CN114720614B - 一种hplc-cad法检测积雪草苷-b和/或羟基积雪草苷含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HPLC‑CAD法检测积雪草苷‑B和/或羟基积雪草苷含量的方法，包括：(1)制备积雪草苷‑B和/或羟基积雪草苷的对照品溶液；(2)供试品溶液制备：取积雪草药材、积雪草药材提取物或含积雪草的成药制剂，制成供试品溶液；(3)采用HPLC‑CAD法，检测对照品和供试品中积雪草苷‑B和/或羟基积雪草苷的含量，其中，采用的色谱柱以三十烷基硅烷键合硅胶作为填充剂。本发明采用HPLC‑CAD法，色谱柱以三十烷基硅烷键合硅胶为填料，使用成分简单的流动相即可实现互为同分异构体的两成分有效分离并准确评价样品中积雪草苷‑B和羟基积雪草苷含量，简便、灵敏、准确度高，可用于建立三金制剂的质量控制标准。

Description

一种HPLC-CAD法检测积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷含量的 方法

技术领域

本发明属于中药制剂领域，具体地说，涉及一种HPLC-CAD法检测积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷含量的方法。

背景技术

积雪草为伞形科Centella asiatica(L.)Urb.的干燥全草，积雪草以全草入药，性寒、味苦、辛，具清热利湿、解毒消肿的功效，临床上用于湿热黄疸、痈疮肿毒、跌打损伤、解砒霜中毒、铅中毒、解暑、传染性肝炎、流行性脑脊髓膜炎等，还具有消炎、增强记忆力、促进胶原蛋白合成和抗癌等多种生理活性。

目前认为，三萜皂苷类物质是积雪草的活性成分，主要包括积雪草苷(Asiaticoside)、羟基积雪草苷(Madecassoside)、以及积雪草苷-B(Asiaticoside–B)三种皂苷化合物及其苷元，其结构式如下所示，由于积雪草苷-B与羟基积雪草苷互为同分异构体，两者分离难度大，既导致分离制备大量高纯度的对照品难度较大，也导致准确分离测定药材和制剂各个具体药效成分含量难度较大。

例如，三金制剂由积雪草、金樱根、金沙藤等5味中药组成，具有清热解毒，利湿通淋，益肾功效，临床用于治疗急、慢性肾盂肾炎，膀胱炎、尿路感染及慢性非细菌性前列腺炎，具有良好效果，成长为泌尿领域中药大品种。自《中国药典》2000年版收载以来，三金制剂的质量标准不断提升完善，现行药典标准【含量测定】采用HPLC-ELSD法测定处方药味积雪草的主要药效成分羟基积雪草苷含量。但随着研究的进展发现，采用HPLC-ELSD法检测的羟基积雪草苷实际混杂有难以分离的同分异构体积雪草苷-B，不能真实的反应制剂的质量属性。

对于积雪草总苷中有关成分的HPLC含量测定已有相关报道，均是在一般的HPLC条件下进行测定，而一般的甲醇-水或乙腈-水系统的流动相均无法有效分离羟基积雪草苷与其同分异构体积雪草苷B。现有文献中也有在流动相添加β-环糊精，以提高分离度的方法，但β-环糊精流动相具有显著缺陷，容易导致柱压异常升高及污染色谱柱。

为了控制好积雪草药材及其提取物与制剂的临床安全性，有必要在现有技术的基础上研究设计出条件简单、易于实现、能够有效分离羟基积雪草苷与其同分异构体积雪草苷B的检测方法。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种HPLC-CAD法检测积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷含量的方法。本发明采用HPLC-CAD法，色谱柱以三十烷基硅烷键合硅胶为填料，使用成分简单的流动相即可实现有效分离并准确评价样品中积雪草苷-B和羟基积雪草苷含量，简便、灵敏、准确度高，可用于建立三金制剂的质量控制标准。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种HPLC-CAD法检测积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷含量的方法，包括如下步骤：

(1)制备积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷的对照品溶液，

(2)供试品溶液制备：取积雪草药材、积雪草药材提取物或含积雪草的成药制剂，制成供试品溶液；

(3)采用HPLC-CAD法，检测对照品和供试品中积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷的含量，其中，采用的色谱柱以三十烷基硅烷键合硅胶作为填料。

