CN115684409A - 一种白背叶标准汤剂中葫芦巴苷ⅱ的含量测定方法及特征图谱的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物分析技术领域,尤其是涉及一种白背叶标准汤剂中葫芦巴苷Ⅱ的含量测定方法及特征图谱的构建方法。采用高效液相色谱法进行测定,所述高效液相色谱法的条件包括:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇为流动相A,以体积百分数为0.1~0.3%的甲酸水溶液为流动相B,梯度洗脱。本法专属性强,重复性和耐用性好、稳定性和准确度高;所构建的特征图谱及检测方法可快速、全面实现对白背叶标准汤剂中多组分联合控制的目的,实现了白背叶从药材到制剂上的质量把控,有利于保障临床用药的有效性。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域,尤其是涉及一种白背叶标准汤剂中葫芦巴苷Ⅱ的含量测定方法及特征图谱的构建方法。
背景技术
白背叶原植物为大戟科野桐属植物白背叶Mallotusapelta(Lour.)Muell.Arg.,其叶、根及根茎兼可入药,药材名分别为白背叶、白背叶根,湖南省中药材标准、广西中药材标准均有收载。广泛分布在广西、云南、湖南、江西、福建、广东、海南等地的山谷灌木林中。其叶具有清热解毒,消肿止痛,祛湿止血等功效,常用于痈疖疮疡,鹅口疮,皮肤湿痒,跌打损伤,外伤出血等症;其根及根茎清热祛湿,收敛消淤,用于癥瘕痞块,白带淋浊,子宫下垂,产后风瘫,肠风泄泻,脱肛,赤眼,喉蛾,耳内流脓。
文献《白背叶HPLC特征指纹图谱及模式识别》中公开了:采用高效液相色谱法建立12个不同产地白背叶药材的指纹图谱,采用phenomenex-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);以甲醇-0.1%冰乙酸水为流动相,梯度洗脱。文献《一测多评法测定白背叶中3个黄酮苷类成分的含量》中公开了:采用高效液相色谱法,使用C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为甲醇-0.1%乙酸水溶液,梯度洗脱。以葫芦巴苷Ⅱ为内参物,建立其与夏佛托苷和异夏佛托苷的相对校准因子,计算白背叶药材中夏佛托苷、异夏佛托苷的含量,实现一测多评。同时采用外标法测定白背叶药材中3个黄酮碳苷成分的量。
以上文献的研究对象均为白背叶药材,与之不同的是,白背叶标准汤剂是由白背叶饮片经水提、浓缩、干燥等而成的冻干粉,与药材和饮片相比,已失去其固有的形态,以及对应的活性成分也有相应的变化。目前只有湖南省中药材标准(2009年版)、广西中药材标准对白背叶药材的显微及薄层鉴别进行了质量控制,难以全面反映其内在质量,而目前对于白背叶高效液相定性及定量检测技术的文献报道非常少。因此,有必要建立一种白背叶标准汤剂的HPLC含量测定及特征图谱方法,为有效控制和较全面评价白背叶标准汤剂的质量提供依据。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出一种白背叶标准汤剂中葫芦巴苷Ⅱ的含量测定方法及特征图谱的构建方法,为白背叶标准汤剂的质量和一致性评价提供保障。
本发明的第一方面,提供一种白背叶标准汤剂中葫芦巴苷Ⅱ的含量测定方法,采用外标法,通过高效液相色谱法测定,所述高效液相色谱法的条件包括:
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;
以甲醇为流动相A,以体积百分数为0.1~0.3%的甲酸水溶液为流动相B,梯度洗脱;
所述梯度洗脱的条件为:
表中百分号的含义为体积百分数。
根据本发明的一些实施例,所述流动相B为体积百分数为0.1~0.2%的甲酸水溶液;优选体积百分数为0.1%的甲酸水溶液。
根据本发明的一些实施例,所述色谱柱为Agilent Poroshell 120SB-C18。
根据本发明的一些实施例,所述色谱柱的规格为2.1mm×150mm,2.7μm。
根据本发明的一些实施例,所述高效液相色谱法的条件还包括:流动相的流速为0.2~0.4mL/min;优选0.3mL/min。
根据本发明的一些实施例,所述高效液相色谱法的条件还包括:色谱柱的柱温为30~35℃;优选30℃。
根据本发明的一些实施例,所述高效液相色谱法的条件还包括:进样量为1~5μL;优选3μL。
根据本发明的一些实施例,所述高效液相色谱法的条件还包括:检测波长为336nm。
