发明内容
本发明的目的是提供一种益肾养元合剂的检测方法,该检测方法可以同时测定益肾养元合剂中补骨脂素和异补骨脂素2种有效成分的含量。
具体的技术方案如下:
一种益肾养元合剂的检测方法,所述益肾养元合剂是由何首乌、狗脊、补骨脂、黄精、菟丝子、金樱子、当归、陈皮八味中药组成的中药复方制剂,采用HPLC测定益肾养元合剂中补骨脂素和异补骨脂素的含量,包括如下步骤:
(1)制备供试品溶液
取益肾养元合剂25ml置100ml容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,过滤,取滤液5ml置10ml容量瓶中,加流动相至刻度,摇匀,即得;
(2)制备对照品溶液
精密称取经五氧化二磷减压干燥后的补骨脂素、异补骨脂素对照品适量,甲醇溶解定容,制成每1ml各含补骨脂素、异补骨脂素10μg的对照品溶液;
(3)测定
色谱条件:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相为体积比35∶65的甲醇和水;检测波长为246nm;流速为0.5-1.5ml·min-1;柱温35℃;峰面积外标法定量;
精密吸取补骨脂素和异补骨脂素对照品溶液和供试品溶液20μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
优选地,所述步骤(3)中流速为1.0ml·min-1。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的质量分析方法在同一色谱条件下检出补骨脂素和异补骨脂素两个有效成分,检测方法经过参数的最优化组合,从而使本发明的检测方法灵敏度高,具有很好的分离度,基线稳定,阴性对照无干扰,检测方法的准确性、重现性、线性关系、稳定性均能达到科研和生产的要求。
具体实施方式
益肾养元合剂是由何首乌、狗脊、补骨脂、黄精、菟丝子、金樱子、当归、陈皮八味中药组成的中药复方制剂。
以下通过具体实施例来详细说明本发明。
实施例1一种益肾养元合剂的检测方法
采用HPLC法测定益肾养元合剂中补骨脂素和异补骨脂素的含量,包括以下步骤:
(1)制备供试品溶液:
样品溶液的制备:取益肾养元合剂25ml置100ml容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,过滤,取续滤液5ml置10ml容量瓶中,加流动相至刻度,摇匀,即得;
(2)制备对照品溶液:
精密称取经五氧化二磷减压干燥24h的补骨脂素、异补骨脂素对照品适量,甲醇溶解定容,制成每1ml各含补骨脂素、异补骨脂素10μg的对照品溶液;
(3)测定
色谱条件:色谱柱为AgilentC18柱(以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂150mm×4.6mm,5m);流动相为体积比35∶65的甲醇和水;检测波长为246nm;流速1.0ml·min-1;柱温35℃;峰面积外标法定量;
精密吸取补骨脂素和异补骨脂素对照品溶液和供试品溶液20μl(供试品溶液图谱见图3),注入液相色谱仪,测定,即得;
本发明所检测的益肾养元合剂中按补骨脂素和异补骨脂素峰计算的理论塔板数不应低于4000,分离度大于1.5。
取三批样品,按照该实施例的方法进行补骨脂素和异补骨脂素的含量测定,用外标法计算样品补骨脂素和异补骨脂素的含量,测定结果如表1。
表1样品含量测定结果
实施例2一种益肾养元合剂的质量分析方法的条件筛选及方法学验证
1、提取溶剂的选择
补骨脂素和异补骨脂素在乙醇和甲醇中的溶解度一致,但乙醇稀释得到的样品溶液较粘稠,杂质和样品中的糖分在乙醇中较甲醇中溶解多,故选用甲醇作为溶剂。
2、检测波长的选择
取上述补骨脂素和异补骨脂素对照品混合溶液,在紫外分光光度计上于波长200nm~500nm处扫描,结果在246nm波长处有最大吸收峰,故以246nm为检测波长。
3、流动相的选择
甲醇与水的体积比例达到35∶65时,主峰与杂质峰之间有较好的分离,而且整个分析过程在25min内可以完成。
4、柱温的选择
在25~45℃范围内选择25℃、35℃、45℃试验,结果35℃时分离度达到1.58,达到很好的分离效果,故选用35℃。
5、方法学验证
(1)线性关系的考察
精密称取补骨脂素10.01mg、异补骨脂素对照品10.22mg,分别置于25ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为补骨脂素和异补骨脂素对照品储备液。精密吸取补骨脂素和异补骨脂素对照品储备液适量,用流动相按比例稀释成补骨脂素浓度为2.002、4.004、8.008、10.01、20.02、40.04μg·ml-1,异补骨脂素浓度为2.044、4.088、8.176、10.22、20.44、40.88μg·ml-1的标准液。按上述色谱条件进样20μl,记录峰面积。以峰面积(y)为纵坐标、补骨脂素和异补骨脂素进样浓度(x)为横坐标进行线性回归,得回归方程:补骨脂素Y=179.879X-18.008,r为0.99995,结果表明补骨脂素在40.04ng~800.8ng范围内呈良好的线性关系;异补骨脂素线性方程Y=164.772128X-16.595372,r为0.99996,结果表明异补骨脂素在40.88ng~817.6ng范围内呈良好的线性关系。
(2)专属性试验
按处方比例,制备缺味(补骨脂)中药的阴性空白对照液,照上述样品溶液的制备方法制成阴性空白对照溶液,进样,阴性对照色谱图在补骨脂素和异补骨脂素对照品出峰处没有干扰峰出现,故样品中的其他组分对补骨脂素和异补骨脂素测定无干扰作用(见图1、图2、图3)。
(3)精密度试验:
取同一补骨脂素和异补骨脂素对照溶液进样20μl,连续进样6次,记录峰面积测得补骨脂素分别为1438.8、1436.8、1433.5、1436.1、1434.6、1439.5,RSD为0.17%(n=6),异补骨脂素分别为1351.9、1348.1、1345.8、1344.2、1346.6、1345.2,RSD为0.21%(n=6)。结果表明精密度良好。
(4)稳定性试验:取同一批样品溶液(批号D11001),按上述色谱条件测定6次,分别在第0,2,5,7,12,24h进行测定,测得补骨脂素RSD为2.78%,异补骨脂素RSD为2.61%。表明样品溶液在24h内稳定性良好。
(5)重现性试验:
取同一批样品溶液(批号:D11001)按3.1.1项下样品溶液的制备方法制备供试液,平行测定,得补骨脂素的含量分别为46.26、45.25、48.36、47.17、47.15、46.47μg·ml-1,平均含量为46.78μg·ml-1,RSD为2.24%(n=6)。异补骨脂素的含量分别63.62、61.39、65.38、64.06、65.55、63.78μg·ml-1,平均含量为63.96μg·ml-1,RSD为2.36%(n=6)。结果表明:本方法重现性良好。
(6)回收率试验:
采用加样回收试验方法,取已知补骨脂素和异补骨脂素含量的样品(补骨脂素含量为46.78μg·ml-1,异补骨脂素为63.96μg·ml-1)的样品6份,每份取样12.5ml,精密加入一定量的对照品,按含量测定项下方法操作,测定,计算结果(见表2、表3)。
表2补骨脂素回收率测定结果(n=6)
表3异补骨脂素回收率测定结果(n=6)
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明,但该实施例并非用以限制本发明的专利范围,凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更,均应包含于本发明的专利范围中。