CN111896637A - 一种金青中间体的检测方法及其指纹图谱构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金青中间体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：取金青中间体供试品和对照品进行检测，该检测的色谱条件包括：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：B相：乙腈：甲醇(3:97)；A相：0.1％H3PO4。本发明建立的热毒宁注射液金青中间体UPLC含量测定和指纹图谱分析方法，快速，便捷，准确，且具有良好的精密度、稳定性和重复性，能够准确检测热毒宁注射液金青中间体的成分含量，获得的指纹图谱能够客观评估样品的质量。

Description

一种金青中间体的检测方法及其指纹图谱构建方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，特别涉及一种金青中间体的检测方 法及其指纹图谱构建方法。
背景技术
千百年来，医药一直在保障和提高国人身体健康素质方面发挥着不 可替代的作用。药与医相辅相成，医在乎临床疗效，药则关注品质，合 格的“药”是临床疗效的前提、基础。为了保证药物临床疗效，确保制 剂品质，往往需追溯至制剂生产的源头和中间过程，对从而对中药材或 其中间体进行质量进行控制。
热毒宁注射液是由青蒿、金银花和栀子3味药材制成的纯中药注射 剂，处方中青蒿为君药，具有清热凉血，透散肌表、阴分风热邪毒及入 里热邪之作用。金银花为臣药，擅长清热解毒，兼可透散表邪，助君药 青蒿以增强其清热及透散之功；栀子为佐药，有清热解毒、凉血及清泄 心、肺、胃、三焦之火热而除烦的功用，助臣药金银花清热解毒。三者 合用，则能使风热之邪从表透解，热毒邪气从内清泄，达到共奏清热解 毒、疏风解表之功。
金青中间体即为热毒宁注射液生产的最重要的中间体之一，如何更 有效的对其进行检测和质量监控，对终产品的质量有着直接的影响。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提供金青中间体中多个成分的UPLC一测多 评含量测定方法，提高产品的质量控制水平。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种金青中间体的检测方法，包括如下步骤：取金青中间体供试品 和对照品进行检测，该检测的色谱条件包括：
十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：B相：乙腈：甲醇(3:97)； A相：0.1％H3PO4；梯度洗脱如下：
Figure BDA0002526701140000021
根据检测结果，获得金青中间体的成分信息，或成分及其含量信息。
具体地，所述供试品的制备为，精密称取金青干膏0.06g，置于25 ml量瓶中，精密加入纯水15ml，超声处理60min，放冷，用乙腈定容 至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，作为供试品溶液。 该金青干膏制备方法可选地如下：金银花、青蒿加13-18倍量水浸泡3 小时，加热煎煮蒸馏2次，每次2小时，同时收集挥发油，备用。合并 煎煮液，减压浓缩至相对密度为1.03-1.08，高速离心(20000转/min) 取上清液，分级超滤，超滤液减压浓缩至50℃相对密度为1.10-1.12， 真空干燥，得金银花、青蒿干膏粉。
进一步地，所述色谱条件还包括：检测波长：218-225nm、 320-330nm；流速：0.28-0.32ml/min；柱温：25℃-35℃。
进一步地，所述色谱条件包括：色谱柱：Agilent Eclipise Plus C18 (2.1mm×50mm，1.8μm)；流动相：B相：乙腈：甲醇(3:97)；A相： 0.1％H3PO4。
可选地，所述色谱柱选自Waters Xbridge BEH C18(2.1mm×50mm， 1.7μm)。
进一步地，所述色谱条件还包括：流速：0.3ml/min；柱温：30℃， 检测波长：237nm、324nm(环烯醚萜苷类成分检测波长为237nm，有 机酸类成分检测波长为324nm)。
具体地，所述对照品选自7-羟基獐牙菜苷、断氧化马钱子苷、新 绿原酸、咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿 原酸C和总环烯醚萜苷的一种或多种。
本发明还提出一种金青中间体的指纹图谱构建方法，该方法包括：
供试品溶液的制备：金青干膏0.06g，置于25ml量瓶中，精密加 入纯水15ml，超声处理60min，放置1小时，用乙腈定容至刻度，摇 匀，12000r/min离心10min，取上清液，作为供试品溶液；
对所述供试品溶液进行UPLC检测，其中，所述UPLC检测色谱条 件包括：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：B相：乙腈：甲醇 (3:97)；A相：0.1％H3PO4；梯度洗脱如下：
Figure BDA0002526701140000031
根据UPLC检测结果，获得金青中间体指纹图谱。
进一步地，所述色谱条件还包括：流速：0.28-0.32ml/min，检测波 长：218-225nm，柱温：25-35℃。
