CN104090056A - Hplc-elsd法对贝羚胶囊中猪去氧胆酸的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HPLC-ELSD法对贝羚胶囊中猪去氧胆酸的含量测定方法，其特征在于，包括：(1)样品的准备：准备猪去氧胆酸和贝羚胶囊样品，将贝羚胶囊制备成溶液供试溶液；(2)高效液相色谱：色谱柱，流动相为乙腈-0.05％～0.15％酸溶液，二者重量百分比为50～75:25～50；流速1.0ml·min^-1；进样体积20μl；(3)检测：ELSD检测器以空气为载气，漂移管温度从90℃开始，每5℃检测一次，空气流速为1.7～3.0L·min^-1，以猪去氧胆酸峰面积计算，分离度不低于2.0，理论塔板不低于3000。本发明的方法可用于猪去氧胆酸的含量测定，专属性、耐用性、精密度、准确度良好，适用于贝羚胶囊的整体质量控制。

Description

HPLC-ELSD法对贝羚胶囊中猪去氧胆酸的含量测定方法

技术领域

本发明涉及一种含量测定方法，具体涉及一种HPLC-ELSD法对贝羚胶囊中有效成分猪去氧胆酸的含量测定方法，属于药物质量标准、分析化学以及药物分析的技术领域。

背景技术

现有质量标准中贝羚胶囊中有效成分猪去氧胆酸的含量测定方法是薄层色谱扫描。

薄层扫描有其自身的一些缺陷，包括重复性差，受到各种干扰多，不够灵敏等。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种HPLC-ELSD法对贝羚胶囊中有效成分猪去氧胆酸的含量测定方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。适用于药物质量标准、分析化学以及药物分析的技术领域。

1、HPLC-ELSD法与薄层色谱法比较更简便，准确，灵敏度高，重现性好。作进一步优化了国家标准质控指标的检测方法，建立了猪去氧胆酸的含量测定方法，确定质量标准项目和限度范围，完成质量标准提升工作提高其质量标准，最终形成更加全面、严格的内控质量标准，做到质量可控，以保证临床使用的有效性和安全性。

2、将原有的质量标准中贝羚胶囊中有效成分猪去氧胆酸的含量测定方法薄层色谱扫描，改变成更加简便，准确，灵敏度高，重现性好的HPLC-ELSD法。

3、由于指标成分猪去氧胆酸在紫外区吸收较小，在近紫外区测定时色谱基线漂移很大，不易作定量用，故选择用蒸发光散射检测器，在上述的漂移管温度和气流下，色谱有稳定的基线，灵敏度高，适合用于定量分析。

贝羚胶囊主要功效为清热化痰，止咳平喘。用于痰热肺阻，气喘咳嗽，小儿肺炎，喘息性支气管炎及成人慢性支气管炎见上述证候者。

贝羚胶囊的制备工艺：

(1)按照贝羚胶囊处方准备原料：

川贝母、羚羊角、猪去氧胆酸、人工麝香、沉香、人工天竺黄(飞)、煅青礞石(飞)、硼砂(炒)以上八味；

(2)原料的粉碎：

羚羊角搓成细粉；

人工天竺黄和煅青礞石分别粉碎成细粉；

川贝母、猪去氧胆酸、人工麝香、沉香、硼砂(炒)五味分别粉碎成细粉；

(3)制粒：

除煅青礞石外，其余7味的细粉与淀粉混匀，分次加入青礞石细粉中，配研均匀，制成颗粒，过筛；

(4)制胶囊：

再加硬脂酸镁，混匀，装入胶囊，即得。

其中步骤(1)中，按照重量份数计，所述川贝母、羚羊角、猪去氧胆酸、人工麝香、沉香、人工天竺黄(飞)、煅青礞石(飞)、硼砂(炒)。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