积雪草药材、积雪草药材提取物或积雪草制剂中羟基积雪草苷常作为药材或制剂的质量指标。而由于积雪草苷-B为羟基积雪草苷的同分异构体，两者分离难度大，既导致分离制备大量高纯度的对照品难度较大，也导致准确分离测定药材和制剂各个具体药效成分含量难度较大。

本发明采用HPLC-CAD法，经过大量实验摸索，发现采用以三十烷基硅烷键合硅胶作为填料的C30色谱柱，使用成分简单的流动相即可实现有效分离并准确评价样品中积雪草苷-B和羟基积雪草苷含量，简便、灵敏、准确度高。C30色谱柱一般用于检测叶黄素、胡萝卜素、维生素A、维生素E等，没有用于检测皂苷类的报道。

进一步的方案，所用色谱柱包括YMC C30色谱柱，赛默飞C30色谱柱，月旭C30色谱柱；

所用色谱柱为Thermo Acclaim ^TM C30柱，以三十烷基硅烷键合硅胶作为填料，长度为250×4.6mm，粒径5μm。

进一步的方案，HPLC检测时，采用甲醇-乙腈-水的混合液为流动相，所述甲醇、乙腈和水的体积比为(31-40):(7-9):(51-62)；

优选的，所述甲醇、乙腈和水的体积比为35:8:57。

三金制剂是一种含积雪草的药物制剂，例如三金片，为现版药典收载品种，药典中【含量测定】项以羟基积雪草苷测定指标。但通过分析发现，目前采用C18色谱柱其实测定的为积雪草苷-B和羟基积雪草苷的混合含量，未能将二者有效分离，不能真实反映制剂中羟基积雪草苷的含量。文献也有在流动相添加β-CD，以提高分离度的方法，但β-CD流动相具有显著缺陷，即容易导致柱压异常升高及污染色谱柱。本文通过系列筛选采用C30色谱柱，可以采用简单的流动相，即可实现有效分离并准确评价样品中积雪草苷-B和羟基积雪草苷含量，可用于建立三金制剂的质量控制标准。

进一步的方案，HPLC检测时，采用的柱温为30-40℃；

优选的，所述柱温为35℃。

进一步的方案，CAD电喷雾检测的条件包括：气化温度为50℃，采集频率为10Hz。

电喷雾检测器(CAD)具有灵敏性高的特点，适用于紫外吸收较弱的成分检测，较常用测定此类成分的蒸发光散射检测器灵敏度显著提高，较采用紫外进行检测器检测未端吸收成分基线干扰少，可以为此类含量偏低的中药复杂成分的定量检验提供了更好的选择。

进一步的方案，步骤(1)中，对照品的制备方法包括：精密称取干燥至恒重的积雪草苷-B和羟基积雪草苷对照品适量，加甲醇溶解并分别稀释至25ml和10ml，配置成的浓度分别为1.228mg/ml和3.135mg/ml的混合对照品溶液，按5、10、20、25、50倍稀释配置上述两成分的混合标准品溶液。

进一步的方案，步骤(2)中，供试品溶液的制备方法包括：取积雪草药材、积雪草药材提取物或积雪草制剂1.0g，精密称定，精密加入甲醇50ml-100ml，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液25ml回收溶剂至干，残渣加流动相至刻度，摇匀，即得。

进一步的方案，超声处理30-60分钟，优选处理45分钟。

进一步的方案，超声处理的条件包括：功率250W，频率40kHz。

三金制剂的成分复杂，特别是极性较大部位成分较为集中，给积雪草苷-B和羟基积雪草苷含量测定用供试品溶液的制备方法造成一定困难。现有的纯化方法一般采用甲醇提取液，蒸干后经水返溶，再经正丁醇提取纯化，再蒸干，定容，操作繁琐且误差较大。本发明中样品经甲醇超声处理得到提取液，蒸干后直接采用流动相(甲醇-乙腈-水混合溶剂)进行待测样品沉淀除杂纯化，能有效富集目标成分，具有效果好，经济环保，简单快捷特点。

进一步的方案，根据上述的一种HPLC-CAD法检测积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷含量的方法，该方法用于检测以积雪草为原料的制剂、积雪草药材以及积雪草药材提取物；

优选的，以积雪草为原料的制剂包括三金制剂。

所述的制剂选自：片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。

采用本发明的检测方法，积雪草苷-B和羟基积雪草苷在设定进样量范围内有良好的线性关系，线性范围分别为0.240688～2.406880μg(r＝0.9998)、0.573078～5.730780μg(r＝0.9984)，积雪草苷-B的平均加样回收率为100.26％，RSD为0.69％，羟基积雪草苷的平均加样回收率为98.32％，RSD为1.78％。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果。

