CN103048409A - 一种同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种同时测定中成药止咳宝片中4种有效成分（五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮）含量的方法。该方法应用现代高效液相色谱技术，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B；理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。在洗脱过程中，将流动相A、B浓度配比逐渐变化的梯度洗脱和流动相A、B配比恒定不变的等度洗脱相结合，形成一个特定的梯度洗脱程序，进行两个梯度或三个梯度洗脱，同时在梯度洗脱时变化检测波长。本发明提供的方法可定性定量的同时检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量，方法简便而快捷，而且专属性强，可有效提高止咳宝片的质量控制水平。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，尤其涉及一种HPLC法同时检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮含量的方法。
背景技术
止咳宝片中富含多种中药材，具有解表散寒、宣肺除痰，益肺气养肺阴的功效，起到理肺祛痰和止咳平喘的功能。“止咳宝片秘方”入选岭南中药文化遗产保护名录。
止咳宝片现行标准收载于《中国药典》2010年版一部，其鉴别标准中收载了1个理化鉴别和3个薄层鉴别，而止咳宝片处方中有14味药。通过研究发现多种药味的薄层色谱之间均存在阴性干扰，尚无有效分离方法进行鉴别其有效成分，导致现有的质量控制方法未能有效实现产品质量的控制。且现有的检测方法存在实验步骤繁琐，实验条件不好控制等缺点，且方法的重复性和稳定性也不够理想。
为了更加有效控制本品质量，通过对处方中药味成份研究，应用现代高效液相色谱技术，本发明提供一种采用梯度洗脱、变化检测波长的含量测定方法，其能定性定量的同时测定止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量，方法简便而快捷，有效提高止咳宝片的质量控制水平，相对现有检测方法具有技术领先水平。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供一种同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，该方法应用现代高效液相色谱技术，采用梯度洗脱（两个梯度或三个梯度），同时变化检测波长，可定性定量的同时检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量，方法简便而快捷，而且专属性强，可有效提高止咳宝片的质量控制水平。
为了实现本发明的目的，所提供的技术方案如下：
一种同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，所述四种有效成分分别是五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮，所述方法包括如下步骤：
（1）确定色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，采用由乙腈为流动相A、水为流动相B组成的洗脱液进行梯度洗脱，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000，梯度洗脱的程序及流动相A、B的体积百分比如下：
梯度1---0~20min，流动相A：B=40~65%：60~35%，A+B=100%，流速为1.0ml/min，检测波长为245~255nm；梯度1为等度洗脱；（五味子醇甲在0-20min内出峰）
梯度2----20~35min，流动相A：B=〔(40~65%)→(90~100%)〕：〔(60~35%)→(10~0%)〕，A+B=100%，流速为1.0ml/min，检测波长为220~235nm；梯度2为流动相A、B的体积百分比逐渐变化的梯度洗脱，其中流动相A、B分别由40~65%和60~35%逐渐变化到90~100%和10~0%；（20~35min内白花前胡甲素、白花前胡乙素先后出峰）
梯度3----流动相A：B=90~100%：10~0%，A+B=100%，流速为1.0~1.3ml/min，检测波长为195~205nm；梯度3为等度洗脱；待紫菀酮出峰后，继续洗脱至无杂质峰即可。
（2）制备对照品溶液；优选的对照品溶液制备方法是：精密称取五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮对照品，用甲醇溶解并配制成对照品溶液，使每1ml对照品溶液中含有3-7μg五味子醇甲、60-75μg白花前胡甲素、14-20μg白花前胡乙素、5-9μg紫菀酮。采用这一浓度范围的对照品溶液，有助于准确测定供试品中四种有效成分的含量。
（3）制备供试品溶液；优选的供试品溶液制备方法是：取止咳宝片供试品，除去包衣后研成细粉，用甲醇溶解并配制成0.04或0.08g/ml的供试品溶液。优选为0.08g/ml。
（4）测定：分别精密量取适量（例如10μl）对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，并按外标法以峰面积计算，即得检测结果。