作为本发明的第一方面，一种HPLC-ELSD法对贝羚胶囊中猪去氧胆酸的含量测定方法，其特征在于，包括：

(1)样品的准备

准备猪去氧胆酸和贝羚胶囊样品，将贝羚胶囊制备成溶液供试溶液；

(2)高效液相色谱

色谱柱，流动相为乙腈-0.05％～0.15％酸溶液，二者重量百分比为50～75:25～50；流速1.0ml·min^-1；进样体积20μl；

(3)检测

ELSD检测器以空气为载气，漂移管温度从90℃开始，每5℃检测一次，空气流速为1.7～3.0L·min^-1，以猪去氧胆酸峰面积计算，分离度不低于2.0，理论塔板不低于3000。

步骤(1)还包括样品前处理，采用75％甲醇溶剂50ml，超声提取20min。

步骤(1)中，贝羚胶囊制备成溶液供试溶液进一步包括：取贝羚胶囊内容物，混匀，研细，取0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中；精密加入75％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量；用75％甲醇再补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

步骤(2)中，所述色谱柱为Inertsil ODS-3，规格为4.6×150mm，5μm；Agilent XDB-C18，规格为4.6×250mm，5μm；以及Kromasil100-5C18规格为4.6×150mm，5μm。优选为Kromasil100-5C18(4.6×150mm，5μm)色谱柱。

步骤(2)中，所述流动相乙腈：0.1％酸溶液二者重量百分比为50:50；所述酸为磷酸、冰乙酸、甲酸的水溶液作水相体系。

步骤(2)中，所述色谱柱的温度为25℃～35℃。25℃下的理论塔板数最高，分离度高，优选为25℃柱温。

步骤(2)中，所述漂移管温度90℃较佳。

步骤(2)中，所述色谱柱的载气流速为2.5L·min^-1。2.5L·min^-1气体流速下，噪音最小，峰型最好。

步骤(3)中，猪去氧胆酸的线性回归方程：Y＝1.0595X+3.8387，r＝0.9999，猪去氧胆酸在10.48～42.408μg范围内呈良好的线性关系，含量测定采用外标两点法计算。

作为本发明的第二方面，一种HPLC-ELSD法对贝羚胶囊中猪去氧胆酸的含量测定方法的用途，其特征在于，测定贝羚胶囊中有效成分猪去氧胆酸的含量。

本发明的有益效果：

贝羚胶囊目前质量标准中含量测定方法为薄层色谱扫描法，存在的问题是重复性差，受到各种干扰多，不够灵敏等。因此将其改成高校色谱法。

由于指标成分猪去氧胆酸在紫外区吸收较小在近紫外区测定时色谱基线漂移很大，不易作定量用，故选择用蒸发光散射检测器，在上述的漂移管温度和气流下，色谱有稳定的基线，灵敏度高，适合用于定量分析。

本发明的猪去氧胆酸的含量测定方法精密度、重复性、稳定性良好，回收率高。

附图说明

图1猪去氧胆酸对照品色谱图。

图2贝羚胶囊样品色谱图。

图3贝羚胶囊阴性样品色谱图。

图4猪去氧胆酸标准曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1

HPLC-ELSD法对贝羚胶囊中有效成分猪去氧胆酸的含量测定方法的具体研究：

1仪器和材料

1.1仪器

Agilent1100高效液相色谱仪、ELSD检测器、ChemStation B.03.01色谱工作站(安捷伦科技)；Milli-Q超纯水机(Milli-Pore)；CQ-250超声波清洗器(上海新超超声波仪器有限公司)；BS224S电子天平(Sartorius)。

1.2材料

猪去氧胆酸(批号：100087-200610，纯度97.3％，购自中国药品生物制品检定所)；贝羚胶囊样品，共16批，上海雷允上药业有限公司。

试剂：乙腈(HPLC级，Merck)；甲酸、甲醇(AR，国药化学试剂有限公司)；超纯水，实验室自制。

2贝羚胶囊含量测定

2.1溶液的制备

2.1.1对照品溶液制备

取对照品适量，用甲醇溶液制成1ml含猪去氧胆酸1.314mg的对照品溶液。

2.1.2供试品溶液制备

取装量差异项下的贝羚胶囊内容物(装量检查按照2010版药典一部中，胶囊剂装量检查法规定)，混匀，研细，取0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用75％甲醇再补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.1.3阴性供试品溶液的制备

