CN109900829B

CN109900829B - 一种清热止咳颗粒的质量控制方法

Info

Publication number: CN109900829B
Application number: CN201910247993.5A
Authority: CN
Inventors: 于娟; 袁慧君; 徐伟; 许文; 吴丽璇; 蒋珍珍
Original assignee: Zhangzhou Pientzehuang Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhangzhou Pientzehuang Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2039-03-28
Also published as: CN109900829A

Abstract

本发明提供了一种清热止咳颗粒及其中间品的质量控制方法，它涉及清热止咳颗粒制剂和中间品多成分含量的同时测定法和一测多评测定法，本发明建立的检测方法可对清热止咳颗粒中7种主要黄酮类成分的含量同时测定，为清热止咳颗粒生产过程中药效成分的监控提供了高效、准确的检测方法。

Description

一种清热止咳颗粒的质量控制方法

技术领域

本发明具体涉及一种清热止咳颗粒的质量控制方法。

背景技术

清热止咳颗粒由黄芩、陈皮、枳壳、浙贝母、重楼、桔梗、鸭跖草等14味中药组成，具有清热化痰、宣肺止咳的功效，用于痰热阻肺所致的咳嗽，痰黏稠或黄，发热，急性支气管炎、慢性支气管炎(单纯型)急性发作的证候。处方中黄芩的黄芩苷具有抗炎、抗流感病毒等作用，陈皮中的指标性成分橙皮苷、新橙皮苷有抗病毒的作用，枳壳中的活性成分芸香柚皮苷和柚皮苷也具有抗炎等药效，黄酮类成分均被认为是清热止咳颗粒主要药效成分。

药物的质量控制是药物质量的保证，质量控制方法的好坏也决定了药物质量的好坏。目前，清热止咳颗粒的质量控制标准仅仅检测黄芩苷单一成分，文献报道中也大多通过检测黄芩苷来控制质量，而中药复方的复杂性决定了单一指标的评价难以全面反映复方的整体质量。现有文献也报道了通过控制贝母素甲和贝母素乙来控制清热止咳颗粒的质量，但是贝母素甲和贝母素乙均不是抗炎的有效成分，该方法无法准确评价清热止咳颗粒抗炎功效的质量。

因此，建立能同时测定其中多种黄酮类指标成分的方法，对于其质量控制和确保疗效具有重要的意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明建立了一种清热止咳颗粒制剂及其中间品黄酮类成分的同时测定方法，它包括如下操作步骤：

1)供试品溶液的制备：取待测样品，采用有机溶剂提取黄酮类成分，制成供试品溶液；

2)采用高效液相色谱法检测，色谱条件如下：色谱柱：C₁₈色谱柱；流动相:以乙腈为流动相A，以0.1～0.5％甲酸为流动相B相；梯度洗脱程序如下：

进一步地，所述方法以黄酮类对照品为对照。

更进一步地，所述对照品为芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷。

更进一步地，所述对照品的溶液是黄酮类对照品，加有机溶剂溶解制成。

进一步地，所述有机溶剂为甲醇溶液。

进一步地，步骤1)所述待测样品为清热止咳颗粒中间体干膏粉末或清热止咳颗粒；所述提取为超声提取，提取时间15～60min，优选30min。

进一步地，步骤2)所述流动相B相为0.1％甲酸；所述色谱条件的进样量为1-25μL，优选10μL，柱温为20-45℃，优选30℃，波长为280nm，流速为0.6-1.2mL·min^-1，优选0.8mL·min^-1。

