CN115856158B - 一种草果水溶性特征成分在养胃汤中的定性和定量方法 - Google Patents
一种草果水溶性特征成分在养胃汤中的定性和定量方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于草果的质量分析评价方法领域，具体涉及一种草果水溶性特征成分在养胃汤中的定性和定量方法。本发明首先采用UPLC‑PDA法，通过全波长扫描确定草果特征成分的最佳吸收波长，并建立养胃汤和草果指纹图谱，捕获归属于草果的3个专属性色谱峰。经MS和NMR进行结构鉴定，3个草果水溶性特征成分分别为儿茶素、表儿茶素和表阿夫儿茶精，同时采用法定对照品指认出前两者。根据已识别的成分，建立了养胃汤儿茶素和表儿茶素的UPLC含量测定方法。本发明成功解决了无法获取养胃汤中草果的特征信息的技术问题，为后期开发和质量控制提供专属性更强、适用性更广的评价手段。
Description
技术领域
本发明属于草果的质量分析评价方法领域，具体涉及一种草果水溶性特征成分在养胃汤中的定性和定量方法。
背景技术
养胃汤出自明朝王肯堂的《证治准绳》，收录于2018年4月公布的《古代经典名方目录(第一批)》，由清半夏、姜厚朴、麸炒苍术、橘红、广藿香叶、草果、茯苓、人参、炙甘草、乌梅和生姜组成，治外感风寒，内伤生冷，憎寒壮热，头目昏疼，不问风寒二证，夹食停痰，俱能治之，但感风邪，以微汗为好。现代临床主要用于治疗慢性胃炎、胃溃疡等胃肠道疾病。国家药品监督管理局药品审评中心于2021年8月发布的《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则(试行)》要求，处方中各药味应在制剂质量控制项目中体现，并建立各药味的含量测定方法。
草果作为养胃汤组方的关键药味之一，起到燥湿温中功效。目前关于养胃汤中草果的质量控制方法鲜有报道，尤其缺少其水溶性专属成分的识别和定量研究。经典名方以传统水煎煮方式制备，物质组成以极性较强的水溶性成分为主。《中国药典》2020年版一部将挥发油和挥发性成分桉油精分别作为含量测定和鉴别指标，上述组分脂溶性较强，难溶于水；此外，挥发性成分在煎煮过程中逸散严重，水煎液内含量极低。本研究组前期通过超高效液相色谱法和薄层色谱法建立养胃汤中桉油精的定量和定性方法，均未能定量检测到该成份，难以作为质控指标。因此，有必要从水溶性部位寻找养胃汤中草果定性与定量的特征点。草果的主要水溶性组分包括酚、黄酮、二苯基庚烷和双环壬烷类等，但由多药味组成的复方水溶性部位成分构成更为复杂，存在相互干扰，依靠单一色谱方法表征出特征性强、专属性高的成分，技术难度极大。牛丽颖等在一种养胃汤冻干粉多味药材多信息快速薄层鉴别方法中以草果对照药材作为参照物，建立了草果的薄层鉴别方法，但供试品色谱归属于草果的斑点特征性较弱，背景干扰严重，且未能指认得到已知成分。范帅帅等采用UPLC-MS/MS法同时测定养胃汤中26个成分的含量，归属于草果的成分仅有芦丁1种，且橘红和乌梅均有贡献，专属性较弱。
综上所述，采用多维分析技术结合的手段解析养胃汤的草果水溶性特征成分势在必行。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明提供了一种草果水溶性特征成分在养胃汤中的定性和定量方法。成功解决了无法获取养胃汤中草果的特征信息的技术问题，为后期开发和质量控制提供专属性更强、适用性更广的评价手段。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
一种草果水溶性特征成分在养胃汤中的定性方法，包括如下步骤：
S1、样品制备：分别取养胃汤冻干粉、草果冻干粉和缺草果冻干粉适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇10mL，超声处理30min，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S2、分别取上述养胃汤冻干粉、草果冻干粉和缺草果冻干粉续滤液各1μL，注入液相色谱仪，测定，记录波长203nm下的色谱图，获得养胃汤冻干粉中3个草果专属的水溶性特征成分色谱峰；
S3、取草果2kg，分别加8倍和7倍水煎煮，每次煎煮1h，滤过，合并煎液，减压浓缩，喷雾干燥，得到草果提取物200g；取上述提取物，用1800mL、50％甲醇超声溶解，滤过，取滤液，减压浓缩，得50％甲醇提取物部位；
S4、将步骤S3获得的50％甲醇提取物部位经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，梯度洗脱得到7个流分A～G，其中，D流分经制备型HPLC分离得到化合物1，化合物2和化合物3；
