CN111855833B - 一种基于聚合物包覆硅胶键合填料测定复方丹参制剂中四环三萜类皂苷的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于聚合物包覆硅胶键合填料固相萃取‑液相色谱法测定复方丹参制剂中四环三萜类皂苷的分析方法，包括样品提取、固相萃取净化、高效液相色谱检测等步骤。本发明选择单分散硅胶为基质，用聚苯乙烯包覆硅胶，然后键合C18得到一款固相萃取填料，以此更好的保留皂苷类物质，避免了强极性和碱性物质的非特异吸附，同时利用硅胶骨架的优点，提高填料的分离性能，可解决复方丹参制剂目标皂苷分析数据不稳定的问题，对皂苷成分进行精准测定。

Description

一种基于聚合物包覆硅胶键合填料测定复方丹参制剂中四环 三萜类皂苷的分析方法

技术领域

本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种基于聚合物包覆硅胶键合填料测定复方丹参制剂中四环三萜类皂苷的分析方法。

背景技术

复方丹参制剂是我国临床上应用较为广泛的国家基本药物，针对冠心病、心绞痛、门脉高血压症、缺血性脑血管疾病、消化性溃疡、冠状动脉硬化等病症具有良好的治疗效果。该药品由丹参、三七和冰片三味药组成，自1981年面世后，目前可查到的就有693家企业拥有生产批文，市场容量巨大。1985年为中国药典首次收载，历版药典通过对该品种的多次修订，质量和检测标准得以不断提高。然而近些年各省药监局抽检公布的信息显示，市场上流通的复方丹参制剂存在着质量参差不齐的情况，不同厂家、甚至同一厂家不同批次生产的复方丹参制剂有效成分含量存在较大差异，丹参和三七项下的含量测定常常不符合要求(《江苏省2018年第2期药品质量公告》、《江苏省2019年第 1期药品质量公告》)。出现这种情况的原因，有的是不按标准投料或投劣料，有的是由于原材料丹参、三七的产地来源不同。要想把控质量统一，首先就需要现有的检测方法可以真实反映有效活性成分的定性和定量要求。中国药典2015版中规定了复方丹参制剂三七项下4种四环三萜类皂苷的薄层鉴别和含量测定方法(中华人民共和国药典.一部.中国医药科技出版社； 2015∶1214)，但在实际操作过程中，含量测定三七项样品如果没有经过前处理，因基线不平稳和复方制剂中丹参水溶性和脂溶性物质给三七相关成分测定带来较大干扰，分离度不够而无法准确进行积分操作，引起测定数据的不准确。

查阅文献报道会发现，中药材和复方制剂中人参皂苷的含量测定一直是个难点，这主要是由于皂苷类成分极性跨度较大、含量较低、紫外响应较低(普遍用紫外203nm或者ELSD检测器)，这就造成杂质干扰峰众多而引起定量不准确，4种三萜皂苷的结构式见图1。目前主要的前处理方法是通过石油醚脱脂后，水饱和正丁醇回流提取除去杂质，也有通过大孔吸附树脂或者硅胶键合C18来进行皂苷的富集。针对人参或三七中皂苷的分析，有报道如张冠英等利用大孔吸附树脂柱前处理测定人参中人参皂苷 Rg1、Re和Rb1的含量(中国卫生工程学，2014，13(01)：49)；如赵娜娜等利用硅胶键合C18固相萃取柱前处理，结合 ESI-MS/MS分析鉴定血塞通中三七总皂苷类成分(吉林中医药， 2018，38(03)：328)；如宋春颖等利用亲水相互作用填料的固相萃取柱，测定了人参中5种原人参二醇型人参皂苷的含量(色谱， 2020，38(05)：547)。相比药材中的干扰杂质较少，制剂中的分析干扰较大，皂苷分析难度随之增大，如Zhang Haijiang等选择硅胶键合C18作为前处理，用HPLC/MS对复方丹参滴丸中皂苷类成分进行了鉴定(J Pharm Biomed Anal.2006，40(2)：429)；如郭建博等利用中性氧化铝和D101大孔吸附树脂混合填料的固相萃取柱，测定了保健食品中人参皂苷类成分(食品安全质量检测学报，2019，10(1)：117)；如高钧等采用C18固相萃取柱针对三参舒心片中人参皂苷前处理后测定(药物分析杂志， 2006(09)：1292)，但由于基质复杂，主成分人参皂苷含量较低，在液相分析中，不易准确定量。