进一步地，所述方法检测的供试品溶液中各黄酮类成分的浓度应分别在以下线性范围内：芸香柚皮苷0.7-33.0μg/mL，柚皮苷2.3-94.0μg/mL，橙皮苷1.3-54.0μg/mL，新橙皮苷2.4-100μg/mL，黄芩苷2.3-96.0μg/mL，木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷0.7-33.0μg/mL，汉黄芩苷0.5-25.0μg/mL；优选芸香柚皮苷0.810-32.4μg/mL，柚皮苷2.345-93.8μg/mL，橙皮苷1.345-53.8μg/mL，新橙皮苷2.480-99.2μg/mL，黄芩苷2.380-95.2μg/mL，木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷0.825-33.0μg/mL，汉黄芩苷0.605-24.2μg/mL。

本发明还提供了一种清热止咳颗粒制剂及其中间品黄酮类成分的一测多评检测方法，它是用高效液相色谱法检测，具体包括如下操作步骤：

a)对照品溶液的制备：取黄酮类对照品，加有机溶剂制成对照品溶液；所述黄酮类对照品为芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷中的任意一种，优选新橙皮苷；

b)供试品溶液的制备：取待测样品，采用有机溶剂提取黄酮类成分，制成供试品溶液；

c)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入色谱仪，色谱条件如下：色谱柱：C₁₈色谱柱；流动相:以乙腈为流动相A，以0.1～0.5％甲酸为流动相B相；梯度洗脱程序如下：

d)先计算对照品对应成分含量，再使用相对矫正因子计算待测样品中其余成分的含量。

进一步地，所述有机溶剂为甲醇溶液。

进一步地，步骤c)所述流动相B相为0.1％甲酸。

进一步地，步骤c)所述色谱条件的进样量为1-25μL，优选10μL，柱温为20-45℃，优选30℃，波长为280nm，流速为0.6-1.2mL·min^-1，优选0.8mL·min^-1。

进一步地，步骤b)所述待测样品为清热止咳颗粒中间体干膏粉末或清热止咳颗粒。

进一步地，步骤b)所述提取为超声提取，提取时间15～60min，优选30min。

进一步地，步骤d)所述相对校正因子按照下述方法得到：

取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷对照品，根据步骤a)和步骤c)所述方法检测，择一对照品为内参物，根据如下公式计算：

f_s/i＝f_s/f_i＝A_s×C_i/(A_i×C_s)；式中A_s为内参物s峰面积，C_s为内参物s浓度，A_i为组分i峰面积，C_i为组分i浓度。

更进一步地，所述内参物为新橙皮苷时，新橙皮苷与芸香柚皮苷的相对矫正因子为1.150，新橙皮苷与柚皮苷的相对矫正因子为1.109，新橙皮苷与橙皮苷的相对矫正因子为1.110，新橙皮苷与黄芩苷的相对矫正因子为0.658，新橙皮苷与木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷的相对矫正因子为0.723，新橙皮苷与汉黄芩苷的相对矫正因子为0.572。

本发明的清热止咳颗粒的质量控制方法，能同时测定清热止咳颗粒中间体或清热止咳颗粒中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷共7种黄酮类成分，方法操作简单，稳定性好，准确度高，检测时间短，效率高，检测成本低。通过相对校正因子f计算其含量，能实现清热止咳颗粒中主要黄酮类成分的含量准确测定，为清热止咳颗粒质量控制提供了新方法。经试验证明，本发明的一测多评法与外标法相互验证，无明显差异，结果可靠。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1液相色谱图(A：混合对照品图，B：编号S1供试品图，C：缺陈皮阴性供试品图，D：缺枳壳阴性供试品图，E：缺陈皮枳壳阴性供试品图，F：缺黄芩阴性样品色谱图；1-芸香柚皮苷，2-柚皮苷，3-橙皮苷，4-新橙皮苷，5-黄芩苷，6-木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷，7-汉黄芩苷)

具体实施方式

实施例1本发明检测方法(外标法)

