号：111562-201716），隐丹参酮（中国食品药品检定研究院；批号：1110852-200806），丹参酮IIA（中国食品药品检定研究院；批号：110766-201721）；
乙腈为色谱纯，娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，按以下梯度进行洗脱：0~10min，15-25%A；10~15min，25-30%A；15~25min，30-80%A；25~35min，80-82%A；流速为1ml·min-1；检测波长为270nm；柱温30℃。进样量10μl。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取丹酚酸B对照品、隐丹参酮对照品、丹参酮IIA对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含782.5μg的丹酚酸B溶液、每1ml含216.5μg的隐丹参酮溶液和每1ml含336.7μg的丹参酮IIA溶液，作为对照品储备液。
2.3 供试品溶液的制备
取本品10粒，研细，取约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟（功率250W，频率42kHz），放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.4 阴性对照溶液的制备
按处方比例及工艺配制缺丹参的阴性样品，按2.3项下供试品溶液制备方法，制备阴性对照溶液。
2.5 系统适用性试验
分别取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液10μl注入液相色谱仪进行检测，在该色谱条件下，丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮IIA色谱峰与相邻组分峰的分离度均大于1.5，理论板数均大于6000。阴性样品在与对照品色谱峰相应的位置上无吸收峰，表明处方中的其他成分对测定结果无影响。
3 方法学考察
3.1 线性关系考察
精密量取丹酚酸B对照品储备液适量，加甲醇制成每1ml含丹酚酸B分别为7.825、15.651、78.254、156.507、234.761、313.014μg的溶液作为丹酚酸B对照品系列溶液。精密量取隐丹参酮和丹参酮IIA对照品储备液适量，加甲醇制成每1ml含隐丹参酮分别为0.087、0.433、0.866、4.331、8.662、12.993、17.324μg，每1ml含丹参酮ⅡA分别为0.067、0.337、0.673、3.367、6.734、10.101、13.468μg的溶液作为隐丹参酮和丹参酮ⅡA对照品的混合系列溶液。取对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，以浓度（μg/ml）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程，结果见表1；
表1 线性关系考察结果
3.2 精密度试验
取2.2项下的对照混合溶液按2.1项下的液相色谱条件连续测定6次，由峰面积计算精密度，丹酚酸B的RSD=1.55%(n=6)，隐丹参酮的RSD=0.25%(n=6)，丹参酮IIA的RSD=0.26%(n=6)，结果表明方法的精密度良好。
3.3 重复性试验
取阳性样品（健民集团叶开泰国药（随州）有限公司，批号：171102），按供试品溶液制备方法制备，重复测定6次，丹酚酸B的平均含量为154.96μg·g-1，RSD=0.51%(n=6)；隐丹参酮的平均含量为4.18μg·g-1，RSD=1.22%(n=6)；丹参酮IIA的平均含量为5.05μg·g-1，RSD=0.37%(n=6)，结果表明方法重复性良好。
3.4 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液10μl，分别于0、4、8、12、24h注入高效液相色谱仪，测定丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮IIA峰面积，三者峰面积的RSD分别为0.08%、0.37%、0.49%，总蒽醌中大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为0.07%、0.34%，表明游离蒽醌和总蒽醌的供试品溶液在8h内稳定性良好。
3.5 加样回收率试验
精密称取已知含量的供试品约0.125g共6份，分别精密加入丹酚酸B对照品储备液2.6ml、隐丹参酮对照品储备液0.23ml、丹参酮IIA对照品储备液0.18ml，按2.3项下供试品溶液的制备方法，按2.1项中的色谱条件，测定供试品中丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮IIA的含量，计算回收率，结果见表2；
表2 加样回收率结果
3.6 方法检出限和定量限的测定
取2.2项下对照品混合溶液适量，多级稀释后进样，以信噪比S/N=3时的溶液浓度，计算方法的检出限（LOD），以S/N=10时的溶液浓度，计算方法的定量限（LOQ），结果见表3；
表3 方法检出限和定量限结果
4 样品测定
分别取6批次乙肝扶正胶囊样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下所述色谱条件进行测定，得到各样品的液相色谱图和各样品中3种化学成分的色谱峰面积，计算出供试品中3种化学成分的含量。结果见表4；
表4 乙肝扶正胶囊中3种化合物的含量
Claims (7)
1.一种乙肝扶正胶囊中3种化学成分含量的测定方法，其特征在于：所述3种化学成分包括：丹酚酸B、丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅱ；步骤如下：
a、制备对照品溶液：
分别精密称取丹酚酸B对照品、隐丹参酮对照品、丹参酮IIA对照品适量，置适宜体积的容量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，制成具有已知浓度的各对照品储备溶液，分别精密吸取一定量的3种对照品储备溶液至适宜体积的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成分别具有已知浓度的3种化学成分的对照品混合液，用0.45μm滤膜过滤，即得；
b、制备供试品溶液：
取乙肝扶正胶囊适量，研细，取粉末，以甲醇为溶剂超声提取，用0.45μm滤膜过滤，即得；
c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相：乙腈为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，梯度洗脱；
洗脱程序：0~10min，15-25%流动相A；10~15min，25-30%流动相A；15~25min，30-80%流动相A；25~35min，80-82%流动相A；
流速：1.0ml/min；检测波长：270nm；柱温：30℃；
d、根据得到的色谱峰面积分别计算乙肝扶正胶囊中3种化学成分的含量。
2.如权利要求1所述同时检测乙肝扶正胶囊中的3种化学成分的含量，其特征在于：步骤b中，所述提取溶剂为100%甲醇。
3.如权利要求1所述同时检测乙肝扶正胶囊中的3种化学成分的含量，其特征在于：步骤c中，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为0.1%磷酸。
4.如权利要求1所述同时检测乙肝扶正胶囊中的3种化学成分的含量，其特征在于：步骤c中，所述洗脱程序为梯度洗脱，洗脱时间为35分钟，分为4个时间段，各时间段流动相A的体积变化为：0~10min，15-25%流动相A；10~15min，25-30%流动相A；15~25min，30-80%流动相A；25~35min，80-82%流动相A。
5.如权利要求1所述同时检测乙肝扶正胶囊中的3种化学成分的含量，其特征在于：步骤c中，所述流速为1.0ml/min。
6.如权利要求1所述同时检测乙肝扶正胶囊中的3种化学成分的含量，其特征在于：步骤c中，所述检测波长为270nm。
7.如权利要求1所述同时检测乙肝扶正胶囊中的3种化学成分的含量，其特征在于：步骤c中，所述柱温为30℃。
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