一种同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，所述四种有效成分分别是五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮，所述方法包括如下步骤：
（1）确定色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，采用由乙腈为流动相A、水为流动相B组成的洗脱液进行梯度洗脱，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000，梯度洗脱的程序及流动相A、B的体积百分比如下：
梯度1-----0~35min，流动相A：B=〔(40~50%)→(90~100%)〕：〔(60~50%)→(10~0%)〕，A+B=100%，流速为1.0~1.2ml/min，检测波长为220~265nm；梯度1为流动相A、B的体积百分比逐渐变化的梯度洗脱，其中流动相A、B分别由40~50%和60~50%逐渐变化到90~100%和10~0%；梯度1的洗脱时长在0~35分钟内，并不代表一定要洗脱35分钟，也可根据洗脱情况和实际的实验情况提前进入梯度2，例如在25分钟或30分钟时。（0~35min内，五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素先后依次出峰）
梯度2-----流动相A：B=90~100%：10~0%，A+B=100%，流速为1.0~1.3ml/min，检测波长为195~205nm；梯度2为等度洗脱；待紫菀酮出峰后，继续洗脱至无杂质峰即可。
（2）制备对照品溶液；优选的对照品溶液制备方法是：精密称取五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮对照品，用甲醇溶解并配制成对照品溶液，使每1ml对照品溶液中含有3-7μg五味子醇甲、60-75μg白花前胡甲素、14-20μg白花前胡乙素、5-9μg紫菀酮；采用这一浓度范围的对照品溶液，有助于准确测定供试品中四种有效成分的含量。
（3）制备供试品溶液；优选的供试品溶液制备方法是：取止咳宝片供试品，除去包衣后研成细粉，用甲醇溶解并配制成0.04或0.08g/ml的供试品溶液。优选为0.08g/ml。
（4）测定：分别精密量取适量（例如10μl）对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，并按外标法以峰面积计算，即得检测结果。
进一步的，上文所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，制备供试品溶液时，采用温浸超声法，将供试品经研磨后的细粉置于具塞锥形瓶中，加入甲醇，称定总重量，于40℃温浸1小时后，超声10min，然后放至室温，并再称定总重量，用甲醇补足损失的重量，摇匀并过滤，取续滤液作为供试品溶液。也可以采用热回流法制备供试品溶液，但采用温浸超声法制备供试品溶液，具有操作更为简便的特点，同时可提高效率。
上文所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，所述供试品止咳宝片中四种有效成分的含量限度为：所述供试品每1g含前胡以白花前胡甲素（C21H22O7）和白花前胡乙素（C24H26O7）计分别不得少于700μg/g和180μg/g、含五味子以五味子醇甲（C24H32O7）计不得少于38μg/g和含紫菀以紫菀酮（C30H50O）计不得少于60μg/g。
进一步的，上文所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，制备对照品溶液时，每1ml对照品溶液中含有5μg五味子醇甲、70μg白花前胡甲素、18μg白花前胡乙素、7μg紫菀酮。
进一步的，上文所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，当连续进样检测时，追加洗脱时长为5分钟的洗脱梯度，该追加的洗脱梯度将流动相A、B的体积百分比变换为梯度1洗脱时的流动相A、B体积百分比的起始比例，并将检测波长变换到梯度1的起始检测波长。这样不仅可简化连续进样检测的操作，而且还可最大程度的避免相邻两个样品检测之间的干扰，确保检测的准确性。
优选的，所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，步骤（1）中梯度洗脱的程序及流动相A、B的体积百分比如下：
梯度1----0~35min，流动相A：B=40%→96%：60%→4%，A+B=100%，流速为1.0ml/min，检测波长为250nm，当洗脱15分钟时波长变换为228nm，梯度1为流动相A、B的体积百分比逐渐变化的梯度洗脱，其中流动相A、B分别由40%和60%逐渐变化到96%和4%；在梯度1洗脱过程中，在0~15分钟内五味子醇甲出峰，在15~35分钟内按白花前胡甲素和白花前胡乙素先后顺序出峰；
梯度2----流动相A：B=96%：4%，A+B=100%，流速为1.2ml/min，检测波长为200nm。梯度2为等度洗脱。待紫菀酮出峰后，继续洗脱至无杂质峰即可。
采用这种优选的洗脱程序，可以缩短四种有效成分的出峰时间，提高检测效率；而且，在梯度1中先以250nm为检测波长，之后再变换为228nm的检测波长，从而针对检测浓度较低的五味子醇甲可有最大吸收峰，同时又可有效检测其他几种有效成分，有效提高了检测的灵敏度。