(1)混合对照品的制备

精密称取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷对照品，加入甲醇超声溶解，制成质量浓度分别为0.648、0.938、0.538、0.992、0.952、0.484和0.660mg/mL的单一对照品储备液，备用，检测时，分别精密量取上述对照品溶液，置同一容量瓶中，加入50％甲醇至刻度，即得芸香柚皮苷32.40μg/mL、柚皮苷93.80μg/mL、橙皮苷53.80μg/mL、新橙皮苷99.20μg/mL、黄芩苷95.20μg/mL、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷33.000μg/mL和汉黄芩苷24.20μg/mL的混合对照品溶液，进一步用50％甲醇稀释配制成系列浓度的混合对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备

取清热止咳颗粒中间体干膏粉末及清热止咳颗粒各0.1g，精密称定，分别置具塞三角瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再次称重，70％甲醇补足减失重，摇匀，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

(3)分别吸取系列对照品溶液和供试品溶液注入色谱仪；色谱柱：ThermoBETASILC₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相:以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸为流动相B；流速0.8mL·min^-1；检测波长为280nm；柱温30℃；进样量：10μL，理论塔板数按各色谱峰计算应不低于5000；梯度洗脱程序如下：

(4)以芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，分别绘制标准曲线，根据标准曲线计算清热止咳颗粒中间体干膏粉末及清热止咳颗粒中各成分的含量。

实施例2本发明检测方法(一测多评)

(1)对照品溶液的制备

精密称取新橙皮苷对照品，加入甲醇超声溶解，制成质量浓度为0.992mg/mL的对照品储备液，备用。检测时，精密量取对照品储备液，置容量瓶中，加入50％甲醇至刻度，得99.20μg/mL新橙皮苷对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备

(3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入色谱仪；色谱柱：ThermoBETASIL C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相:以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸为流动相B；流速0.8mL·min^-1；检测波长为280nm；柱温30℃；进样量：10μL，理论塔板数按各色谱峰计算应不低于5000；梯度洗脱程序如下：

(4)先计算待测样品中新橙皮苷的含量，再根据样品中新橙皮苷的含量，使用相对矫正因子计算待测样品中芸香柚皮苷，柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷的含量；

相对校正因子为：

相对校正因子测定结果

以下通过实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1

1仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；DIONEXultimate 3000高效液相色谱仪(美国戴安公司)；Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；CPA225D型十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)；KQ-500E台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TD5A-WSX型离心机(湖南湘仪)；乙腈为色谱纯(德国Merck公司)，Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)，其余试剂均为分析纯。

对照品柚皮苷(批号：110722-201714)、橙皮苷(批号：110721-201617)，新橙皮苷(批号：111857-201703)、黄芩苷(批号：110715-201720)和汉黄芩苷(批号：112002-201702)均购自中国食品药品检定研究院；芸香柚皮苷(批号MUST-18030408)购自成都曼思特生物科技有限公司；木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷(批号14080123)购自上海同田生物技术股份有限公司，以上标准品纯度均大于98％。10批次清热止咳颗粒中间体干膏编号：S1—S10及对应的阴性样品均来自福建漳州片仔癀药业股份有限公司。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：ThermoBETASIL C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-0.1％甲酸(B)，采用梯度洗脱：0～5min，20％～21％A；5～10min，21％～25A；10～15min，25％～30％A；15～20min，30％～30％A；20～30min，30％～70％A；30～30.1min，70％～20％A；30.1～35min，20％～20％A；流速0.8mL·min-1；检测波长为280nm；柱温30℃；进样量：10μL。理论塔板数按各色谱峰计算应不低于5000，见图1。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备

精密取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷对照品，精密称定，加入甲醇超声溶解，制成质量浓度分别为0.648、0.938、0.538、0.992、0.952、0.484和0.660mg/mL的单一对照品储备液，备用。分别精密量取上述对照品储备液，置同一容量瓶中，加入50％甲醇至刻度，即得芸香柚皮苷32.40μg/mL、柚皮苷93.80μg/mL、橙皮苷53.80μg/mL、新橙皮苷99.20μg/mL、黄芩苷95.20μg/mL、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷33.000μg/mL和汉黄芩苷24.20μg/mL的混合对照品母液。