具体地，所述方法还包括将对照品溶液进行所述UPLC检测；其中 所述对照品选自绿原酸。分别取绿原酸对照品适量，精密称定，置于 25ml容量瓶中，用25％甲醇溶解并定容至刻度，即得所述对照品溶液。
进一步地，所述色谱条件包括：Agilent Eclipise Plus C18(2.1mm ×50mm，1.8μm)；流动相：B相：乙腈：甲醇(3:97)；A相：0.1％H3PO4； 洗脱梯度如下：
Figure RE-GDA0002705357150000041
检测波长：220nm；流速：0.3ml/min；柱温：30℃。
采用上述方法测定时，可精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1μ L，注入液相色谱仪，以绿原酸作为参照峰分别计算各色谱峰的相对保 留时间和相对峰面积进行测定。
按以上方法建立金青中间体图谱后，按相同的方法测定待测金青中 间体样品的图谱，然后将其与上述金青中间体的图谱比较，相似度不低 于0.90。
本发明建立了金青中间体中9个成分的UPLC一测多评含量测定方 法，尤其增加了7-羟基獐牙菜苷的控制标准；同时建立了中间体的UPLC 指纹图谱控制方法，实现了和含量测定检测方法的统一，有效提高了产 品的质量控制水平。
本发明采用上述检测方法对热毒宁注射液金青中间体成分进行定 量检测时，能较全面的反映热毒宁注射液金青中间体中的化学成分，且 各色谱峰分离较好，峰型好，重复性较好，该方法具有良好的线性关系、 精密度、稳定性、回收率，能够准确检测热毒宁注射液金青中间体的成 分含量，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量。
本发明建立的热毒宁注射液金青中间体UPLC含量测定和指纹图 谱分析方法，快速，便捷，准确，且具有良好的精密度、稳定性和重复 性，能够准确检测热毒宁注射液金青中间体的成分含量，获得的指纹图 谱能够客观评估样品的质量。
附图说明
图1为金青中间体中不同色谱柱考察色谱图。
图2为金青中间体不同柱温考察色谱图。
图3为金青中间体不同流速考察色谱图。
图4为金青中间体不同仪器考察色谱图。
图5为金青中间体色谱图；其中，1、新绿原酸；2、咖啡酸；3、 绿原酸；4、隐绿原酸；5、7-羟基獐牙菜苷；6、断氧化马钱子苷；7、 异绿原酸B；8、异绿原酸A；9、异绿原酸C。
图6为热毒宁注射液金青中间体对照指纹图谱；其中，1.新绿原酸； 2.咖啡酸；S.绿原酸；3.隐绿原酸；4.7-羟基獐牙菜苷；5.断氧化马钱子 苷；6.异绿原酸B；7.异绿原酸A；8.异绿原酸C。
具体实施方式
本发明中，热毒宁的制备方法如下：
青蒿1250g金银花750g栀子600g
以上三味，金银花、青蒿加13-18倍量水浸泡3小时，加热煎煮蒸 馏2次，每次2小时，同时收集挥发油，备用。合并煎煮液，减压浓缩 至相对密度为1.03-1.08，高速离心(20000转/min)取上清液，分级超滤， 超滤液减压浓缩至50℃相对密度为1.10-1.12，真空干燥，得金银花、 青蒿干膏粉。栀子粉碎成粗粉，用6倍量80％乙醇加热回流1-3次，每 次1小时，合并药液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至1∶1，用盐酸调 pH4.0，100℃加热1小时，冷藏12小时，滤过，滤液浓缩至50℃相对 密度为1.10-1.12，真空干燥，得栀子干膏粉。取挥发油，加入6g波洛 沙姆108研磨混匀后，加入900ml注射用水中，搅拌使澄明再加入上述 干膏粉，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调PH值为7.5-8.0，加注射用水 至1000ml。用G4垂熔漏斗滤过，灌封于10ml安瓿中，100℃流通蒸 汽灭菌。每支10ml，相当生药26克，静脉滴注，本品10-20ml注射液， 加入5％葡萄液或0.9％氯化钠注射液250-500ml。
前期的热毒宁注射液生产过程研究中关于金青提取过程的控制多 以有机酸类成分(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸等4个指标) 和以断氧化马钱子苷为代表的环烯醚萜苷类成分为指标；关于热毒宁注 射液成品的质量控制最多涉及到11个有机酸和环烯醚萜苷类成分，以 及木犀草苷、东莨菪内酯等微量成分。但是尚未有关UPLC法用于热毒 宁注射液中间体金青干膏中9个成分的一测多评含量测定及指纹图谱 相关研究报道。
有鉴于此，本发明提出了一种热毒宁注射液金青中间体成分的 UPLC定量检测方法及其指纹图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴 本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替 换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本 发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进 行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除特别指出，本发明提供的技术方案中所用药品、试剂、仪器均可 由常规渠道或市场购得。
一、含量测定方法的筛选
1.校正因子考察