进一步优选的，所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，所述步骤（1）中梯度洗脱的程序及流动相A、B的体积百分比如下：
梯度1----0~30min，流动相A：B=50%→100%：50%→0%，A+B=100%，流速为1.0ml/min，检测波长为228nm，梯度1为流动相A、B的体积百分比逐渐变化的梯度洗脱，其中流动相A、B分别由50%和50%逐渐变化到100%和0%；在0~30分钟按五味子醇甲、白花前胡甲素和白花前胡乙素先后顺序出峰；
梯度2----流动相A：B=100%：0%，A+B=100%，流速为1.2ml/min，检测波长为200nm；梯度2为等度洗脱。
采用这种进一步优选的洗脱程序，针对五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮均有最佳的检测波长，而且更进一步的缩短四种有效成分的出峰时间，快速而简便，进一步提高检测效率。
本发明所提供的技术方案具有如下有益效果：
本发明提供一种能同时检测止咳宝片中四种有效成分（五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮）含量的方法。该方法应用现代高效液相色谱技术，在洗脱过程中，将流动相A、B浓度配比逐渐变化的梯度洗脱和流动相A、B配比恒定不变的等度洗脱相结合，形成一个特定的梯度洗脱程序，进行两个梯度或三个梯度洗脱，同时在梯度洗脱时变化检测波长。采用这种检测方法不仅可精确分离止咳宝片中四种有效成分的检测峰，分离度好，专属性强，还可同时定量检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量。该检测方法简便而快捷，可有效提高止咳宝片的质量控制水平。本发明提供的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法具有灵敏度高、重现性好、稳定性佳的特点，可准确的定性定量检测止咳宝片的四种有效成分。采用本发明的方法可更有效的控制产品的质量，确保药物的疗效。
采用两个梯度的检测方法，不仅可以达到与三个梯度的检测方法同样的检测效果，而且可简化操作，使检测过程更为简便，效率更高。
附图说明
图1是实施例1测定所得的对照品HPLC图谱（3个梯度）
图2是实施例1测定所得的供试品HPLC图谱（3个梯度）
图3：是实施例4测定所得的供试品HPLC图谱（2个梯度）
图4：是实施例5测定所得的对照品HPLC图谱（2个梯度）
图5：是实施例5测定所得的供试品HPLC图谱（2个梯度）
图6：是实施例6测定所得的对照品HPLC图谱（2个梯度）
图7：是实施例6测定所得的供试品HPLC图谱（2个梯度）
图8：是实施例7测定所得的对照品HPLC图谱（2个梯度）
图9：是实施例7测定所得的供试品HPLC图谱（2个梯度）
具体实施方式
本发明提供一种同时测定中成药止咳宝片中4种有效成分（五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮）含量的方法。该方法应用现代高效液相色谱技术，采用梯度（两个或三个梯度）洗脱，同时变化检测波长，可定性定量的同时检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量，方法简便而快捷，有效提高止咳宝片的质量控制水平。该方法用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B；进行三个或两个梯度洗脱，进行梯度更替时变换波长的检测法，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
文中所述的等度洗脱是指在某个时间段内的洗脱过程中，流动相的浓度配比保持不变；梯度洗脱是指流动相的浓度配比在洗脱过程中按一定程序不断变化。
实施例1
同时检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量方法，详述如下（3个洗脱梯度）：
1.实验样品及对照品
止咳宝片（广东台城制药股份有限公司生产，批号：20121101）；白花前胡甲素对照品（批号：111711-200602，中国药品生物制品检定所提供）；白花前胡乙素对照品（批号：111904-201102，中国药品生物制品检定所提供）；紫菀酮对照品（批号：111581-200604，中国药品生物制品检定所提供）；五味子醇甲对照品（批号：110857-201010，中国药品生物制品检定所提供）。
2.仪器
高效液相色谱仪Agilent1260Infinity，G1315D。色谱柱：资生堂C18（4.6×250mm，5μm，柱号：AKAD08072），十万分之一级电子天平（型号：9ZSM-202A），超声仪（广州市科普超声电子技术有限公司，型号：KP-Q600）。
3.检测方法
3.1色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱（其中，梯度1为等度洗脱，梯度2为在洗脱过程中流动相A、B体积百分比由45%：55%等速连续变化到96%：4%的梯度洗脱，梯度3为等度洗脱），采用变波长检测；理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000，各检测目标峰与其各自相邻峰的分离度应符合要求。