根据本发明的一些实施例,所述高效液相色谱法的检测器为二极管阵列检测器。
根据本发明的一些实施例,所述高效液相色谱的理论塔板数按葫芦巴苷Ⅱ峰计算,不低于2000。
根据本发明的一些实施例,所述含量测定方法还包括供试品溶液的制备;所述制备步骤包括:将白背叶标准汤剂供试品与溶剂混合,超声,即得。
根据本发明的一些实施例,所述供试品溶液的质量浓度为1~5mg/mL。
进一步地,所述试品溶液的溶剂为水或醇水混合溶液。
更进一步地,所述溶剂为体积百分数为50~70%的甲醇水溶液、体积百分数为50~70%的乙醇水溶液或水;优选地,所述溶剂为体积百分数为50~60%的甲醇水溶液;更优选地,所述溶剂为体积百分数为50%的甲醇水溶液。
根据本发明的一些实施例,本发明所述超声条件包括以下i-iii中的至少一项:
i.功率:400~600W;
ii.频率:30~50kHz;
iii.时间:20~40min。
根据本发明的一些实施例,所述含量测定方法还包括对照品溶液的制备,所述制备步骤包括:将对照品与溶剂混合,即得。
根据本发明的一些实施例,所述对照品为葫芦巴苷Ⅱ。
根据本发明的一些实施例,所述对照品溶液的质量浓度为20~100μg/mL。
进一步地,所述对照品溶液的溶剂为水或醇水混合溶液。
更进一步地,所述溶剂为体积百分数为50~70%的甲醇水溶液、体积百分数为50~70%的乙醇水溶液或水;优选地,所述溶剂为体积百分数为50~60%的甲醇水溶液;更优选地,所述溶剂为体积百分数为50%的甲醇水溶液。
本发明的第二方面,提供一种白背叶标准汤剂特征图谱的构建方法,将对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液分别经高效液相色谱法测定,标定共有峰,即得;所述高效液相色谱法采用上述的条件。
根据本发明的一些实施例,所述特征图谱包括五个特征峰,其中,以峰1葫芦巴苷Ⅱ为参照峰,计算其余各特征峰与所述参照峰的相对保留时间,所述相对保留时间应在规定值的±10%范围之内,所述规定值为:峰2:1.36、峰3:1.48、峰4:1.59、峰5:2.86。
根据本发明的一些实施例,所述对照药材溶液的制备步骤包括:将对照药材与溶剂混合,超声,即得。
根据本发明的一些实施例,所述对照药材溶液的质量浓度为1~5mg/mL。
根据本发明的一些实施例,本发明所述溶剂为水或醇水混合溶液;
根据本发明的一些优选的实施例,所述溶剂为体积百分数为50~70%的甲醇水溶液、体积百分数为50~70%的乙醇水溶液或水。优选地,所述溶剂为体积百分数为50~60%的甲醇水溶液;更优选地,所述溶剂为体积百分数为50%的甲醇水溶液。
根据本发明的一些实施例,所述超声条件包括以下i-iii中的至少一项:
i.功率:400~600W;
ii.频率:30~50kHz;
iii.时间:20~40min。
本发明的第三方面,提供上述的含量测定方法或构建方法在检测白背叶标准汤剂的质量中的应用。
有益效果:
本发明基于高效液相色谱仪构建了白背叶标准汤剂的HPLC特征图谱,确定了葫芦巴苷Ⅱ等五个共有峰,所构建的HPLC特征图谱中色谱峰实现较好分离,特征图谱信息丰富,色谱峰形好,可以全面的反应白背叶标准汤剂的主要化学成分信息,检测方法具有良好的稳定性和重复性,便于推广应用。
另外,测定了白背叶标准汤剂中葫芦巴苷Ⅱ的含量,能够有效保证白背叶标准汤剂的整体质量的稳定性,使白背叶标准汤剂的质量控制技术更为完善、科学;且本方法操作简单,具有精密度高、稳定性好、重复性好及准确度高等优势,为中药材质量鉴别提供有效依据。
定义:
本发明所述的白背叶均指白背叶的干燥叶。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述,并且,部分地从说明书中变得显而易见,或者通过实施本发明而了解。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1为实施例1中最佳吸收波长考察的色谱图(254nm);
图2为实施例1中最佳吸收波长考察的色谱图(270nm);
图3为实施例1中最佳吸收波长考察的色谱图(336nm);
图4为实施例1中有机相考察结果色谱图;
图5为实施例1中水相组成考察结果色谱图;
图6为实施例1中柱温考察结果色谱图;
图7为实施例1中流速考察结果色谱图;
图8为实施例1中提取溶剂考察结果色谱图;
图9为实施例1中提取方法考察结果色谱图;
图10为实施例1中提取时间考察结果色谱图;
图11为实施例1中溶媒用量考察结果色谱图;