1、本发明采用HPLC-CAD法检测积雪草苷-B和羟基积雪草苷的含量，采用的色谱柱以键合三十烷基硅胶为填料，使用成分简单的流动相即可实现有效分离并准确评价样品中积雪草苷-B和羟基积雪草苷含量，简便、灵敏、准确度高，可用于建立三金制剂的质量控制标准。

2、本发明供试样品溶液制备时，经甲醇超声处理得到提取液，蒸干后直接采用流动相(甲醇-乙腈-水混合溶剂)进行待测样品沉淀除杂纯化，能有效富集目标成分，具有效果好，经济环保，简单快捷特点。

3、采用本发明的检测方法，积雪草苷-B和羟基积雪草苷在设定进样量范围内有良好的线性关系，线性范围分别为0.240688～2.406880μg(r＝0.9998)、0.573078～5.730780μg(r＝0.9984)，积雪草苷-B的平均加样回收率为100.26％，RSD为0.69％，羟基积雪草苷的平均加样回收率为98.32％，RSD为1.78％。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1是本发明积雪草苷-B纯度检测色谱图；

图2是本发明实施例1的对照品溶液和供试品溶液的色谱图；其中，峰1-积雪草苷-B；峰2-羟基积雪草苷；a：三金片样品；b：混合标准品；c：流动相空白；

图3是本发明实施例3中积雪草苷-B的线性关系曲线图；

图4是本发明实施例3中羟基积雪草苷线性关系曲线图；

图5是本发明实施例4中采用不同品牌色谱柱进行检测的色谱图，其中，峰1-积雪草苷-B；峰2-羟基积雪草苷；a：赛默飞世C30色谱柱；b：YMC C30色谱柱；c：月旭C30色谱柱。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

1、仪器：Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪(配三元泵和紫外检测器，美国赛默飞世尔科技公司)，Corona Veo电喷雾检测器；沃特世e2695高效液相色谱仪(配三元泵和紫外检测器，美国沃特世公司)，蒸发光散射检测器(Alltech-ELSD 6000)。

对照品来源及纯度

2、药品与试剂

(1)羟基积雪草苷(中国食品药品检定院，批号：110893-201403，纯度：91.4％)；

(2)积雪草苷-B为自制，并按《中药新药质量标准研究用对照品研究技术要求》进行了结构确证和纯度检查。

精密称取干燥至恒重的积雪草苷-B对照品适量，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含1mg的积雪草苷-B对照品溶液，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，连续测定3次，用归一化法计算平均含量为98.0％，符合定量用对照品纯度要求，纯度检查结果见表1，色谱图如图1所示。

表1积雪草苷-B对照品纯度检查

(3)三金片由桂林三金股份有限公司提供，其批号如下表2所示。

表2不同批次三金片样品

(4)流动相甲醇和乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

实施例一

(1)对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的积雪草苷-B和羟基积雪草苷对照品适量，加甲醇溶解并分别稀释至25ml和10ml，配置成的浓度分别为1.228mg/ml和3.135mg/ml的混合对照品溶液，按5、10、20、25、50倍稀释配置上述两成分的混合标准品溶液。分别精密吸取混合标准品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。

(2)供试品溶液制备：

取三金片30片(小片)或20片(大片)，研细，取约1.0g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理45分钟，超声的条件为：功率250W，频率40kHz；放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml回收溶剂至干，残渣加流动相至刻度，摇匀，即得。所述流动相为甲醇-乙腈-水混合溶液，甲醇：乙腈：水的体积比为35:8:57。

(3)采用HPLC-CAD法，检测对照品和供试品中积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷的含量，条件为：

色谱柱：Thermo Acclaim TM C30柱，以三十烷基硅烷键合硅胶作为填料，长度为250×4.6mm，粒径5μm；

色谱柱温度：35℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：10ul；

流动相：甲醇-乙腈-水，体积比为35:8:57；

电喷雾检测器(Corona Veo)，气化温度：50℃。

(4)根据供试样品中积雪草苷-B和羟基积雪草苷的峰面积、积雪草苷-B和羟基积雪草苷对照品的回归方程，计算积雪草苷-B和羟基积雪草苷的含量。

结果：本实施例的对照品溶液和供试品溶液的色谱图如图2所示，其中，峰1-积雪草苷-B；峰2-羟基积雪草苷；a：三金片样品；b：混合标准品；c：流动相空白。从图中可以看出，采用本实施例的方法，能够很好地分离积雪草苷-B和羟基积雪草苷，有利于准确测量羟基积雪草苷的含量，可用于建立三金片制剂的质量控制标准。