检测需符合的要求：《中国药典》2010年版一部附录ⅥD。
表1
3.2对照品溶液的制备：精密称取五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮各对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含有70μg白花前胡甲素、18μg白花前胡乙素、7μg紫菀酮和5μg五味子醇甲的混合溶液，即得；
3.3供试品溶液的制备：取供试品除去包衣，研细，取细粉约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，温浸（40℃）1小时，超声10min后放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液；
3.4测定：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图并按外标法以峰面积计算，即得。供试品每1g含前胡以白花前胡甲素（C21H22O7）和白花前胡乙素（C24H26O7）计分别不得少于700μg/g和180μg/g、含五味子以五味子醇甲（C24H32O7）计不得少于38μg/g和含紫菀以紫菀酮（C30H50O）计不得少于60μg/g。
3.5测定结果：参见附图1-2，每克供试品含五味子醇甲71.3μg、白花前胡甲素1118.4μg、白花前胡乙素292.5μg、紫菀酮110.9μg。
实施例2
同时检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量方法，详述如下（3个洗脱梯度）：
1.实验样品及对照品
止咳宝片（广东台城制药股份有限公司生产，批号：20121102）；其他与实施例1相同
2.仪器
与实施例1相同
3.检测方法
3.1色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表2中的规定进行梯度洗脱（其中，梯度1为等度洗脱，梯度2为在洗脱过程中流动相A、B体积百分比由40%：60%等速连续变化到90%：10%的梯度洗脱，梯度3为等度洗脱），采用变波长检测；理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000，各检测目标峰与其各自相邻峰的分离度应符合要求。
检测需符合的要求：《中国药典》2010年版一部附录ⅥD。
表2
3.2对照品溶液的制备：精密称取五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮各对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含有65μg白花前胡甲素、14μg白花前胡乙素、5μg紫菀酮和3μg五味子醇甲的混合溶液，即得；
3.3供试品溶液的制备：取供试品除去包衣，研细，取细粉约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，温浸（40℃）1小时，超声10min后放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液；
3.4测定：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图并按外标法以峰面积计算，即得。供试品每1g含前胡以白花前胡甲素（C21H22O7）和白花前胡乙素（C24H26O7）计分别不得少于700μg/g和180μg/g、含五味子以五味子醇甲（C24H32O7）计不得少于38μg/g和含紫菀以紫菀酮（C30H50O）计不得少于60μg/g。
3.5测定结果每克供试品含五味子醇甲70.7μg、白花前胡甲素1125.7μg、白花前胡乙素299.0μg、紫菀酮112.8μg。
实施例3
同时检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量方法，详述如下（3个洗脱梯度）：
1.实验样品及对照品
止咳宝片（广东台城制药股份有限公司生产，批号：20121103）；其他与实施例1相同
2.仪器
与实施例1相同
3.检测方法
3.1色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表3中的规定进行梯度洗脱（其中，梯度1为等度洗脱，梯度2为在洗脱过程中流动相A、B体积百分比由65%：35%等速连续变化到100%：0%的梯度洗脱，梯度3为等度洗脱），采用变波长检测；理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000，各检测目标峰与其各自相邻峰的分离度应符合要求。
检测需符合的要求：《中国药典》2010年版一部附录ⅥD。
表3
3.2对照品溶液的制备：精密称取五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮各对照品适量，加甲醇溶解制成每1ml含有75μg白花前胡甲素、20μg白花前胡乙素、9μg紫菀酮和7μg五味子醇甲的混合溶液，即得；
3.3供试品溶液的制备：取供试品除去包衣，研细，取细粉约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，温浸（40℃）1小时，超声10min后放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液；