S5、将步骤S4获得的化合物1，化合物2和化合物3加入甲醇溶解，过滤，将滤液注入液相色谱仪，分析发现步骤S4分离得到的化合物1，化合物2和化合物3与步骤S2获得的养胃汤冻干粉中3个草果专属的水溶性特征成分色谱峰的保留时间一致，进一步经核磁共振仪和质谱仪鉴定，确定化合物1为儿茶素，化合物2为表儿茶素，化合物3为表阿夫儿茶精；
S6、进一步利用儿茶素、表儿茶素的对照品溶液进行色谱分析，发现其与化合物1～2、养胃汤冻干草果冻干粉色谱图在相同位置呈现相同色谱峰，化合物3与养胃汤冻干草果冻干粉色谱图在相同位置呈现相同色谱峰。
本发明，步骤S1、S2所述续滤液是指在定量分析过滤时，前端滤液一般弃去，只取后端滤液，药典上称作续滤液。步骤S3为滤液，因为过滤时全部滤液均接收。且步骤S3、S4所述为50％甲醇提取物部位，即为50％甲醇超声、减压浓缩后的提取物。
优选地，步骤S1所述养胃汤冻干粉的制备过程为：取清半夏，姜厚朴，麸炒苍术，橘红，广藿香叶，草果，茯苓，人参，炙甘草，加水450mL，生姜，乌梅，煎煮至270mL，趁热过滤；重复制备10份煎液，混合均匀，采用冷冻干燥方式，-50℃预冷冻3h后冷冻干燥72h，压盖密塞，即得。
优选地，步骤S1所述草果冻干粉的制备过程为：取草果1.25g，加水450mL，煎煮至270mL，趁热过滤；重复制备10份煎液，混合均匀，采用冷冻干燥方式，-50℃预冷冻3h后冷冻干燥72h，压盖密塞，即得。
优选地，步骤S1所述缺草果冻干粉的制备过程为：清半夏，姜厚朴，麸炒苍术，橘红，广藿香叶，茯苓，人参，炙甘草，加水450mL，生姜，乌梅，煎煮至270mL，趁热过滤；重复制备10份煎液，混合均匀，采用冷冻干燥方式，-50℃预冷冻3h后冷冻干燥72h，压盖密塞，即得。
优选地，步步骤S2、S5所述液相色谱的条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm，色谱柱：Waters BEH C18；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4mL；进样量2μL；柱温为35℃，全波长扫描。
优选地，所述梯度洗脱程序如下表1所示。
表1洗脱梯度
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.00 | 100.0 | 0.0 |
| 8.00 | 90.0 | 10.0 |
| 44.00 | 78.0 | 22.0 |
| 80.00 | 35.0 | 65.0 |
本发明还提供了一种草果水溶性特征成分在养胃汤中的定量方法，包括如下过程：
(1)对照品溶液的制备：取儿茶素对照品、表儿茶素对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1mL各含20μg的混合溶液，摇匀，即得；
(2)供试品溶液的制备：取养胃汤冻干粉适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(3)分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液各1μL，注入液相色谱仪，按照所述定性方法检测，即得。
优选地，步骤(2)中的超声处理过程为于功率500W，频率40kHz下处理30min。
本发明首先采用UPLC-PDA法，通过全波长扫描确定草果特征成分的最佳吸收波长，并建立养胃汤和草果指纹图谱，捕获归属于草果的3个专属性色谱峰。参考指纹图谱的出峰时间和洗脱梯度比例，通过反复柱层析和高效液相(HPLC)色谱技术分离不同流分，并进一步纯化得到与指纹图谱出峰时间匹配的3个成分。经MS和NMR进行结构鉴定，3个草果水溶性特征成分分别为儿茶素、表儿茶素和表阿夫儿茶精，同时采用法定对照品指认出前两者。根据已识别的成分，建立了养胃汤儿茶素和表儿茶素的UPLC含量测定方法。
本发明利用UPLC、柱层析、Pre-HPLC、MS和NMR多维分析检测手段，首次分离、辨识到养胃汤中归属于草果的水溶性特征成分儿茶素、表儿茶素和表阿夫儿茶精，并结合成分特性建立了养胃汤儿茶素和表儿茶素的含量测定方法，同时提供了定性和定量的研究基础，成功解决了无法获取养胃汤中草果的特征信息，为本方的后期开发和质量控制提供专属性更强、适用性更广的评价手段。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下优势：本发明采用UPLC-PDA法建立养胃汤和草果指纹图谱，捕获归属于草果的专属性色谱峰；通过反复柱层析和高效液相(HPLC)等色谱技术分离、纯化上述特征成分，经MS和NMR进行结构鉴定；根据已识别的成分建立养胃汤草果水溶性特征成分的UPLC含量测定方法，为该产品的后期开发和质量控制提供专属性更强、适用性更广的评价手段。