图12为实施例1中特征图谱专属性考察色谱图;
图13为实施例1中葫芦巴苷Ⅱ对照品特征图谱;
图14为实施例1中白背叶对照药材特征图谱;
图15为实施例1中15批白背叶标准汤剂特征图谱叠加图;
图16为实施例1中白背叶标准汤剂对照特征图谱;
图17为实施例2中葫芦巴苷Ⅱ对照品标准曲线。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述,以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然,所描述的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部实施例,基于本发明的实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例,均属于本发明保护的范围。
本发明所述的白背叶标准汤剂冻干粉,其制备方法如下:取白背叶药材,除去杂质,洗净,切粗丝片,干燥,得到白背叶饮片。取白背叶饮片100g,置于电陶瓷壶中,加水煎煮两次:第一次加入12倍量(按质量比计)的水浸泡30min,武火煮沸后文火保持微沸30min,煎液经200目筛网趁热过滤,备用;第二次加10倍量(按质量比计)的水,武火加热煮沸后文火保持微沸20min,煎液用200目筛网趁热过滤。合并两次煎液,65℃下减压浓缩至120g左右的浸膏,分装至6mL~14mL容器中,每瓶分装体积为2mL~3mL,分装完毕后冻干,取出,轧铝盖,即得。白背叶标准汤剂冻干粉的性质:棕色至棕红色的粉末;气微,味微苦。制备工艺符合《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》项下的相关规定。
实施例1白背叶标准汤剂UPLC特征图谱方法的建立
1 仪器和试药
1.1 仪器
LC-40D XR型高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司);
Agilent 1290型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司);
KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);
MS/05DU/A型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);
ME104E/02型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);
MS/303/02电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);
MWO-ABS20-DW型超纯水机(铭沃科技);
色谱柱:Agilent Poroshell 120SB-C18(2.1mm×150mm,2.7μm)。
1.2试剂
甲醇、乙腈为色谱纯(TEDIA公司);水为超纯水(实验室自制);其它试剂均为分析纯。
1.3试药
葫芦巴苷Ⅱ(批号:CHB201110,纯度:98%,成都克洛玛生物科技有限公司);白背叶对照药材(批号:3112964,珠海安哲生物科技有限公司);白背叶标准汤剂(冻干粉),批号:BBYBT-01~BBYBT-15(其中,BBYBT-01~BBYBT-05来源于湖南省永州市,BBYBT-06~BBYBT-10来源于广西柳州市,BBYBT-11~BBYBT-15来源于湖南省邵阳市)。
2色谱条件与系统适用性试验
2.1拟定的色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm,内径为2.1mm,粒径为2.7μm);以甲醇为流动相A,以0.1%甲酸水溶液为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;流速为03mL/min;柱温为30℃;检测波长为336nm;理论板数按葫芦巴苷Ⅱ峰计算应不低于2000。
表中百分号的含义为体积百分数。
2.2溶液的制备
(1)对照品溶液的制备:取葫芦巴苷Ⅱ对照品适量,精密称定,加50%甲醇水溶液制成每1mL含20μg的溶液,即得。
(2)对照药材溶液的制备:取白背叶对照药材粉末0.1g,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇水溶液30mL,密塞,称定重量,超声处理(功率500W,频率40kHz)30min,放冷,再称定重量,用50%甲醇水溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