复方丹参制剂中分析干扰的存在，严重影响了四环三萜皂苷含量的准确测定。在众多已发表的复方丹参片的分析测定类文章中，色谱图都是杂质较多，而由于谱图中杂质过多，影响到积分结果，从而使得测定结果难以精确定量，测试结果稳定性也很差。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供一种基于聚合物包覆硅胶键合填料固相萃取-液相色谱法测定复方丹参制剂中四环三萜类皂苷的分析方法，本发明方法可解决复方丹参制剂目标皂苷分析数据不稳定的问题，对皂苷成分进行精准测定。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是，一种基于聚合物包覆硅胶键合填料测定复方丹参制剂中四环三萜类皂苷的分析方法，所述分析方法步骤如下：

(1)样品的提取：将复方丹参片除去包衣，精密称取，加入70％甲醇，超声提取，冷却后过滤；

(2)固相萃取净化：

装填：将聚合物包覆硅胶键合填料和聚丙烯管装填成固相萃取柱；

活化：依次使用甲醇和水活化所述固相萃取柱；

上样：移取步骤(1)所得续滤液适量蒸干，蒸干后残渣加水溶解后上固相萃取柱，弃去流出液；

淋洗：依次使用水、40％甲醇溶液淋洗，弃去淋洗液；

洗脱：用甲醇洗脱后用甲醇定容，经微孔滤膜滤过，取续滤液进行液相色谱检测；

(3)液相色谱检测：色谱柱：ChromCore C18；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水，进行梯度洗脱，根据色谱检测结果精确计算含量。

其中，步骤(3)中流动相洗脱采用梯度洗脱，梯度梯度洗脱条件：0～35min，19％A；35～55min，19％A～29％A；55～70min， 29％A；70～100min，29％～40％A。

其中，所述聚合物包覆硅胶键合填料是以聚合物包裹硅胶为基质，然后在上面键合烷烃。

其中，所述聚合物包括聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮。

其中，所述聚合物包覆硅胶键合填料是聚苯乙烯包覆单分散硅胶键合C18。

所述聚合物包覆硅胶键合填料是以单分散硅胶为基质，聚合单体基团聚合于硅胶微球表面，形成聚合物包覆层，然后该聚合物包覆硅胶再与烷烃键合，成为聚合物包覆硅胶键合填料。聚合单体基团可以是乙烯基、丙烯基、烯丙基中的任意1中或至少2 种的组合，也可以是苯乙烯、二乙烯基苯、烯丙基苯、二烯丙基苯中的任意1种或至少2种的组合。本发明实施例中采用聚苯乙烯包覆硅胶键合C18烷烃(HR-C18)。

具体的，所述分析方法步骤如下：

(1)样品的提取：将复方丹参片除去包衣，精密称取，加入70％甲醇，超声提取，冷却后过滤；

(2)固相萃取净化：

装填：选择聚合物包裹的单分散硅胶键合的C18填料500mg 和6mL的聚丙烯管装填成固相萃取柱；

活化：依次使用5mL甲醇和5mL水活化小柱；

上样：精密移取续滤液10mL蒸干，蒸干后残渣加10mL水溶解后上小柱，弃去流出液；

淋洗：依次使用10mL水、10mL 40％甲醇溶液淋洗，弃去淋洗液；

洗脱：用6mL甲醇洗脱后用甲醇定容至10mL，摇匀，经 0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液进行液相色谱检测；