附图说明
图1为不同检测波长的检测结果图；
图2为草果冻干粉、缺草果冻干粉和养胃汤冻干粉的供试品溶液对比色谱图；
图3为203nm下草果提取物与化合物1～3的UPLC叠加比对图；
图4为203nm下草果提取物与化合物1～3的UPLC堆栈比对图；
图5为化合物1(A)、化合物2(B)和化合物3(C)的吸收光谱图；
图6为化合物1的化学结构图；
图7为化合物2的化学结构图；
图8为化合物3的化学结构图；
图9为养胃汤草果特征成分指认对比图；
图10为养胃汤含量测定专属性考察结果图；
图11为儿茶素标准曲线图；
图12为表儿茶素标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明实施例涉及到的仪器如下表2所示。
表2仪器信息汇总表
本发明涉及到的试剂如下表3所示。
表3试剂信息汇总表
| 试剂名称 | 厂家 |
| 乙腈 | 美国BCR公司 |
| 甲醇 | 美国BCR公司 |
| 二氯甲烷 | 美国BCR公司 |
| 磷酸 | 阿拉丁 |
| 超纯水 | M MILLIPORE Synergy UV |
本发明涉及到的药材信息为草果，产地为广东省阳江市，产品批号为CG204。
本发明涉及到的对照品信息如表4所示。
表4对照品信息
| 对照品名称 | 批号 | 供应商 |
| 儿茶素 | 110877-202005 | 中国食品药品检定研究院 |
| 表儿茶素 | 110878-201703 | 中国食品药品检定研究院 |
| 表阿夫儿茶精 | E880047 | 上海麦克林生化科技有限公司 |
实施例1一种草果水溶性特征成分在养胃汤中的定性方法
1.样品的制备：
1.1养胃汤冻干粉的制备
取清半夏2.50g，姜厚朴2.50g，麸炒苍术2.50g，橘红1.88g，广藿香叶1.25g，草果1.25g，茯苓1.25g，人参1.25g，炙甘草0.63g，加水450毫升，生姜7片，乌梅1个，煎煮至270毫升，趁热过滤。重复制备10份煎液，混合均匀，采用冷冻干燥方式，-50℃预冷冻3h后冷冻干燥72h，压盖密塞，即得养胃汤冻干粉。
1.2草果冻干粉的制备
取草果1.25g，加水450毫升，煎煮至270毫升，趁热过滤。重复制备10份煎液，混合均匀，采用冷冻干燥方式，-50℃预冷冻3h后冷冻干燥72h，压盖密塞，即得草果冻干粉。
1.3缺草果冻干粉的制备
清半夏2.50g，姜厚朴2.50g，麸炒苍术2.50g，橘红1.88g，广藿香叶1.25g，茯苓1.25g，人参1.25g，炙甘草0.63g，加水450毫升，生姜7片，乌梅1个，煎煮至270毫升，趁热过滤。重复制备10份煎液，混合均匀，采用冷冻干燥方式，-50℃预冷冻3h后冷冻干燥72h，压盖密塞，即得缺草果冻干粉。
2.供试品溶液的制备：
分别取养胃汤冻干粉、草果冻干粉和缺草果冻干粉适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇10mL，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，摇匀，滤过，取滤液，即得。
3.UPLC法表征养胃汤中草果的特征成分色谱峰
3.1色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7m)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4ml；柱温为35℃；全波长扫描。洗脱程序如下表1所示。
表1洗脱程序
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.00 | 100.0 | 0.0 |
| 8.00 | 90.0 | 10.0 |
| 44.00 | 78.0 | 22.0 |
| 80.00 | 35.0 | 65.0 |
3.2测定过程：分别精密吸取上述供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，按照上述条件，测定，即得。
3.3检测波长的选择：采用二极管阵列检测器对养胃汤冻干粉供试品溶液进行全波长扫描，结果如图1所示，表明，203nm、260nm、280nm、300nm和330nm图谱下色谱峰较多，其中，当检测波长为203nm时，图谱中主要色谱峰峰面积最大，峰数目最多，谱图信息较丰富，因此确定检测波长为203nm。
3.3按照上述3.1、3.2的检测过程，分别精密吸取养胃汤冻干粉、草果冻干粉和缺草果冻干粉供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，测定，记录波长203nm下的色谱图。