3.4测定：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图并按外标法以峰面积计算，即得。供试品每1g含前胡以白花前胡甲素（C21H22O7）和白花前胡乙素（C24H26O7）计分别不得少于700μg/g和180μg/g、含五味子以五味子醇甲（C24H32O7）计不得少于38μg/g和含紫菀以紫菀酮（C30H50O）计不得少于60μg/g。
3.5测定结果：每克供试品含五味子醇甲72.5μg、白花前胡甲素1137.7μg、白花前胡乙素300.1μg、紫菀酮114.4μg。
实施例4
同时检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量方法，详述如下（2个洗脱梯度）：
1.实验样品及对照品
与实施例1相同，且所用的止咳宝片与实施例1的为同一个批次。
2.仪器
与实施例1相同。
3.检测方法
3.1色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表4中的规定进行梯度洗脱（其中，梯度1为在洗脱过程中流动相A、B体积百分比由40%：60%等速连续变化到96%：4%的梯度洗脱，梯度2为等度洗脱），采用变波长检测；理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000，各检测目标峰与其各自相邻峰的分离度应符合要求。
检测需符合的要求：《中国药典》2010年版一部附录ⅥD。
表4
3.2对照品溶液的制备：与实施例1相同；
3.3供试品溶液的制备：与实施例1相同；
3.4测定：与实施例1相同。
3.5测定结果：参见附图3，每克供试品含五味子醇甲72.1μg、白花前胡甲素1123.5μg、白花前胡乙素296.8μg、紫菀酮107.5μg。
实施例5
同时检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量方法，详述如下（2个洗脱梯度）：
1.实验样品及对照品
与实施例2相同，所用的止咳宝片的批次也相同，为20121102。
2.仪器
与实施例1相同。
3.检测方法
3.1色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表5中的规定进行梯度洗脱（其中，梯度1为在洗脱过程中流动相A、B体积百分比由50%：50%等速连续变化到100%：0%的梯度洗脱，梯度2为等度洗脱），采用变波长检测；理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000，各检测目标峰与其各自相邻峰的分离度应符合要求。
检测需符合的要求：《中国药典》2010年版一部附录ⅥD。
表5
3.2对照品溶液的制备：与实施例2相同；
3.3供试品溶液的制备：与实施例2相同；
3.4测定：与实施例2相同。
3.5测定结果：参见附图4-5，每克供试品含五味子醇甲70.8μg、白花前胡甲素1126.8μg、白花前胡乙素298.3μg、紫菀酮113.6μg。
实施例6
同时检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量方法，详述如下（2个洗脱梯度）：
1.实验样品及对照品
与实施例3相同，所用的止咳宝片的批次也相同，为20121103。
2.仪器
与实施例1相同。
3.检测方法
3.1色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表6中的规定进行梯度洗脱（其中，梯度1为在洗脱过程中流动相A、B体积百分比由40%：60%等速连续变化到90%：10%的梯度洗脱，梯度2为等度洗脱），采用变波长检测；理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000，各检测目标峰与其各自相邻峰的分离度应符合要求。
检测需符合的要求：《中国药典》2010年版一部附录ⅥD。
表6
3.2对照品溶液的制备：与实施例3相同；
3.3供试品溶液的制备：与实施例3相同；
3.4测定：与实施例3相同。
3.5测定结果：参见图6-7，每克供试品含五味子醇甲72.3μg、白花前胡甲素1127.9μg、白花前胡乙素299.4μg、紫菀酮115.3μg。
实施例7
同时检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量方法，详述如下（2个洗脱梯度）：
4.实验样品及对照品
与实施例3相同，所用的止咳宝片的批次也相同，为20121103。
5.仪器
与实施例1相同。
6.检测方法
3.1色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表7中的规定进行梯度洗脱（其中，梯度1为在洗脱过程中流动相A、B体积百分比由50%：50%等速连续变化到100%：0%的梯度洗脱，梯度2为等度洗脱），采用变波长检测；理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000，各检测目标峰与其各自相邻峰的分离度应符合要求。
检测需符合的要求：《中国药典》2010年版一部附录ⅥD。
表7
3.2对照品溶液的制备：与实施例3相同；
3.3供试品溶液的制备：与实施例3相同；
3.4测定：与实施例3相同。
3.5测定结果：参见附图8-9，每克供试品含五味子醇甲72.6μg、白花前胡甲素1126.5μg、白花前胡乙素297.6μg、紫菀酮115.9μg。