(3)供试品溶液的制备:取本品约0.1g,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇水溶液30mL,密塞,称定重量,超声处理(功率500W,频率40kHz)30min,放冷,再称定重量,用50%甲醇水溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.3测定法
分别取所得的对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液各3μL,注入至高效液相色谱仪,测定,即得。
3色谱条件考察
3.1最佳吸收波长考察
在拟定的实验条件基础上,利用二极管阵列检测器对白背叶标准汤剂供试品溶液进行全波长扫描,并提取供试品溶液在254nm、270nm、336nm波长下的色谱图,所得结果如图1~3所示。
结果表明,在检测波长为336nm时色谱峰信息量较大,色谱图基线更平稳,各特征峰响应值较大,故检测波长确定为336nm。
3.2流动相考察
(1)有机相考察:流动相分别采用甲醇-水、乙腈-水,其余色谱条件同“2.1”项下方法测定,所得结果如图4所示。
结果表明,当甲醇-水作为流动相时,各峰分离度较好,故选择甲醇-水系统。
(2)水相组成考察:除流动相B分别选取0.1%甲酸溶液、0.1%乙酸溶液、0.1%磷酸溶液三种流动相(均为体积浓度,以水为基质)进行比较外,其余条件均按“2.1”项下色谱条件进行测定分析,对比不同类型的水相。结果如图5所示。
结果表明,选取0.1%甲酸溶液作为水相时,各色谱峰峰形及分离度较佳。故采用甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相进行洗脱。
3.3柱温考察
将柱温分别设定为30℃、35℃、40℃,其余色谱条件同“2.1”项下方法测定,所得结果如图6所示。
结果表明,在柱温为30℃时,色谱图峰形和分离度较好,故柱温确定为30℃。
3.4流速考察
将流速分别设定为0.2mL/min、0.3mL/min、0.4mL/min,其余色谱条件同“2.1”项下方法测定,所得结果如图7所示。
结果表明,流速为0.3mL/min色谱图峰形较好,分离度最佳,故流速确定为0.3mL/min。
综上所述,白背叶标准汤剂特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm,内径为2.1mm,粒度为2.7μm);以甲醇为流动相A,以0.1%甲酸水溶液为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;流速为0.3mL/min;柱温为30℃;检测波长为336nm。理论板数按葫芦巴苷Ⅱ峰计算应不低于2000。
4供试品溶液制备方法考察
4.1提取溶剂考察
取白背叶标准汤剂冻干粉(批号:BBYBT-04)0.1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,分别对供试品提取溶剂为水、50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液时进行考察,密塞,称定重量,超声处理(功率500W,频率40kHz)30min,放冷,再称定重量,用提取溶剂补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
按照“2.1”项下色谱条件进样测定,计算5个特征峰的“总峰面积/称样量”来比较不同提取溶剂对白背叶标准汤剂特征图谱的影响,选择最佳提取溶剂。结果见表1、图8。
表1白背叶标准汤剂特征峰结果-不同提取溶剂考察
结果表明,不同提取溶剂对白背叶特征峰的个数及峰形影响不大,当使用50%甲醇水溶液为提取溶剂时,色谱图中各特征峰的峰形较好,且响应值较高,“总峰面积/称样量”较大。因此,最终选取50%甲醇水溶液作为提取溶剂。
4.2提取方法考察
取白背叶标准汤剂冻干粉(批号:BBYBT-04)0.1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇水溶液30mL,密塞,称定重量,分别对供试品提取方法为回流、超声时进行考察,提取时间30min,放冷,再称定重量,用50%甲醇水溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