结果如图2所示，由图2可知，养胃汤冻干粉色谱中，在与草果冻干粉色谱相对应的位置，呈现3个特征峰；缺草果冻干粉色谱中，在与养胃汤冻干粉和草果冻干粉色谱相对应的位置，未见上述3个特征峰。上述结果表明，该方法可分离、表征得到养胃汤冻干粉中3个草果专属的水溶性特征成分色谱峰。
4.草果特征峰的指认：
4.1提取与分离：取草果2kg，分别加8倍和7倍水煎煮，每次煎煮1h，滤过，合并煎液，减压浓缩，喷雾干燥，得到草果提取物200g。取上述提取物，用1800mL 50％甲醇超声溶解，滤过，取续滤液，减压浓缩，得50％甲醇提取物部位。50％甲醇提取物部位经硅胶(200～300目)柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇(1∶0→0∶1)进行梯度洗脱，梯度洗脱得到7个流分(A～G)。D流分经制备型HPLC[甲醇-水(45∶55)，5mL/min]分离得到化合物1(17.86mg)，化合物2(14.39mg)和化合物3(3.51mg)。
4.2色谱峰的确认：取分离得到的化合物1～3适量，加入甲醇溶解，过滤，按照“3.1”项下的色谱条件进行分析。从图3和图4可知，分离得到的化合物1、2和3与草果提取物中3个特征色谱峰保留时间一致。图5中，化合物1(A)、化合物2(B)和化合物3(C)的吸收光谱图(1：草果提取物，2：分离化合物)。从图5可知，分离得到的化合物1、2和3与草果提取物中3个特征色谱峰的吸收光谱轮廓一致。上述结果表明，分离、纯化所得的3个化合物均为草果水溶性特征性成分。
4.3结构鉴定：分别采用核磁共振仪和质谱仪对3个分离所得的草果特征成分进行结构鉴定，结果如下：
(1)化合物1：化合物1的化学结构如图6所示，黄色油状物(甲醇)；ESI-MS m/z:289[M-H]-。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.18(1H,br s,Ar-OH),8.95(1H,br s,Ar-OH),8.87(1H,br s,Ar-OH),8.82(1H,br s,Ar-OH),6.73(1H,d,J＝2.0Hz,H-2′),6.69(1H,d,J＝8.1Hz,H-6′),6.60(1H,dd,J＝8.1,2.1Hz,H-5′),5.90(1H,d,J＝2.3Hz,H-6),5.70(1H,d,J＝2.2Hz,H-8),4.87(1H,d,J＝5.1Hz,3-OH),4.49(1H,d,J＝7.4Hz,H-2),3.83(1H,m,H-3),2.66(1H,dd,J＝16.0,5.3Hz,H-4a),2.36(1H,dd,J＝16.0,8.0Hz,H-4b)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:156.5(C-7),156.2(C-5),155.4(C-9),144.8(C-3′,4′),130.6(C-1′),118.4(C-6′),115.1(C-5′),114.5(C-2′),99.1(C-10),95.1(C-6),93.9(C-8),81.0(C-2),66.3(C-3),27.8(C-4)。以上数据证明化合物1为儿茶素(catechin)。
(2)化合物2：化合物2的化学结构式如图7所示，无色油状物(甲醇)；ESI-MS m/z:289[M-H]-。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.10(1H,br s,Ar-OH),8.89(1H,br s,ArOH),8.78(1H,overlapped,Ar-OH),8.72(1H,overlapped,Ar-OH),6.89(1H,s,H-2′),6.66(1H,overlapped,H-6′),6.64(1H,overlapped,H-5′),5.89(1H,d,J＝2.3Hz,H-8),5.72(1H,d,J＝2.3Hz,H-6),4.73(1H,d,J＝1.6Hz,H-2),4.65(1H,d,J＝4.7Hz,3-OH),4.01(1H,m,H-3),2.68(1H,dd,J＝16.4,4.2Hz,H-4a),2.49(1H,dd,J＝11.9,2.7Hz,H-4b)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:156.5(C-5),156.2(C-7),155.8(C-9),144.5(C-4′),144.4(C-3′),130.6(C-1′),118.0(C-6′),114.9(C-2′),114.8(C-5′),98.5(C-10),95.1(C-6),94.1(C-8),78.1(C-2),64.9(C-3),28.2(C-4)。以上数据证明化合物2为表儿茶素(epicatechin)。