实施例8本例对实施例1-7所采用的检测方法进行方法学验证
按《中国药典》2010年版一部“附录xⅧ中药质量标准分析方法验证指导原则”的要求进行方法学验证试验。
实验样品及对照品：止咳宝片（广东台城制药股份有限公司生产）；止咳宝片紫菀阴性制剂（广东台城制药股份有限公司生产）；止咳宝片五味子阴性制剂（广东台城制药股份有限公司生产）；止咳宝片前胡阴性制剂（广东台城制药股份有限公司生产）；白花前胡甲素对照品（批号：111711-200602，中国药品生物制品检定所提供）；白花前胡乙素对照品（批号：111904-201102，中国药品生物制品检定所提供）；紫菀酮对照品（批号：111581-200604，中国药品生物制品检定所提供）；五味子醇甲对照品（批号：110857-201010，中国药品生物制品检定所提供）；
仪器：高效液相色谱仪Agilent1260Infinity，G1315D。色谱柱：资生堂C18（4.6×250mm，5μm，柱号：AKAD08072），十万分之一级电子天平（型号：9ZSM-202A），超声仪（广州市科普超声电子技术有限公司，型号：KP-Q600）。
1.回收率试验
回收率试验对照品贮备液的制备：分别精密称取白花前胡乙素对照品41.84mg、紫菀酮对照品12.67mg和五味子醇甲对照品8.53mg，将它们置同一25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为A对照品混合液；另精密称取白花前胡甲素对照品20.56mg、精密吸取3ml A对照品混合液，置50ml容量瓶中，加适量甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为回收率试验对照品贮备液。
回收率试验供试品溶液的制备：取已知含量的20121001批次的止咳宝片（已测得含量：五味子醇甲63.7μg/g、白花前胡甲素1148.8μg/g、白花前胡乙素314.2μg/g、紫菀酮98.6μg/g）除去包衣后研细，精密称取细粉约0.6g共6份，分别置于6个具塞锥形瓶中，各精密加入回收率试验对照品贮备液2ml和甲醇23ml，称定重量，温浸（40℃）1小时，超声10min后放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液作为回收率试验供试品溶液，依实施例1～7的测定条件进行测定，所得回收率平均值均达97%以上，RSD均小于2.2%。下面将采用实施例1的测定方法测得的回收率试验结果作为代表示出于下表8：
表8回收率试验结果
从回收率的试验结果可知，采用本发明提供的检测方法具有很好的准确度。
2.精密度试验
2.1重复性试验
取20121001批止咳宝片适量，除去包衣后研细，精密称取细粉约2.0g共6份，分别按照实施例1的方法制成供试品溶液；另精密称取五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮各对照品适量，按照实施例1的方法制成对照品溶液，按实施例1-7的测定条件进行测定。结果发现，采用实施例1-7的测定条件所得结果相似，且测定结果均具有很好的重现性，RSD值均小于2%。下表9示出了采用实施例1的测定条件测得的重复性试验结果。
表9重复性试验结果
2.2中间精密度试验
取20121001批止咳宝片，由甲、乙、丙三人分别于不同日期、不同设备，每人均按精密度试验中的“2.1重复性试验”项下的方法各制备3份供试品溶液，按实施例1-7的含量测定条件进行测定，下表10示出了采用实施例1的含量测定方法测得的中间精密度试验结果。（采用实施例2-7的含量测定方法的中间精密度测定结果与实施例1的相似，在此不再赘述）
表10中间精密度试验结果
由中间精密度试验结果可知，本发明的含量测定方法具有重现性好的特点。
2.3稳定性试验
按照实施例1的方法制备供试品溶液和对照品溶液各1份，放置0、4、8、12、18、24小时时，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照实施例1-7的含量测定条件进行测定，结果发现供试品溶液和对照品溶液在24小时内基本稳定，下面将采用实施例1的测定方法测得的稳定性试验结果示于下表11。
表11稳定性试验结果
由稳定性试验结果可知，本发明的测定方法在24小时内峰面积的测得值比较稳定，稳定性很好。
3.专属性试验
按照实施例1的方法制备对照品溶液、供试品溶液，参照实施例1中对照品溶液的配制方法配制止咳宝片缺紫菀、五味子、前胡各阴性制剂的阴性样品溶液，精密量取上述溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，按实施例1-7的含量测定条件测定。
结果显示，各阴性样品溶液色谱图在对照品溶液色谱图各组分相应的位置上基本无干扰（均小于5%）。供试品溶液色谱图中，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000，各检测目标峰与其各自相邻峰的分离度均大于1.5，符合《中国药典》2010年版一部附录的含量测定相关要求。下表12示出的是采用实施例1的测定方法所得的专属性实验结果。采用实施例2-7的测定方法测得的专属性实验结果与之相似。
表12专属性试验结果
4.线性试验
精密量取实施例8中“1.回收率试验”项下制备的对照品贮备液0.5ml、1ml、2ml、5ml、7ml、10ml，分别置于6个25ml容量瓶中并加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得用于线性考察的各浓度对照品溶液；