取不同浓度的混合对照品溶液，分别考察不同柱温、流速、色谱柱、 检测波长、流动相组成及不同pH值条件下校正因子的变化情况。
表1金青中间体中各化合物校正因子耐用性考察
Figure BDA0002526701140000061
Figure BDA0002526701140000071
注：柱1和柱2为不同批次的AglientZORBAX EclipsePlus C18(2.1mm×50mm，1.8μm) 色谱柱
混合对照品制备方法如下：分别称取7-羟基獐牙菜苷、断氧化马 钱子苷、新绿原酸、咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原 酸A、异绿原酸C对照品适量，精密称定，用25％甲醇溶解并定容至 刻度，即得各单标溶液。分别精密吸取上述各单标溶液适量，分别用 25％甲醇配制成7-羟基獐牙菜苷0.4mg/ml、栀子苷1.189mg/ml、断氧 化马钱子苷0.200mg/ml、新绿原酸0.246mg/ml、咖啡酸0.033mg/ml、 绿原酸0.796mg/ml、隐绿原酸0.252mg/ml、异绿原酸B 0.251mg/ml、 异绿原酸A 0.254mg/ml、异绿原酸C 0.232mg/ml的混标母液。
其中，除影响因素以外，其它色谱条件如下：色谱柱：Agilent Eclipise Plus C18(2.1mm×50mm，1.8μm)；流动相：B相：乙腈： 甲醇(3:97)；A相：0.1％H3PO4；洗脱梯度见下表；检测波长：237nm、 324nm(环烯醚萜苷类成分检测波长为237nm，有机酸类成分检测波长 为324nm)；流速：0.3ml/min；柱温：30℃。梯度洗脱，条件如下：
Figure BDA0002526701140000072
结果表明，不同柱温、流速、色谱柱、检测波长、流动相组成及不 同pH值条件下校正因子无明显变化。
2.色谱条件的耐用性考察
(1)色谱柱考察
比较2种不同型号不同色谱柱(柱1：Aglient ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1mm×50mm，1.8μm)和柱2：Waters Xbridge BEH C18(2.1mm ×50mm，1.7μm))对金青中间体中9个成分的分离情况。
表2金青中间体中9个成分不同色谱柱考察
Figure BDA0002526701140000081
结果：参考“校正因子考察”中的色谱条件，对供试品溶液进行考 察，图1和表2表明，供试品溶液中的9个色谱峰能较好分离。
(2)不同洗脱条件考察
条件一：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(2.1mm×50mm，1.8μm)； 流动相：B相：甲醇；A相：0.1％H3PO4；洗脱梯度见下表；检测波长： 237nm、324nm；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；
Figure BDA0002526701140000082
Figure BDA0002526701140000091
结果：部分成分不能较好分离，需要进一步优化条件。
条件二：色谱柱：Waters HSS T3C18(3.0mm×100mm，1.7μm)； 流动相：B相：乙腈；A相：0.1％H3PO4；洗脱梯度见下表；检测波长： 237nm、324nm；流速：0.3ml/min；柱温：30℃；
Figure BDA0002526701140000092
结果：部分成分不能较好分离，需要进一步优化条件。
条件三：色谱柱：Waters HSS T3C18(3.0mm×100mm，1.7μm)； 流动相：B相：甲醇：乙腈(1:1)；A相：0.1％H3PO4；洗脱梯度见下 表；检测波长：237nm、324nm；流速：0.4ml/min；柱温：30℃；
Figure BDA0002526701140000093
结果：部分成分不能较好分离，需要进一步优化条件。
条件四：色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(2.1mm×50mm，1.8μm)； 流动相：B相：甲醇：乙腈(3:97)；A相：0.1％H3PO4；洗脱梯度见下 表；检测波长：237nm、324nm；流速：0.3ml/min；柱温：30℃；结果 见图3。
Figure BDA0002526701140000101
结果：部分成分不能较好分离，需要进一步优化条件。
条件五：色谱柱：Agilent Eclipise Plus C18(2.1mm×50mm，1.8 μm)；流动相：B相：乙腈：甲醇(3:97)；A相：0.1％H3PO4；洗脱梯 度见下表；检测波长：237nm、324nm(环烯醚萜苷类成分检测波长为 237nm，有机酸类成分检测波长为324nm)；流速：0.3ml/min；柱温：30℃。
Figure BDA0002526701140000102
结果：结果发现，在该条件下金青干膏中9个主要成分的分离度较 好，满足样品的检测需求，故作为最终检测条件。
(3)不同柱温考察
参考“.校正因子考察”中的色谱条件，比较不同柱温(25℃，30℃， 35℃)下金青中间体中9个成分的分离情况。
表3金青中间体中9个成分不同柱温考察
Figure BDA0002526701140000103
Figure BDA0002526701140000111