(3)高效液相色谱检测：色谱柱：ChromCore C18(4.6 mm×250mm，5μm)；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水，梯度洗脱条件：0～35min，19％A；35～55min，19％A～29％A；55～70min， 29％A；70～100min，29％～40％A；

流速：1.3mL/min；

洗脱结束后，记录色谱图，计算得到含量。

相比现有技术，本发明方法可以准确地测定复方丹参制剂中四环三萜皂苷的含量，干扰成分少、色谱峰型好、样品较干净，对色谱柱寿命有提高，适合于复方丹参制剂中四环三萜类皂苷的分析。

本发明选择聚苯乙烯包覆单分散硅胶为基质键合C18得到的填料为固相萃取填料，把复方丹参片中的四环三萜类皂苷进行选择性保留并洗脱，其他成分没有保留；更好地保留皂苷类物质，避免了强极性和碱性物质的非特异吸附，同时利用硅胶骨架的优点，提高填料的分离性能，可解决复方丹参制剂目标皂苷分析数据不稳定的问题，对皂苷成分进行精准测定。

附图说明

图1是4种三萜皂苷的结构式。

图2是复方丹参片经聚苯乙烯包覆硅胶键合C18固相萃取净化前后的对比色谱图。

图3是不同类型填料固相萃取处理的色谱对比图。

图4是不同厂家复方丹参片以药典方法处理和固相萃取处理后的色谱图对比。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例，对本发明的技术方案进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

实施例1以聚苯乙烯包覆硅胶键合C18固相萃取-液相色谱法测定复方丹参制剂中四环三萜类皂苷

1、对照品及供试品未净化溶液的制备

1.1对照品溶液的制备

取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re及人参皂苷 Rb1对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1mL含人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1各0.2mg，三七皂苷R1及人参皂苷Re各0.05mg的混合溶液，即得。

1.2供试品未净化溶液的制备

取复方丹参片10片，除去包衣，精密称取1g研细的药品，加入70％甲醇50mL，超声提取30分钟，放冷后再称定重量，用70％甲醇水补足减失的重量，摇匀后取上清液经0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品未净化溶液。

2、固相萃取及供试品的制备

2.1供试品过固相萃取柱溶液的制备

取复方丹参片10片，除去包衣，研细，精密称取1.0g，置具塞三角瓶中，加入70％甲醇水50mL，超声提取30min，放冷后再称定重量，用70％甲醇水补足减失的重量，摇匀后滤过，精密移取续滤液10mL蒸干，蒸干后残渣加10mL水溶解后上聚苯乙烯包覆硅胶键合C18固相萃取柱(代号HR-C18，500mg/6mL，使用前分别用甲醇5mL和水5mL活化)，弃去流出液，依次使用10mL水和10mL 40％甲醇水溶液淋洗，弃去淋洗液，用6mL甲醇洗脱后用甲醇定容至10mL，摇匀，经 0.45μm有机微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品过固相萃取柱溶液。

2.2阴性供试品溶液的制备

参照中国药典复方丹参片的制剂工艺，选择丹参和冰片和适量辅料，制成缺三七的阴性样品，按照2.1所述方法制备阴性供试品溶液。

3、高效液相色谱检测

色谱柱：ChromCore C18(4.6mm×250mm，5μm)

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水，梯度洗脱条件：0～35min，19％A；35～55min，19％A～29％A；55～70min， 29％A；70～100min，29％～40％A；

流速：1.3mL/min

柱温：30℃

进样量：10μL

检测波长：203nm。

将前述制备的对照品、供试品未净化溶液、供试品过固相萃取溶液、阴性供试品溶液进行高效液相色谱检测，检测结果见图 2所示。图2是复方丹参片经聚苯乙烯包覆硅胶键合C18固相萃取净化前后的对比色谱图。图2中，曲线a是供试品未净化溶液，曲线b是供试品过固相萃取柱溶液，曲线c是对照品混标溶液，曲线d是缺三七阴性供试品溶液。图2中，波峰1是三七皂苷 R1，2是人参皂苷Rg1，3是人参皂苷Re，4是人参皂苷Rb1。