按原处方，照贝羚胶囊产品生产工艺制备缺猪去氧胆酸的阴性供试品，再按2.1.2项下供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2.2色谱条件与系统适应性实验

色谱柱Kromasil100-5C18(4.6×150mm，5μm)；流动相为甲醇-0.1％甲酸(50：50)；流速1.0ml·min^-1；进样体积20μl。以ELSD为检测器，以空气为载气，漂移管温度90℃.空气流速为2.5L·min^-1。以猪去氧胆酸峰面积计算，分离度不低于2.0，理论塔板数不低于3000。

2.3色谱条件优化

2.3.1色谱柱选择

在其他条件相同的情况下，比较Inertsil ODS-3(4.6×150mm，5μm)、Agilent XDB-C18(4.6×250mm，5μm)以及Kromasil100-5C18(4.6×150mm，5μm)等3款色谱柱的分离效果。比较各色谱柱分离效果，结果表明，Agilent XDB-C18分离效果最好，但分离时间长，故选分离效果较好，分析时间短，各项性能指标最优的Kromasil100-5C18(4.6×150mm，5μm)色谱柱。

2.3.2流动相种类选择

在其他条件相同的情况下，比较甲醇-0.1％冰醋酸与乙腈-0.1％冰醋酸两种流动相体系，乙腈体系峰型好，理论板数与分离度相对甲醇体系高，故选择乙腈体系。比较乙腈：0.1％HAC的25:75、50:50、75:25三个不同比例，发现25:75洗脱不下来，75:25主成分出峰时间太早，分离效果不好，50：50该条件分离效果好7min钟内完成分离，因此选择流动相的比列为：50:50。

2.3.3流动相中酸种类选择

贝羚胶囊中的猪去氧胆酸在酸性流动相中分离较好。在其他条件相同的条件下，流动相乙腈：0.1％酸溶液(50:50)，比较磷酸、冰乙酸、甲酸的水溶液作水相时的分离，结果甲酸水溶液分离效果最好，故水相体系选择甲酸水溶液。

2.3.4流动相中酸浓度的考察

在其他条件相同的情况下，依据2.3.2选择的条件，比较0.05％、0.1％、0.15％三种浓度的甲酸溶液的分离，0.1％甲酸溶液分离效果最好，故选择0.1％的甲酸溶液。因此，流动相的条件确定为：乙腈：0.1％甲酸(50:50)。

2.3.5色谱柱温度考察

在其他条件相同的情况下，比较25℃、30℃、35℃等三种不同的色谱柱温度下的分离效果，25℃下的理论塔板数最高，分离度高，故选择25℃柱温。

2.3.6漂移管温度选择

在上述已选择的最佳色谱条件下，优化漂移管温度，从90℃开始，每5℃检测一次，直到信噪比不可接受为止。实验结果表明随着温度的降低，噪音相对减小，但是减小的幅度不是太大，但是随温度降低，蒸发光检测器积液增加。如果温度太高，噪音又会太大，故选择90℃为最佳的漂移管温度。

2.3.7载气流速选择

在90℃的漂移管温度下，优化空气流速，比较了3.0、2.7、2.5、2.2、2.0、1.8、1.5、1.3、1.9、2.1、1.7L·min^-1的气体流速下，色谱峰型，噪音大小。结果表明2.5L·min^-1气体流速下，噪音最小，峰型最好。故选气体流速为2.5L·min^-1。