实施例2供试样品处理条件的优化

(1)比较不同提取方法、提取时间制备的供试品溶液中积雪草苷-B和羟基积雪草苷的含量。

以超声提取45min和加热回流提取2h两种作为提取方法的比较，另外，还比较超声提取30min、45min、60min三种提取时间，结果见表3。

表3提取方法、提取时间选择的测定结果

结果说明：超声提取30min和加热回流提取2h没有显著性差异，为操作方便，故选用超声提取作为提取方法，且需要45min可将羟基积雪草苷提取完全，故超声提取时间定为45min。

(2)提取溶剂的选择

参照实施例1中供试品溶液的制备方法，比较甲醇、无水乙醇、95％乙醇三种提取溶剂进行提取后的检测效果，结果见表4。

表4提取溶剂选择的测定结果

结果说明：甲醇提取更完全，故选用甲醇作为提取溶剂。

(3)提取溶剂用量的选择

参照实施例1中供试品溶液制备方法，分别比较50ml，100ml甲醇溶剂用量，结果如表5所示。

表5提取溶剂用量选择的测定结果

结果表明：使用两种不同量的溶剂提取，目标成分含量相差不大，故提取溶剂用量定为50ml。

综上所述，本发明采用的供试品溶液处理方法具体为：取三金片30片(小片)或20片(大片)，除去包衣，研细，取约1.0g，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml回收溶剂至干，残渣加流动相至刻度，摇匀，即得。

实施例3方法学验证

(1)线性

精密称取干燥至恒重的积雪草苷-B和羟基积雪草苷对照品适量，加甲醇溶解并分别稀释至25ml和10ml，配置成的浓度分别为1.228mg/ml和3.135mg/ml的混合对照品溶液，按5、10、20、25、50倍稀释配置上述两成分的混合标准品溶液。分别精密吸取混合标准品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。以各对照品的量为横坐标(X)，对照品的峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算回归方程，积雪草苷-B为：Y＝33.6543X-0.0340r＝0.9993；羟基积雪草苷为：Y＝30.6748X+0.7686r＝0.9984，上述试验结果见表6。工作曲线图见图3和图4。

表6线性测定结果

结果表明，积雪草苷-B在进样量0.240688～2.406880μg和羟基积雪草苷在进样量0.573078～5.730780μg范围内线性良好。

(2)仪器精密度试验

取三金片(批号：181208)，按实施例1中方法制备供试品溶液，进样10μl，连续进样6次，计算羟基积雪草苷的含量。结果样品6次测定结果的平均值为0.126mg/g，RSD为2.90％(n＝6)，详见表7。

表7精密度试验结果

试验结果表明，仪器的精密度较好。

(3)重现性试验

取同一批号三金片样品(批号：181208)，平行制备6份供试品溶液，分别测定积雪草苷-B和羟基积雪草苷含量，测定结果见表8。

表8重现性试验结果

试验结果表明，方法重现性较好。

(4)加样回收试验

平行取6份与重现性试验同一批号样品，各约0.5g，精密称定，分别精密加入积雪草苷-B对照品溶液0.6ml和羟基积雪草苷0.7ml，按实施例1的样品制备方法和色谱条件，制备加样回收供试品溶液并注入液相色谱仪，以下列公式计算回收率，结果见表9。

表9加样回收试验结果

试验结果表明：回收率在95％～105％之间，加样回收良好。

实施例4耐用性试验

(1)供试品稳定性考察试验

取供试品溶液(批号：181208)，分别于0、3、6、9、12、24、48小时的时间间隔，分别进样10μl，计算积雪草苷-B和羟基积雪草苷含量，结果见表10。

表10稳定性试验结果

以上结果说明：供试液在48小时内测定，结果较稳定。

(2)流速变化考察

取同一批号三金片样品(批号：181208)，2份，按实施例1中的含量测定方法，制备供试品溶液，用不同流速条件下测定积雪草苷-B和羟基积雪草苷含量。结果与重现性结果进行比较，两者无显著性差异，说明流速微小变化不会影响方法的有效性。结果见表11。