图2结果表明，聚苯乙烯包覆硅胶键合C18固相萃取净化后， 4个三萜皂苷的分离度都较为良好，去除了绝大多数的干扰杂质，谱图非常干净，这使得积分更加准确，药物分析更加精确。

实施例2不同填料固相萃取处理对比

为测试不同类型填料固相萃取净化的效果，选择常规硅胶键合C18填料、聚苯乙烯PSL填料、聚乙烯吡咯烷酮HLB填料，和本发明中的聚苯乙烯包覆硅胶键合C18填料(HR-C18)，以与实施例1相同的步骤进行实验测试。

图3是上述不同类型填料固相萃取处理后的色谱图对比，曲线a.聚苯乙烯PSL，曲线b.聚乙烯吡咯烷酮HLB，c.聚苯乙烯包覆硅胶键合C18(HR-C18)，d.硅胶键合C18(C18)，e.对照品溶液。图3中，波峰1是三七皂苷R1，2是人参皂苷Rg1， 3是人参皂苷Re，4是人参皂苷Rb1。

从图3结果可见，普通常规的硅胶键合C18填料对于复方丹参片中后半段的中等极性成分保留较好，但该类填料中的亲水性成分在前面洗涤项下洗出较多，不仅把干扰杂质洗掉，也把目标三个皂苷也洗出较多；聚苯乙烯PSL填料对于复方丹参片保留了更多的成分，但是由于该类填料亲脂性较强亲水性相对较弱，因此对于亲水性较大的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re保留较弱，回收率较低；聚乙烯吡咯烷酮HLB填料由于带有苯环的亲脂基团和带有吡咯烷酮的亲水基团，对于亲水和亲脂的四个成分的保留都较好，回收率也得到大幅提高，但是对于人参皂苷Re周围的干扰杂质还是没有除干净，引起人参皂苷 Re含量计算的不准确，这些都造成不同批次不同厂家复方丹参片可能的分析误差。HR-C18是聚苯乙烯包覆的硅胶键合C18 填料，不仅具有硅胶填料的高分辨性，也有聚合物填料的高保留性，在保留4个皂苷成分的同时，将大多数的干扰杂质去除，很好的解决了分析干扰的问题。

表1是4种皂苷在不同固相萃取柱的回收率。可见聚苯乙烯包覆硅胶键合C18填料对于4种皂苷都有很高有回收率。

表1

实施例3方法的重复性试验和稳定性试验

精密称取20181202批次的复方丹参片粉末1.0g，按实施例 1中2.1相同方法制备6份供试品溶液进行测定，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的RSD分别为 0.7％，0.4％，0.9％，0.3％。重新制取一份供试品溶液，分别在0， 1，2，4，8，12h进行测定，4个成分的RSD分别为0.5％、 0.2％、0.8％、0.4％，表明12h之内4个成分在供试品溶液中基本稳定。

实施例4回收率试验

精密称取20181202批次复方丹参片0.5g六份，分别加入三七皂苷R1对照品1.66mg、人参皂苷Rg1对照品7.85mg、人参皂苷Re对照品1.05mg和人参皂苷Rb1对照品7.37mg，按2.1项下方法制备溶液后测定，计算回收率。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的平均回收率为 95.8％、96.3％、98.2％和94.4％，RSD分别为1.4％、0.8％、1.2％和0.9％。

实施例5不同厂商复方丹参产品测试

分别取四个生产商生产的三个批次的复方丹参片，分别按照中国药典方法和2.1项下方法处理，外标法分别计算4个皂苷成分的含量，测定结果见表2，图谱见图4。

图4是不同厂家复方丹参片药典方法处理和固相萃取处理后的色谱图对比。其中，a.亳州某药厂未净化，b.亳州某药厂 SPE净化，c.广州某药厂未净化，d.广州某药厂SPE净化， e.吉林某药厂未净化，f.吉林某药厂SPE净化，g.云南某药厂未净化，h.云南某药厂SPE净化，i.对照品混标。(此处的SPE净化均为以本发明方法中的聚苯乙烯包覆硅胶键合C18固相萃取)