依据上述实验，优选出猪去氧胆酸的色谱条件：色谱柱KROMASIL100-5C18(4.6×150mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1％甲酸(50:50)；流速1.0ml·min^-1；进样体积20μl。以ELSD为检测器，以空气为载气，漂移管温度90℃.空气流速为2.5L·min^-1。

3样品前处理方法考察

3.1提取溶剂考察

以指标成分猪去氧胆酸的相对峰面积(单位质量的峰面积)为评价标准，按2.1.2供试品溶液的制备方法提取，测试结果见表1。通过比较各溶剂在超声提取时的相对峰面积的大小，75％的甲醇提取效率最高，故选择75％的甲醇为提取溶剂。

表1提取溶剂选择

3.2提取溶剂体积的选择

依据2.4.1选择的75％的甲醇为提取溶剂，在超声提取条件下比较不同体积下提取效果，以指标成分的峰面积为评价指标，结果见表2，通过比较发现50ml提取的峰面积最大，提取效率最高，故选择提取溶剂体积50ml。

表2提取溶剂体积选择

3.3提取方法考察

参照文献及2010版中国药典可知，超声提取太长时间无意义，回流提取时间太短提取不完全，故分别比较超声和水浴回流在不同提取时间下的提取效果。以每袋贝羚胶囊中指标成分猪去氧胆酸的含量为评价标准，选择最优的提取方式，结果见表3，4。比较表3，表4发现超声提取效率有明显的优势。因此，选择超声提取方式。

表3超声提取考察

表4回流提取考察

3.4提取时间考察

在超声提取条件下，分别比较了超声20、40、60min时间内的提取效果，结果见表3。结果表明20min内提取效率较高，并且再延长超声时间，提取效果无明显优势。因此，选择超声提取20min。

依据实验结果，优选的样品前处理方法为：用75％甲醇溶剂50ml，超声提取20min。

4方法验证

4.1专属性和系统适用性试验

分别取对照品溶液、阴性供试品溶液以及供试品溶液进样，按照2.2色谱条件注入高效液相色谱仪，对供试品色谱中各对照品对应色谱峰进行归属，并计算理论塔板数、分离度和峰纯度，结果表明，各供试品色谱中对照品色谱峰理论塔板数均大于3000、分离度较好、峰纯度较高。阴性对照实验表明，阴性供试品溶液在猪去氧胆酸出峰位置(4.873min±0.2min)处无阴性干扰，该方法专属性较强，见图1～3。

图1猪去氧胆酸对照品色谱图。图2贝羚胶囊样品色谱图。图3贝羚胶囊阴性样品色谱图。

4.2线性关系考察

精密称取猪去氧胆酸65.51mg，用甲醇定容至25ml棕色容量瓶中，得到2.6204mg/ml的对照品溶液。

分别移取上述对照品溶液1、2、3、4ml于5ml棕色容量瓶中，定容至刻度。

分别得到线性标准溶液线性一：0.524mg/ml、线性二：1.0482mg/ml1、线性三：1.5723mg/ml、线性四：2.0964mg/ml，2.6204mg/ml的标准溶液为线性五。五个线性溶液分别注入液相色谱仪，进样量20μl，峰面积对数为横坐标(x)，以对照品溶液浓度为纵坐标(Y)，相关测定数据见表5，指标成分标准曲线见图4。线性回归方程：Y＝1.0595X+3.8387，r＝0.9999。结果表明：猪去氧胆酸在10.48～42.408μg范围内呈良好的线性关系，含量测定采用外标两点法计算。

表5含量测定线性关系考察结果

图4猪去氧胆酸标准曲线。

4.3精密度实验

取做标准曲线的线性三对照品溶液，连续进样6次，进样20μl，记录色谱图，以对照品色谱峰的峰面积计算RSD％值，见表6.RSD值为0.99％。结果表明该方法精密度良好。