(3)化合物3：化合物3的化学结构如图8所示，淡黄色油状物(甲醇)；ESI-MS m/z:273[M-H]-。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.22(2H,d,J＝8.4Hz,H-2′,6′),6.71(2H,d,J＝8.4Hz,H-3′,5′),5.90(1H,d,J＝2.3Hz,H-8),5.72(1H,d,J＝2.3Hz,H-6),4.80(1H,s,H-2),4.02(1H,m,H-3),2.68(1H,dd,J＝16.4,4.4Hz,H-4a),2.46(1H,overlapped,H-4b)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:156.6(C-7),156.3(C-5,9),155.7(C-4′),129.9(C-1′),128.2(C-2′,6′),114.4(C-3′,5′),98.4(C-10),95.1(C-8),94.1(C-6),78.0(C-2),64.8(C-3),28.2(C-4)。以上数据证明化合物3为表阿夫儿茶精(epiafzelechin)。
4.4特征峰的指认：儿茶素、表儿茶素对照品均购自中国食品药品检定研究院，表阿夫儿茶精的法定对照品暂未有售。因此，取儿茶素、表儿茶素的对照品适量，加入甲醇溶解，过滤，备用。取分离得到的化合物1～3适量，加入甲醇溶解，过滤，备用。按照“3.1”项下的色谱条件，分别精密吸取化合物1～3溶液、3种对照品溶液和养胃汤冻干粉、草果冻干粉、缺草果冻干粉供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。
结果如图9所示，由此可知，儿茶素、表儿茶素对照品与化合物1～2、养胃汤冻干草果冻干粉色谱图在相同位置呈现相同色谱峰，与缺草果冻干粉色谱图相比，无阴性干扰，进一步确认儿茶素、表儿茶素为草果在养胃汤中的专属性特征成分。化合物3与养胃汤冻干草果冻干粉色谱图在相同位置呈现相同色谱峰，与缺草果冻干粉色谱图相比，无阴性干扰，结合“4.3结构鉴定”项下结果，基本确认阿夫儿茶精同样为草果在养胃汤中的专属性特征成分。
实施例2一种草果水溶性特征成分在养胃汤中的定量方法
指标成分的选择：已知的三种草果特征成分中，以儿茶素、表儿茶素的含量更高，且能够获得法定对照品，在建立质控方法和质量标准上更具适用性和准确性。因此，选取儿茶素和表儿茶素作为养胃汤中草果药味的含量测定指标。含量测定方法：依据实施例1中“3.1”项下色谱条件，采用相同的流动相、流速、柱温和检测波长，并根据儿茶素和表儿茶素特征峰的出峰时间，优化洗脱梯度，确认养胃汤儿茶素和表儿茶素含量测定方法如下：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7m)；以乙腈-0.1％磷酸(15：85)为流动相；流速为每分钟0.4mL；柱温为35℃；检测波长为203nm。理论板数按儿茶素峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备：取儿茶素对照品、表儿茶素对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1mL各含20μg的混合溶液，摇匀，即得。
供试品溶液的制备：取养胃汤冻干粉适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：别精密吸取上述供试品溶液各1μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.分析方法验证
专属性：精密吸取养胃汤冻干粉(批次：YW07)供试品溶液、儿茶素和表儿茶素混合对照品溶液与空白溶剂各1μL，注入液相色谱仪，按照上述色谱条件检测。结果如图10及表5所示，表明，供试品溶液的儿茶素和表儿茶素色谱峰保留时间与对照品溶液一致，专属性较强，二者的理论塔板数均大于10000，分离度大于1.5，符合系统适应性要求。
表5色谱峰分离参数
| 成分 | 保留时间(min) | 理论塔板数 | 分离度 |
| 儿茶素 | 5.844 | 17970 | 2.43 |
| 表儿茶素 | 13.224 | 30529 | 1.71 |
线性：精密移取混合对照品储备液适量，分别用50％甲醇稀释成系列浓度的对照品溶液，摇匀，按上述色谱条件依次进样1μL，记录峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合回归方程，计算相关系数。