表11不同流速试验测定结果

(3)柱温变化考察

取同一批号三金片样品(批号：181208)，2份，按实施例1中的含量测定方法，制备供试品溶液，在不同柱温条件下测定积雪草苷-B和羟基积雪草苷含量。结果与重现性结果进行比较，两者无显著性差异，说明柱温较小范围内变化不会影响方法的有效性。结果见表12。

表12不同柱温试验测定结果

(4)流动相组成比例考察

取同一批号三金片样品(批号：181208)，2份，按实施例1中的含量测定方法，制备供试品溶液，流动相中各成分的体积比例微小变化，测定积雪草苷-B和羟基积雪草苷含量。结果与重现性结果进行比较，两者无显著性差异，说明流动相组成比例有微小波动不会影响方法的有效性。结果见表13。

表13流动相比例波动试验测定结果

(5)不同厂牌色谱柱考察

取同一批号三金片样品(批号：181208)，2份，按实施例1的含量测定方法，制备供试品溶液，分别用waters和依利特色谱柱测定积雪草苷-B和羟基积雪草苷含量。结果与重现性结果进行比较，两者无显著性差异，说明本方法对不同的色谱柱有效性。结果见表14，色谱如图5所示。

表14不同色谱柱试验测定结果

实施例5

按实施例1的含量测定方法，分别测定了10批三金片中积雪草苷-B和羟基积雪草苷的含量，具体结果见表15。

表15十批三金片样品含量测定结果

上述检测结果表明，三金片中两指标成分较稳定，低含量批次与高含量批次范围在2倍以内。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (9)

1.一种HPLC-CAD法检测积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷的对照品溶液；精密称取干燥至恒重的积雪草苷-B和羟基积雪草苷对照品适量，加甲醇溶解并分别稀释至25ml和10ml，配置成的浓度分别为1 .228mg/ml和3 .135mg/ml的混合对照品溶液，按5、10、20、25、50倍稀释配置上述两成分的混合标准品溶液；

(2)供试品溶液制备：取积雪草药材、积雪草药材提取物或含积雪草的成药制剂，制成供试品溶液；取积雪草药材、积雪草药材提取物或积雪草制剂1 .0g，加入甲醇50ml-100ml，称定重量，超声处理30-60分钟，功率为250W，频率为40kHz，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液25ml回收溶剂至干，残渣加流动相至刻度，摇匀，即得；

(3)采用HPLC-CAD法，检测对照品和供试品中积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷的含量，其中，采用的色谱柱以三十烷基硅烷键合硅胶作为填料；CAD电喷雾检测的条件包括：气化温度为50℃，采集频率为10Hz；

采用甲醇-乙腈-水的混合液为流动相，所述甲醇、乙腈和水的体积比为(31-40):(7-9):(51-62)；

积雪草苷-B进样量为0.240688～2.406880μg，羟基积雪草苷在进样量为0.573078～5.730780μg。

2.根据权利要求1所述的一种HPLC-CAD法检测积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷含量的方法，其特征在于，所用色谱柱包括YMC C30色谱柱，赛默飞C30色谱柱，月旭C30色谱柱。

3.根据权利要求1所述的一种HPLC-CAD法检测积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷含量的方法，其特征在于，色谱柱为Thermo Acclaim TM C30柱，以三十烷基硅烷键合硅胶作为填料，长度为250×4 .6mm，粒径5μm。

4.根据权利要求1或2所述的一种HPLC-CAD法检测积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷含量的方法，其特征在于，HPLC检测时，采用甲醇-乙腈-水的混合液为流动相，所述甲醇、乙腈和水的体积比为35:8:57。

5.根据权利要求1-3任意一项所述的一种HPLC-CAD法检测积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷含量的方法，其特征在于，HPLC检测时，采用的柱温为30-40℃。

6.根据权利要求5所述的一种HPLC-CAD法检测积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷含量的方法，其特征在于，所述柱温为35℃。

7.根据权利要求1所述的一种HPLC-CAD法检测积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷含量的方法，其特征在于，超声处理45分钟。

8.根据权利要求1-7任意一项所述的一种HPLC-CAD法检测积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷含量的方法，该方法用于检测以积雪草为原料的制剂、积雪草药材以及积雪草药材提取物。

9.根据权利要求8所述的一种HPLC-CAD法检测积雪草苷-B和/或羟基积雪草苷含量的方法，以积雪草为原料的制剂包括三金制剂。