图2和表3表明，柱温过高或过低均会影响热毒宁注射液中9个成 分的分离度，25℃-35℃下均能分离，其中30℃分离效果最佳。
(4)不同流速考察
参考“.校正因子考察”中的色谱条件，比较不同流速(0.28ml/min， 0.30ml/min，0.32ml/min)条件下热毒宁注射液中9个成分的分离情况。
表4金青中间体中9个成分不同流速考察
Figure BDA0002526701140000112
图3和表4表明，0.28ml/min，0.30ml/min，0.32ml/min流速下热 毒宁注射液度中9个成分的均能较好检测出来。
(5)不同仪器考察
仪器1：Aglient 1290InfinityⅡ(二元泵，DAD检测器)
仪器2：Aglient 1260InfinityⅡ(二元泵，DAD检测器)
参考“校正因子考察”中的色谱条件，比较不同仪器条件下金青中 间体中9个成分的分离情况。
表5金青中间体中9个成分不同仪器考察
Figure BDA0002526701140000121
图4和表5表明，仪器1与仪器2均可适用于金青中间体中9个成 分的分离。
二、热毒宁注射液金青中间体成分定量检测方法及其方法学考察
仪器与试药：
仪器：Agilent 1290高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)； ME204E电子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；XS205电子分 析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；KH-300DB超声波清洗器(昆 山禾创超声仪器有限公司)。
试剂：甲醇(南京化学试剂股份有限公司，批号：180522285K)； 乙腈(Tedia，批号：18035148)；甲醇(Tedia，批号：17095086)；磷 酸(南京化学试剂股份有限公司，批号：170825965E)。
药材：金青中间体(江苏康缘药业股份有限公司，批号：160322- 160331)；绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号：110753-201716， 纯度：99.3％)热毒宁注射液(江苏康缘药业股份有限公司，批号： 160706-160715)；栀子苷(中国食品药品检定研究院，批号：110749-201617，纯度：97.6％)；断氧化马钱子苷(成都普菲德股份有 限公司，批号：17033103，纯度：98.5％)；新绿原酸(上海源叶生物科 技有限公司，批号：P13O8F45676，纯度：99.6％)；咖啡酸(中国食品 药品检定研究院，批号：110885-201703，纯度：99.7％)；绿原酸(中 国食品药品检定研究院，批号：110753-201716，纯度：99.3％)；隐绿 原酸(上海源叶生物科技有限公司，批号：Y12O8H45678，纯度：98.5％)； 异绿原酸A(中国食品药品检定研究院，批号：111782-201706，纯度： 97.3％)；异绿原酸B(上海源叶生物科技有限公司，批号：P20J9F53191， 纯度：97.3％)；异绿原酸C(中国食品药品检定研究院，批号： 111894-201001，纯度：89.6％)；7-羟基獐牙菜苷(上海诗丹德标准技 术服务有限公司，批号：5685，纯度：96.78％)。
1.热毒宁注射液金青中间体成分UPLC定量检测方法
(1)供试品溶液的制备：精密称取金青中间体0.06g，置于25ml 量瓶中，精密加入纯水15ml，超声处理60min，放冷，用乙腈定容至 刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，作为供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备：混标母液的制备：分别称取栀子苷、断 氧化马钱子苷、新绿原酸、咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、 异绿原酸A、异绿原酸C对照品适量，精密称定，用25％甲醇溶解并 定容至刻度，即得各单标溶液。分别精密吸取上述各单标溶液适量，分 别用25％甲醇配制成栀子苷1.189mg/ml、7-羟基獐牙菜苷0.4mg/ml、断 氧化马钱子苷0.200mg/ml、新绿原酸0.246mg/ml、咖啡酸0.033mg/ml、 绿原酸0.796mg/ml、隐绿原酸0.252mg/ml、异绿原酸B 0.251mg/ml、 异绿原酸A 0.254mg/ml、异绿原酸C 0.232mg/ml的混标母液。
标准工作液1的制备：取上述对照品母液适量，配制成混合对照品 溶液，分别取混标母液0.5ml、1ml、2ml、3ml置5ml容量瓶中定容置 刻度，即得系列对照品溶液。见表6。
标准工作液2的配制：精密称取7-羟基獐牙菜苷对照品8.68mg， 置20ml量瓶中，用无水甲醇溶解并定容至刻度，得浓度为0.420mg/ml 的单标母液。分别取单标母液1ml、2ml、4ml、6ml置10ml容量瓶中， 定容置刻度，即得系列标准工作液。见表6。
表6 9个化合物的浓度信息(mg/ml)
Figure BDA0002526701140000141