精密量取上述溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，按照实施例1的测定条件记录色谱图。结果显示（见表13）五味子醇甲在浓度0.409μg/ml～8.188μg/ml的范围内与其峰面积呈良好的线性关系，白花前胡甲素在浓度8.224μg/ml～164.48μg/ml的范围内与其峰面积呈良好的线性关系，白花前胡乙素在浓度2.008μg/ml～40.168μg/ml的范围内与其峰面积呈良好的线性关系，紫菀酮在浓度0.608μg/ml～12.164μg/ml的范围内与其峰面积呈良好的线性关系。采用实施例2-7的测定条件所得的结果基本与采用实施例1测定条件所得结果相似，在此不再赘述。
表13线性试验结果
5.测定范围的准确度试验
根据各合格药材含量限度和各药材有效成分的提取转移率以及本品稳定性考察结果，进行综合分析后，确定本品含量限度为每1g止咳宝片供试品含五味子以五味子醇甲（C24H32O7）计不得少于38μg/g、含前胡以白花前胡甲素（C21H22O7）和白花前胡乙素（C24H26O7）计分别不得少于700μg/g和180μg/g、含紫菀以紫菀酮（C30H50O）计不得少于60μg/g，取上述各成分限度的50％（五味子醇甲19μg/g、白花前胡甲素350μg/g、白花前胡乙素90μg/g、紫菀酮30μg/g）和250％（白花前胡甲素1750μg/g、白花前胡乙素450μg/g、五味子醇甲95μg/g、紫菀酮150μg/g）考察测定范围的准确度。
限度50％供试品溶液制备：取20121001批止咳宝片适量，除去包衣后研细，取细粉约0.3g6份，精密称定，每份均加实施例8中的“1.回收率试验”项下制备的对照品贮备液各1ml，之后按实施例1的供试品溶液的制备方法制备，按照实施例1-7的测定条件测定各成分含量，计算回收率。下表14示出了按照实施例1的测定条件测得的结果，按照实施例2-7的测定条件所测得的结果基本与实施例1的相同。
限度250％供试品：取20121001批止咳宝片适量，除去包衣后研细，取细粉约1.5g6份，精密称定，每份均加实施例8中的“1.回收率试验”项下制备的对照品贮备液各5ml，按实施例1的供试品溶液的制备方法制备，按照实施例1-7的测定条件测定各成分含量，计算回收率。下表15示出了按照实施例1的测定条件测得的结果，按照实施例2-7的测定条件所测得的结果基本与实施例1的相同。
表14低浓度范围（按限度50％）：
表15高浓度范围（按限度250％）：
由测定范围的准确度试验的结果可知，在止咳宝片中的各成分限度的50％-250%的范围内，测定结果稳定可靠，准确度高。
通过以上方法学验证的结果可知，采用本发明的检测方法，不仅可以同时检测止咳宝片中的四种有效成分的含量，且该检测方法准确度、重复性和精密度均良好，在测定范围内线性关系良好，24小时内供试品溶液和对照品均基本稳定。方法学验证试验结果显示本法可以作为止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮含量的测定方法。定量测出含量的同时又可以定性，可有效的对止咳宝片处方中紫菀、前胡和五味子3个药味进行鉴别。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (8)
1.一种同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，所述四种有效成分分别是五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）确定色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，采用由乙腈为流动相A、水为流动相B组成的洗脱液进行梯度洗脱，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000，梯度洗脱的程序及流动相A、B的体积百分比如下：
梯度1---0~20min，流动相A：B=40~65%：60~35%，A+B=100%，流速为1.0ml/min，检测波长为245~255nm；
梯度2----20~35min，流动相A：B=〔(40~65%)→(90~100%)〕：〔(60~35%)→(10~0%)〕，A+B=100%，流速为1.0ml/min，检测波长为220~235nm；
梯度3---流动相A：B=90~100%：10~0%，A+B=100%，流速为1.0~1.3ml/min，检测波长为195~205nm；
（2）制备对照品溶液；
（3）制备供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取适量对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，并按外标法以峰面积计算，即得检测结果。
2.一种同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，所述四种有效成分分别是五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）确定色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，采用由乙腈为流动相A、水为流动相B组成的洗脱液进行梯度洗脱，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000，梯度洗脱的程序及流动相A、B的体积百分比如下：