按照“2.1”项下色谱条件进样测定,计算5个特征峰的“总峰面积/称样量”来比较不同提取方法对白背叶标准汤剂特征图谱的影响,选择最佳提取方法。结果见表2、图9。
表2白背叶标准汤剂特征峰结果-不同提取方法考察
结果表明,对供试品分别进行超声提取与回流提取时,色谱峰信息和分离效果差异不大,但超声提取的提取效率较佳,5个特征峰的“总峰面积/称样量”较大;因此,选择采用超声提取作为提取方式。
4.3提取时间考察
取白背叶标准汤剂冻干粉(批号:BBYBT-04)0.1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇水溶液30mL,密塞,称定重量,超声处理(功率500W,频率40kHz),分别对供试品提取时间为20min、30min、40min时进行考察,放冷,再称定重量,用50%甲醇水溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
按照“2.1”项下色谱条件进样测定,计算5个特征峰的“总峰面积/称样量”来比较不同提取时间对白背叶标准汤剂特征图谱的影响,选择最佳提取时间。结果见表3、图10。
表3白背叶标准汤剂特征峰结果-不同提取时间考察
结果表明,不同提取时间“总峰面积/称样量”有一定差异,30min提取效率最佳,5个特征峰的“总峰面积/称样量”较大,故优选提取时间为30分钟。
4.4溶媒用量考察
取白背叶标准汤剂冻干粉(批号:BBYBT-04)0.1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇水溶液,密塞,称定重量,超声处理(功率500W,频率40kHz)30min,分别对供试品溶媒用量为20mL、30mL、50mL进行考察,放冷,再称定重量,用50%甲醇水溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
按照“2.1”项下色谱条件进样测定,计算5个特征峰的“总峰面积/称样量”来比较不同溶媒用量对白背叶标准汤剂特征图谱的影响,选择最佳溶媒用量。结果见表4、图11。
表4白背叶标准汤剂特征峰结果-溶媒用量考察
结果表明,不同溶媒用量“总峰面积/称样量”有一定差异,30mL提取效率最佳,5个特征峰的“总峰面积/称样量”较大,故选择溶媒用量为30分钟。
综上所述,确定供试品溶液制备方法的主要参数如下:取白背叶标准汤剂冻干粉约0.1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇水溶液30mL,密塞,称定重量,超声处理(功率500W,频率40kHz)30min,放冷,再称定重量,用50%甲醇水溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
5特征图谱方法学验证
5.1专属性考察
取上述对照药材溶液、对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂(50%甲醇水溶液)各适量,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。结果表明,白背叶对照药材、对照品、供试品色谱图的基线均平稳,色谱峰分离度、对称性良好,供试品中各色谱峰与对照品、对照药材各对应色谱峰的保留时间基本相同,且空白溶剂无干扰。结果见图12。
5.2精密度试验
取同一批白背叶标准汤剂冻干粉(批号:BBYBT-04),按“2.2”项下方法制备供试品溶液,连续进样6次,记录特征图谱,图谱中显示5个特征峰。以峰1(葫芦巴苷Ⅱ)为参照峰,计算峰2、3、4、5的相对保留时间。5个特征峰的相对保留时间RSD值均小于1%,特征峰的相对峰面积RSD值均小于6%,表明仪器精密度良好,结果见表5、表6。
表5白背叶标准汤剂精密度试验结果(相对保留时间)
表6白背叶标准汤剂精密度试验结果(相对峰面积)
5.3重复性试验
取同一批白背叶标准汤剂冻干粉(批号:BBYBT-04),按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液,进样,记录特征图谱,图谱中显示5个特征峰。以峰1(葫芦巴苷Ⅱ)为参照峰,计算峰2、3、4、5的相对保留时间。5个特征峰的相对保留时间RSD值均小于1%,特征峰的相对峰面积RSD值均小于4%,表明方法重复性良好,结果见表7、表8。
表7白背叶标准汤剂重复性试验结果(相对保留时间)