(3)色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipise Plus C18(2.1mm×50mm， 1.8μm)；流动相：B相：乙腈：甲醇(3:97)；A相：0.1％H3PO4；洗 脱梯度见下表；检测波长：237nm、324nm(环烯醚萜苷类成分检测波 长为237nm，有机酸类成分检测波长为324nm)；流速：0.3ml/min；柱温：30℃。梯度洗脱，条件如下：
Figure BDA0002526701140000142
(4)校正因子测定：取表1中5个不同浓度的混合对照品溶液进样 分析，其中环烯醚萜苷类成分可以用栀子苷作为内参物，有机酸类成分 以绿原酸作为内参物，分别计算校正因子，结果见表7。
表7金青干膏中各化合物校正因子信息
Figure BDA0002526701140000151
(5)测定法：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1μL，注入液 相色谱仪，使用校正因子进行测定，见图5。
2.线性关系考察
分别精密吸取2项下系列对照品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测 定。记录各色谱峰的峰面积，以进样浓度(mg/ml)为横坐标(x)，峰 面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表8。
表8金青中间体中9个化合物的线性回归方程
Figure BDA0002526701140000152
3.精密度试验
取同一浓度的对照品溶液(BQ4)，连续进样6针，测定峰面积， 计算各色谱峰峰面积的RSD值，见表9。结果表明，该方法精密度良 好。
表9金青中间体中9个化合物的精密度
Figure BDA0002526701140000161
4.稳定性试验
取对照品溶液(BQ3)、供试品溶液(批号：180541)各一份，分 别于0、2、4、8、12、24h进样，计算各成分色谱峰峰面积的RSD值， 见表10。结果表明，该方法稳定性良好。
表10金青中间体中9个化合物的稳定性
Figure BDA0002526701140000162
Figure BDA0002526701140000171
5.重复性试验
取同一批供试品(批号：180541)，按供试品溶液制备项下平行制 备供试品溶液6份，按照上述色谱条件进行测定，见表11。结果表明， 该方法重复性良好。
表11金青中间体中9个化合物的重复性(mg/g)
Figure BDA0002526701140000172
6.加样回收率试验
表12金青中间体中9个化合物的加样回收率
Figure BDA0002526701140000173
Figure BDA0002526701140000181
Figure BDA0002526701140000191
Figure BDA0002526701140000201
7.样品含量测定
表13 10批次金青中间体中各成分含量(mg/g)
Figure BDA0002526701140000202
三、热毒宁注射液金青中间体指纹图谱检测方法的建立
1.热毒宁注射液金青中间体的指纹图谱检测方法
(1)供试品溶液的制备：精密称取金青干膏0.06g，置于25ml 量瓶中，精密加入纯水15ml，超声处理60min，放置1小时，用乙腈 定容至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，作为供试品 溶液。
(2)对照品溶液的制备：分别取绿原酸对照品适量，精密称定， 置于25ml容量瓶中，用25％甲醇溶解并定容至刻度，即得。
(3)色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipise Plus C18(2.1mm×50mm， 1.8μm)；流动相：B相：乙腈：甲醇(3:97)；A相：0.1％H3PO4；洗 脱梯度见下表；检测波长：220nm；流速：0.3ml/min；柱温：30℃。
Figure BDA0002526701140000211
(4)测定法：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1μL，注入液 相色谱仪，以绿原酸作为参照峰分别计算各色谱峰的相对保留时间和相 对峰面积进行测定。
2.精密度试验
按实施例1项下方法制备供试品溶液，连续进样6针，以绿原酸作 为参照峰，分别计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，以及相应 RSD值，结果见表14、15。各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD 均小于5.0％，表明本方法精密度良好。
表14指纹峰相对保留时间精密度考察
Figure BDA0002526701140000212
Figure BDA0002526701140000221
表15指纹峰相对峰面积精密度考察
Figure BDA0002526701140000222
3.稳定性试验
按实施例1项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24h 分别进样，以绿原酸作为参照峰，分别计算各色谱峰的相对保留时间和 相对峰面积，以及相应RSD值，结果见表16、17。各色谱峰的相对保 留时间和相对峰面积的RSD小于5.0％，表明金青干膏在24h内稳定性 良好。
表16指纹峰相对保留时间稳定性考察