梯度1-----0~35min，流动相A：B=〔(40~50%)→(90~100%)〕：〔(60~50%)→(10~0%)〕，A+B=100%，流速为1.0~1.2ml/min，检测波长为220~265nm；
梯度2-----流动相A：B=90~100%：10~0%，A+B=100%，流速为1.0~1.3ml/min，检测波长为195~205nm；
（2）制备对照品溶液；
（3）制备供试品溶液；
（4）测定：分别精密量取适量对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，并按外标法以峰面积计算，即得检测结果。
3.根据权利要求1或2所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，其特征在于，制备供试品溶液时，将供试品细粉置于具塞锥形瓶中，加入甲醇，称定总重量，于40℃温浸1小时后，超声10min，然后放至室温，并再称定总重量，用甲醇补足损失的重量，摇匀并过滤，取续滤液作为供试品溶液。
4.根据权利要求1或2所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，其特征在于，制备对照品溶液时，精密称取五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮对照品，用甲醇溶解并配制成对照品溶液，使每1ml对照品溶液中含有3-7μg五味子醇甲、60-75μg白花前胡甲素、14-20μg白花前胡乙素、5-9μg紫菀酮。
5.根据权利要求4所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，其特征在于，制备对照品溶液时，每1ml对照品溶液中含有5μg五味子醇甲、70μg白花前胡甲素、18μg白花前胡乙素、7μg紫菀酮。
6.根据权利要求1或2所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，其特征在于，当连续进样检测时，追加洗脱时长为5分钟的洗脱梯度，该追加的洗脱梯度将流动相A、B的体积百分比变换为梯度1洗脱时的流动相A、B体积百分比的起始比例，并将检测波长变换到梯度1的起始检测波长。
7.根据权利要求2所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，其特征在于，步骤（1）中梯度洗脱的程序及流动相A、B的体积百分比如下：
梯度1----0~35min，流动相A：B=40%→96%：60%→4%，A+B=100%，流速为1.0ml/min，检测波长为250nm，当洗脱15分钟时波长变换为228nm，
梯度2----流动相A：B=96%：4%，A+B=100%，流速为1.2ml/min，检测波长为200nm。
8.根据权利要求2所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，其特征在于，所述步骤（1）中梯度洗脱的程序及流动相A、B的体积百分比如下：
梯度1----0~30min，流动相A：B=50%→100%：50%→0%，A+B=100%，流速为1.0ml/min，检测波长为228nm，
梯度2----流动相A：B=100%：0%，A+B=100%，流速为1.2ml/min，检测波长为200nm。
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| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 529200 Taishan, Guangdong, North pit Industrial Park Patentee after: Special pharmaceutical group Limited by Share Ltd Address before: 529200 Guangdong city of Jiangmen province Taishan City Industrial Park, Changxin Road No. 9 pit Patentee before: Guangdong Taicheng Pharmaceutical Co., Ltd. |
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| CP02 | Change in the address of a patent holder | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: 529200 9 and 11 Changxin Road, Taicheng, Jiangmen, Guangdong, Taishan Patentee after: Special pharmaceutical group Limited by Share Ltd Address before: 529200 Taishan North pit Industrial Park, Jiangmen, Guangdong Patentee before: Special pharmaceutical group Limited by Share Ltd |