表6精密度考察

4.4重复性实验

取同一批贝羚胶囊样品，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下分别进样20μl，记录色谱图，以每粒贝羚胶囊中猪去氧胆酸的含量计算RSD％值，结果表明每粒中猪去氧胆酸含量平均值为104.53mg/粒，RSD值为0.66％(n＝6)。见表7，结果表明样品溶液重复性良好。

表7重复性考察

4.5样品溶液稳定性

取制备好的同一供试品溶液，分别在制备后0、4、8、12、24、48、72h不同时间下进样，依法测定，用外标两点法计算猪去氧胆酸的含量，结果见表8，猪去氧胆酸的含量平均值为RSD值小于2％，表明供试液至少在72小时内稳定。

表8稳定性考察

4.6回收实验

取装量差异项下的贝羚胶囊(批号：121002批)粉末75mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，依据2.5.4中得该批样品中猪去氧胆酸含量104.53mg/粒，计算应加入猪去氧胆酸23mg，精密称定加入上述具塞锥形瓶中，再精密加入75％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用75％甲醇再补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。平行制备6份供试品溶液，在“2.2”色谱条件下测定，按外标两点法计算指标成分回收率及其RSD值。结果表明，指标成分回收率RSD值均小于2.0％，该方法的准确度符合规定。相关数据见表9。

表9回收率实验结果

5样品测定

取16批不同批号的贝羚胶囊样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，每批样品平行制备两份，每份进两针，峰面积取对数后按外标两点法计算样品中猪去氧胆酸指标成分的含量。含量测定结果见表10。

表10样品猪去氧胆酸含量测定结果

根据目前14批的结果可暂定指标成分含量限度为：本品每粒含猪去氧胆酸(C₂₄H₄₀O₄)不得少于80mg，后期工作中应进一步积累样品和数据，为制定更加科学合理的含量限度标准提供依据。

6小结

本项研究建立检测方法可用于猪去氧胆酸的含量测定，方法专属性、耐用性、精密度、准确度良好，适用于贝羚胶囊的整体质量控制。

以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。

Claims (10)

1.一种HPLC-ELSD法对贝羚胶囊中猪去氧胆酸的含量测定方法，其特征在于，包括：

(1)样品的准备

准备猪去氧胆酸和贝羚胶囊样品，将贝羚胶囊制备成溶液供试溶液；

(2)高效液相色谱

色谱柱，流动相为乙腈-0.05％～0.15％酸溶液，二者重量百分比为50～75:25～50；流速1.0ml·min^-1；进样体积20μl；

(3)检测

ELSD检测器以空气为载气，漂移管温度从90℃开始，每5℃检测一次，空气流速为1.7～3.0L·min^-1，以猪去氧胆酸峰面积计算，分离度不低于2.0，理论塔板不低于3000。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)还包括样品前处理，采用75％甲醇溶剂50ml，超声提取20min。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，贝羚胶囊制备成溶液供试溶液进一步包括：

取贝羚胶囊内容物，混匀，研细，取0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中；

精密加入75％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量；

用75％甲醇再补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述色谱柱为Inertsil ODS-3，规格为4.6×150mm，5μm；

Agilent XDB-C18，规格为4.6×250mm，5μm；以及

Kromasil100-5C18规格为4.6×150mm，5μm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述流动相乙腈：0.1％酸溶液二者重量百分比为50:50；

所述酸为磷酸、冰乙酸、甲酸的水溶液作水相体系。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述色谱柱的温度为25℃～35℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述漂移管温度90℃较佳。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述色谱柱的载气流速为2.5L·min^-1。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，猪去氧胆酸的线性回归方程：Y＝1.0595X+3.8387，r＝0.9999，猪去氧胆酸在10.48～42.408μg范围内呈良好的线性关系，含量测定采用外标两点法计算。

10.一种如权利要求1所述的HPLC-ELSD法对贝羚胶囊中猪去氧胆酸的含量测定方法的用途，其特征在于，测定贝羚胶囊中有效成分猪去氧胆酸的含量。