Figure BDA0002526701140000223
Figure BDA0002526701140000231
表17指纹峰相对峰面积精密度考察
Figure BDA0002526701140000232
4.重复性试验
按实例1项下方法制备供试品溶液，平行6份，分别进样，以绿原 酸作为参照峰，分别计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，以及 相应RSD值，结果见表18、19。各色谱峰的相对保留时间和相对峰面 积RSD均小于5.0％，说明本方法重复性良好。
表18指纹峰相对保留时间重复性考察
Figure BDA0002526701140000233
Figure BDA0002526701140000241
表19指纹峰相对峰面积重复性考察
Figure BDA0002526701140000242
5.样品测定
按上述所建方法分析10批金青干膏，采集指纹图谱，结果见表20、 21。将得到的10批样品色谱图导入由国家药典委员会主持开发的“中 药色谱指纹图谱相似度评价软件2004A”中进行数据处理分析，生成对 照指纹图谱(见图6)，并评价相似度。
表20 10批次金青干膏指纹峰相对保留时间
Figure BDA0002526701140000243
Figure BDA0002526701140000251
表21 10批次金青干膏指纹峰相对峰面积
Figure BDA0002526701140000252
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种金青中间体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：取金青中间体供试品和对照品进行检测，该检测的色谱条件包括：
十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：B相：乙腈：甲醇(3:97)；A相：0.1％H3PO4；梯度洗脱如下：
Figure RE-FDA0002705357140000011
根据检测结果，获得金青中间体的成分信息，或成分及其含量信息。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品的制备为，称取金青干膏，置于量瓶中，加入纯水，超声处理，用乙腈定容至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，作为供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：检测波长：218-225nm、320-330nm；流速：0.28-0.32ml/min；柱温：25℃-35℃。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：色谱柱：AgilentEclipise Plus C18(2.1mm×50mm，1.8μm)；流动相：B相：乙腈：甲醇(3:97)；A相：0.1％H3PO4。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：流速：0.3ml/min；柱温：30℃，检测波长：237nm、324nm。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述对照品选自7-羟基獐牙菜苷、断氧化马钱子苷、新绿原酸、咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C和总环烯醚萜苷的一种或多种。
7.一种金青中间体的指纹图谱构建方法，其特征在于，该方法包括：
供试品溶液的制备：金青干膏，置于量瓶中，精密加入纯水，超声处理60min，放置1小时，用乙腈定容至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，作为供试品溶液；
对所述供试品溶液进行检测，其中，所述检测色谱条件包括：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：B相：乙腈：甲醇(3:97)；A相：0.1％H3PO4；梯度洗脱如下：
Figure RE-FDA0002705357140000021
根据检测结果，获得金青中间体指纹图谱。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：流速：0.28-0.32ml/min，检测波长：218-225nm，柱温：25-35℃。
9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述方法还包括将对照品溶液进行所述检测；其中所述对照品选自绿原酸。
10.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述色谱条件包括：AgilentEclipise Plus C18(2.1mm×50mm，1.8μm)；流动相：B相：乙腈：甲醇(3:97)；A相：0.1％H3PO4；洗脱梯度如下：
Figure RE-FDA0002705357140000031
检测波长：220nm；流速：0.3ml/min；柱温：30℃。
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