下表6及表7分别为儿茶素、表儿茶素的线性考察结果，图11、12分别为儿茶素和表儿茶素标准曲线图。结果表明，儿茶素线性回归方程为：y＝31586x-499.65，相关系数r2＝1，表明儿茶素在2.63μg/mL～52.50μg/mL浓度范围内线性关系良好；表儿茶素线性回归方程为：y＝27433x-4308.1，相关系数r2＝1，表明表儿茶素在2.84μg/mL～56.85μg/mL浓度范围内线性关系良好。
表6儿茶素线性考察结果
| 对照品溶液 | STD-1 | STD-2 | STD-3 | STD-4 | STD-5 |
| 浓度μg/ml | 52.50 | 26.25 | 10.50 | 5.25 | 2.63 |
| 峰面积 | 1657168 | 830256 | 327934 | 170385 | 80935 |
表7表儿茶素线性考察结果
| 对照品溶液 | STD-1 | STD-2 | STD-3 | STD-4 | STD-5 |
| 浓度μg/ml | 56.85 | 28.43 | 11.37 | 5.69 | 2.84 |
| 峰面积 | 1556266 | 774298 | 305404 | 150852 | 75715 |
精密度测定：精密吸取同一份养胃汤冻干粉(批号：YW07)供试品溶液，按照上述色谱条件重复进样6次，进样体积1μL。计算峰面积RSD。结果如表8所示，由此可知，儿茶素和表儿茶素的平均峰面积分别为829102和1447069，RSD分别为0.31％和0.27％，均小于1％，表明该方法的精密度良好。
表8精密度考察结果
重复性测定：取同一批养胃汤冻干粉(批次：YW07)约0.5g，平行6份，按上述供试品溶液制备方法，制备供试品溶液6份。每份精密吸取1μL按上述色谱条件测定，测定供试品溶液中儿茶素和表儿茶素总含量，计算RSD。结果如表9所示，由此表明，6份供试品溶液的平均含量为0.34mg/g，RSD为0.86％，小于1％，表明该方法重复性较好。
表9重复性试验结果
加样回收率测定：取已知含量养胃汤冻干粉(批次：YW07)约0.5g，精密称定，每批次平行称定6份，每份加入相近量的儿茶素和表儿茶素对照品，按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液6份。每份精密吸取1μl，按上述色谱条件测定，以下列公式计算回收率，RSD值。
结果如表10所示，由此可知，儿茶素和表儿茶素的平均回收率分别为104.0％和104.2％，RSD分别为2.2％和2.1％，回收率和RSD均符合要求，表明方法准确性较好。
表10加样回收率实验结果
稳定性：
取供试品溶液(批号：YW05)，考察供试品溶液在24h内峰面积的变化，实验结果如表11、表12所示，结果表明供试品溶液在24小时内稳定。
表11儿茶素稳定性考察结果
表12表儿茶素稳定性考察结果
最后，需要说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理、性能及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (2)
1.一种草果水溶性特征成分在养胃汤中的定量方法，其特征在于，所述草果水溶性特征成分包括儿茶素、表儿茶素，所述养胃汤由清半夏、姜厚朴、麸炒苍术、橘红、广藿香叶、草果、茯苓、人参、炙甘草、乌梅和生姜组成，所述定量方法包括如下过程：
（1）对照品溶液的制备：取儿茶素对照品、表儿茶素对照品，加50%甲醇制成每1mL各含20μg的混合溶液，摇匀，即得；
（2）供试品溶液的制备：取养胃汤冻干粉，研细，取0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇10mL，密塞，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
（3）分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液各1μL，注入液相色谱仪，检测，即得；液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7m；以乙腈-0.1%磷酸为流动相，所述乙腈与0.1%磷酸的体积比为15：85；流速为每分钟0.4mL；柱温为35℃；检测波长为203nm；理论板数按儿茶素峰计算应不低于5000。
2.如权利要求1所述的定量方法，其特征在于，步骤（2）中的超声处理过程为于功率500W，频率40kHz下处理30min。
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