图4中，波峰1是三七皂苷R1，2是人参皂苷Rg1，3是人参皂苷Re，4是人参皂苷Rb1。

通过图4中，4个不同厂家不同批次的复方丹参片两种方法谱图和含量数据的对比发现，药典方法测定三七皂苷R1和人参皂苷Re的时候，有明显的杂质干扰，而这些干扰杂质会导致这两个组分积分不准确，甚至在某些批次检测的时候杂质直接包进成分峰里面而引起测定数据偏差较大(表2，RSD从 15.29％～56.20％)，而用本发明方法的聚苯乙烯包覆硅胶键合C18 固相萃取前处理后的样品，测定基线平整，几乎没有干扰杂质，测定含量数据准确可靠，不同批次之间测定的四个皂苷的含量 RSD都小于4％(表2)。这也说明尽管不同产地不同工艺生产的复方丹参片所含的皂苷成分有差异，但是合理的前处理方法可以让测定结果重现性得以提高。根据《中国药典》(2015版) 中对复方丹参片中总皂苷的含量≥6mg/片的要求，本实验中测得的四个厂家的三个批次共12批样品都符合药典要求。

本发明采用聚苯乙烯包覆硅胶键合C18固相萃取法对复方丹参片进行了样品前处理后分析测定，具有较为明显的净化效果，4种三萜皂苷组分峰型良好，周围无干扰峰，并且目标组分回收率高，本发明具有操作简单、快速、准确的优点，可以满足复方丹参片中三七有效活性成分的定量控制要求。

本发明以聚合物包覆单分散硅胶为基质键合C18的填料做成固相萃取柱，捕获目标四环三萜类皂苷成分并洗脱出来，再用高效液相色谱法对皂苷成分进行精准测定。

为了适应复方丹参制剂中四环三萜类皂苷活性物质的检测需求，本发明选择单分散硅胶为基质，用聚苯乙烯包覆硅胶，然后键合C18得到一款固相萃取填料，以此更好的保留皂苷类物质，避免了强极性和碱性物质的非特异吸附，同时利用硅胶骨架的优点，提高填料的分离性能，可解决复方丹参制剂目标皂苷分析数据不稳定的问题，以期更加合理、科学地评价复方丹参制剂的品质，为实际生产和检验提供参考依据。

除上述实施例以外，本发明还可以有其他方式实现，在不脱离本发明内容的前提下，任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种基于聚合物包覆硅胶键合填料测定复方丹参制剂中四环三萜类皂苷的分析方法，其特征在于，所述分析方法步骤如下：

（1）样品的提取：将复方丹参片除去包衣，精密称取，加入70%甲醇，超声提取，冷却后过滤；

（2）固相萃取净化：

装填：将聚合物包覆硅胶键合填料和聚丙烯管装填成固相萃取柱；

活化：依次使用甲醇和水活化所述固相萃取柱；

上样：移取步骤（1）所得续滤液蒸干，蒸干后残渣加水溶解后上固相萃取柱，弃去流出液；

淋洗：依次使用水、40%甲醇溶液淋洗，弃去淋洗液；

洗脱：用甲醇洗脱后用甲醇定容，经微孔滤膜滤过，取续滤液进行液相色谱检测；

（2）液相色谱检测：色谱柱：ChromCore C18 ；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水，进行梯度洗脱；

所述聚合物包覆硅胶键合填料是聚苯乙烯包覆单分散硅胶键合C18烷烃。

2.如权利要求1所述的基于聚合物包覆硅胶键合填料测定复方丹参制剂中四环三萜类皂苷的分析方法，其特征在于，步骤（3）中流动相洗脱采用梯度洗脱，梯度洗脱条件：0~35min，19%A；35~55min，19%A~29%A；55~70min，29%A；70~100min，29%~40%A。

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