2.2.2供试品溶液的制备

分别取清热止咳颗粒中间体干膏粉末及清热止咳颗粒各约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min(功率250W，频率50kHz)，放冷，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液的制备

按处方比例分别制备缺陈皮、缺枳壳、缺陈皮和枳壳、缺黄芩的阴性样品，按供试品溶液制备方法，同法制备相应的阴性样品溶液。

2.3方法学验证

2.3.1线性关系考察取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷的混合对照品母液，用50％甲醇稀释配制为不同梯度浓度的混合对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定。以芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，分别绘制标准曲线，得回归方程和相关系数，结果见表1。

表1清热止咳颗粒干膏中7个成分的线性关系、检测限和定量限

2.3.2精密度实验精密吸取混合对照品溶液10μL，1d内连续进样6次，分别计算芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷峰面积的RSD，见表2，结果表明精密度良好。

2.3.3稳定性实验取“2.2.2”项下方法制备的供试品的溶液，分别于0、2、4、8、12和24h按“2.1”项下测定各成分的峰面积，计算峰面积的RSD见表2，结果表明供试液在24h内稳定。

表2清热止咳颗粒干膏及清热止咳颗粒中7个成分的精密度、稳定性试验结果

2.3.4重复性实验精密称取同一批(编号S1)清热止咳颗粒中间体干膏样品及同一批(编号P1)清热止咳颗粒样品各6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下测定各成分的峰面积，以标准曲线计算芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷峰的质量分数，各成分的质量分数及峰面积的RSD见表3，结果表明方法重复性良好。

表3清热止咳颗粒干膏中7个成分的重复性试验结果

2.3.5回收率实验分别称取重复性实验同批清热止咳颗粒中间体干膏粉末及同批清热止咳颗粒各约0.05g，精密称定，平行6份，每份分别精密加入近似等量的7种对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下测定各成分的峰面积，计算各个化合物的回收率和回收率的RSD，结果见表4、表5，表明该方法回收率良好。

表4清热止咳颗粒干膏中7个成分的回收率试验结果(n＝6)

表5清热止咳颗粒中7个成分的回收率试验结果(n＝6)

2.4相对校正因子(fs/i)的建立

根据一测多评的相对校正因子(fs/i)计算公示fs/i＝fs/fi＝As×Ci/(Ai×Cs)(式中As为内标物s峰面积，Cs为内标物s浓度，Ai为组分i峰面积，Ci为组分i浓度)，并以考察通过的各组耐用性RCF值的平均值作为最后的RCF定值，以新橙皮苷为内参物，计算新橙皮苷(d)与芸香柚皮苷(a)，柚皮苷(b)、橙皮苷(c)、黄芩苷(e)、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷(f)和汉黄芩苷(g)的相对校正因子分别为1.150、1.109、1.110、0.658、0.723和0.572。

2.4.1相对校正因子(fs/i)耐用性评价

2.4.1.1不同高效液相色谱仪和色谱柱对fs/i的影响

分别在Agilent1260，戴安Ultimate 3000，Waters e2695 3种高效液相色谱系统进行，考察了Thermo BETASIL C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)、Phenomenex Luna C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)和Welch UitimateXB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)3种色谱柱对fs/i的影响，各成分在不同色谱仪和不同色谱柱上的fs/i的RSD均小于4％，表明不同色谱仪和不同色谱柱所得的相对校正因子无明显差异。

2.4.1.2不同进样体积对fs/i的影响

实验考察了不同进样体积(1、2、4、8、10、15、20、25μL)对fs/i的影响，精密吸取混合对照品溶液的不同进样体积注入液相色谱仪中，记录峰面积。各成分fs/i的RSD均＜3％，表明不同进样体积对各成分fs/i无显著影响。

2.4.1.3不同色谱柱柱温对fs/i的影响

采用Agilent 1260高效液相色谱系统，Thermo BETASIL C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)。考察不同柱温(20、25、30、35、40、45℃)对fs/i的影响，结果显示，fs/i无显著性差异，RSD＜2％。

2.4.1.4不同流动相体积流量对fs/i的影响

实验考察了不同体积流量(0.6、0.8、1.0、1.2mL·min^-1)对fs/i的影响，精密吸取混合对照品溶液10μL注入液相色谱仪中，记录峰面积。各成分fs/i的RSD均＜2％，表明不同体积流量对各成分fs/i无显著影响。

2.4.1.5不同检测波长对fs/i的影响

实验考察了不同波长(279nm、280nm和281nm)对fs/i的影响，精密吸取混合对照品溶液10μL注入液相色谱仪中，记录峰面积。各成分fs/i的RSD均＜4％，表明不同检测波长对各成分fs/i无显著影响。

2.4.1.6不同酸水比例对fs/i的影响

实验考察了不同流动相甲酸体积分数为(0.05％、0.10％、0.15％、0.20％)对fs/i的影响，精密吸取混合对照品溶液10μL注入液相色谱仪中，记录峰面积。各成分fs/i的RSD均＜2％，表明不同pH值对各成分fs/i无显著影响。

2.4.2待测组分色谱峰的定位

色谱峰的准确定位是保证QAMS法应用的前提，一般可以采用保留时间差(Δts/i)或相对保留值(ts/i)等参数定位。通过考察在不同色谱柱中各待测色谱峰与参照物峰的ts/i及Δts/i进行各成分定位。结果表明ts/i和Δts/i的RSD均＜4％，但相比而言，ts/i的RSD更小，对色谱峰定位更为准确，因此利用ts/i进行色谱法定位。实验所得新橙皮苷与芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷的ts/i为1.2540、1.1394、1.0812、0.8365、0.6829和0.6131。

2.5一测多评法与外标法测定的比较

2.5.1清热止咳颗粒中间体干膏：取清热止咳颗粒中间体干膏样品，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定各批次样品，计算清热止咳颗粒干膏中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷的含量；并运用新橙皮苷对芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷的相对校正因子计算各成分的量。将一测多评法与外标法计算所得到的含量值进行比较，2种方法所得到的清热止咳颗粒干膏中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷的量基本一致，RSD小于5％，可认为QAMS法可以代替外标法进行多成分质量评价，此方法可行，结果见表6。

2.5.2清热止咳颗粒：取10批清热止咳颗粒样品，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定各批次样品，计算清热止咳颗粒中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷的含量；并运用新橙皮苷对芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷的相对校正因子计算各成分的量。将一测多评法与外标法计算所得到的含量值进行比较，2种方法所得到的清热止咳颗粒中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷的量基本一致，RSD小于5％，可认为QAMS法可以代替外标法进行多成分质量评价，此方法可行，结果见表7。

综上所述，本发明通过建立清热止咳颗粒制剂及其中间体中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷等7种黄酮类成分的含量测定方法，对比外标法和一测多评法所测得的含量没有显著性差异，两种方法均具有良好的重现性、稳定性以及准确度，可为清热止咳颗粒质量标准的提升及中间体和制剂的质控提供依据。

Claims

1.一种清热止咳颗粒制剂及其中间品黄酮类成分的同时测定方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

1）供试品溶液的制备：取待测样品，采用有机溶剂提取黄酮类成分，制成供试品溶液；

2）采用高效液相色谱法检测，色谱条件如下：色谱柱：C₁₈色谱柱；流动相:以乙腈为流动相A，以0.1~0.5%甲酸为流动相B相；梯度洗脱程序如下：

所述方法以黄酮类对照品为对照；

进一步地，所述对照品为芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述对照品的溶液是黄酮类对照品，加有机溶剂溶解制成。

3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇溶液。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤1）所述待测样品为清热止咳颗粒中间体干膏粉末或清热止咳颗粒；所述提取为超声提取，提取时间15~60min。

5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于：所述提取时间30min。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤2）所述流动相B相为0.1%甲酸；所述色谱条件的进样量为1-25μL，柱温为20-45℃，波长为280 nm，流速为0.6-1.2mL·min^-1。

7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于：所述色谱条件的进样量为10μL，柱温为30℃，流速为0.8mL·min^-1。

8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述方法检测的供试品溶液中各黄酮类成分的浓度应分别在以下线性范围内：芸香柚皮苷0.7-33.0μg/mL，柚皮苷2.3-94.0μg/mL，橙皮苷1.3-54.0μg/mL，新橙皮苷2.4-100μg/mL，黄芩苷2.3-96.0μg/mL，木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷0.7-33.0μg/mL，汉黄芩苷0.5-25.0μg/mL。

9.根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于：所述方法检测的供试品溶液中各黄酮类成分的浓度应分别在以下线性范围内：芸香柚皮苷0.810-32.4μg/mL，柚皮苷2.345-93.8μg/mL，橙皮苷1.345-53.8μg/mL，新橙皮苷2.480-99.2μg/mL，黄芩苷2.380-95.2μg/mL，木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷0.825-33.0μg/mL，汉黄芩苷0.605-24.2μg/mL。

10.一种清热止咳颗粒制剂及其中间品黄酮类成分的一测多评检测方法，其特征在于：它是用高效液相色谱法检测，具体包括如下操作步骤：

a）对照品溶液的制备：取黄酮类对照品，加有机溶剂制成对照品溶液；所述黄酮类对照品为芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷中的任意一种；

b）供试品溶液的制备：取待测样品，采用有机溶剂提取黄酮类成分，制成供试品溶液；

c）分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入色谱仪，色谱条件如下：色谱柱：C₁₈色谱柱；流动相:以乙腈为流动相A，以0.1~0.5%甲酸为流动相B相；梯度洗脱程序如下：

d）先计算对照品对应成分含量，再使用相对校正因子计算待测样品中其余成分的含量；

所述黄酮类成分为芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷。

11.根据权利要求10所述检测方法，其特征在于：所述黄酮类对照品为新橙皮苷。

12.根据权利要求10所述检测方法，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇溶液。

13.根据权利要求10所述检测方法，其特征在于：步骤c）所述流动相B相为0.1%甲酸；所述色谱条件的进样量为1-25μL，柱温为20-45℃，流速为0.6-1.2mL·min^-1。

14.根据权利要求13所述检测方法，其特征在于：所述色谱条件的进样量为10μL，柱温为30℃，流速为0.8 mL·min^-1。

15.根据权利要求10所述检测方法，其特征在于：步骤b）所述待测样品为清热止咳颗粒中间体干膏粉末或清热止咳颗粒；所述提取为超声提取，提取时间15~60min。

16.根据权利要求15所述检测方法，其特征在于：所述提取时间30min。

17.根据权利要求10所述检测方法，其特征在于：步骤d）所述相对校正因子按照下述方法得到：

取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷和汉黄芩苷对照品，根据权利要求10~14任意一项所述方法检测，择一对照品为内参物，根据如下公式计算：

f _s/i＝f _s/f _i＝A _s×C _i/（A _i×C _s）；式中A _s为内参物s峰面积，C _s为内参物s浓度，A _i为组分i峰面积，C _i为组分i浓度。

18.根据权利要求17所述的检测方法，其特征在于：所述内参物为新橙皮苷时，新橙皮苷与芸香柚皮苷的相对校正因子为1.150，新橙皮苷与柚皮苷的相对校正因子为1.109，新橙皮苷与橙皮苷的相对校正因子为1.110，新橙皮苷与黄芩苷的相对校正因子为0.658，新橙皮苷与木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷的相对校正因子为0.723，新橙皮苷与汉黄芩苷的相对校正因子为0.572。