表8白背叶标准汤剂重复性试验结果(相对峰面积)
5.4稳定性试验
取同一批白背叶标准汤剂冻干粉(批号:BBYBT-04),按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液,分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h注入液相色谱仪,记录特征图谱,进样,记录特征图谱,图谱中显示5个特征峰。以峰1(葫芦巴苷Ⅱ)为参照峰,计算峰2、3、4、5的相对保留时间。5个特征峰的相对保留时间RSD值均小于1%,特征峰的相对峰面积RSD值均小于4%,表明供试品溶液12h内稳定性良好,结果见表9、表10。
表9白背叶标准汤剂稳定性试验结果(相对保留时间)
表10白背叶标准汤剂稳定性试验结果(相对峰面积)
综上所述:各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求,该方法良好,并将上述5个特征峰纳入后续考察。
5.5特征图谱的建立及共有峰的指认
将15批白背叶标准汤剂HPLC指纹图谱导入“中药色谱特征图谱相似度评价系统软件(2012版)”中生成叠加图及对照特征图谱,选择分离度较好、峰面积较大、峰形较好的5个共有峰作为特征峰。通过对照品比对,其中峰1为葫芦巴苷Ⅱ。葫芦巴苷Ⅱ为白背叶的主要活性成分,且化学性质稳定,其色谱峰在各色谱峰中,分离度较好和峰面积较大,故选取1号峰(葫芦巴苷Ⅱ)作为特征图谱的参照峰,计算峰2、3、4、5的相对保留时间,结果见表11。葫芦巴苷Ⅱ对照品特征图谱见图13、对照药材特征图谱见图14、15批白背叶标准汤剂特征图谱叠加图见15、白背叶标准汤剂对照特征图谱见图16。
表11 15批白背叶标准汤剂冻干粉样品的相对保留时间
5.6特征图谱标准的建立
综上所述,确定特征图谱的标准为:供试品色谱中应呈现5个特征峰,并应与对照药材参照物色谱中的5个特征峰保留时间相对应。与葫芦巴苷Ⅱ参照物峰相对应的峰为S峰,计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。规定值为:1.36(峰2)、1.48(峰3)、1.59(峰4)、2.86(峰5)。
实施例2白背叶标准汤剂UPLC含量测定方法建立
基于实施例1中的白背叶标准汤剂的UPLC特征图谱的构建方法,实施例2还进行了如下的方法学考察,建立了白背叶标准汤剂的UPLC含量测定方法,具体包括:
1线性关系考察
取葫芦巴苷Ⅱ对照品适量,精密称定,加50%甲醇水溶液制成每1mL含65.464μg的溶液,作为对照品母液,依次稀释成浓度为32.732、16.366、8.183、4.092、2.046μg/mL的对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液各3μL,依次注入高效液相色谱仪,测定峰面积,以葫芦巴苷Ⅱ对照品进样浓度(μg/mL)对葫芦巴苷Ⅱ峰面积进行线性回归。以对照品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程为y=11426x-2294,相关系数r=0.9997。结果见表12,标准曲线见图17。
表12葫芦巴苷Ⅱ线性关系考察结果
结果表明,在上述色谱条件下,葫芦巴苷Ⅱ进样浓度在2.046~65.464μg/mL范围内与峰面积值呈良好的线性关系。
2重复性试验
取同一批白背叶标准汤剂冻干粉(批号:BBYBT-04),精密称定,共称取6份,按实施例1“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液,按实施例1“2.1”项下色谱条件,分别精密吸取3μL进样测定,计算葫芦巴苷Ⅱ的含量,结果见表13。
表13重复性试验结果
结果表明,6次测得白背叶标准汤剂中葫芦巴苷Ⅱ的平均含量为5.93mg/g,RSD小于3%,说明本方法的重复性良好。
3精密度试验
精密吸取同一份供试品溶液(批号:BBYBT-04),按实施例1“2.1”项下色谱条件,重复进样6次,测定葫芦巴苷Ⅱ峰面积,其RSD小于3%,表明仪器精密度良好,结果见表14。
表14仪器精密度试验结果
4稳定性试验
取同一份供试品溶液(批号:BBYBT-04),于配制后的0、2、4、8、10、12h分别进样,测定葫芦巴苷Ⅱ峰面积,其RSD小于3%,表明供试品溶液在12h内稳定,结果见表15。
表15稳定性试验结果
5中间精密度试验
取同一批白背叶标准汤剂冻干粉(批号:BBYBT-04),分别由不同人员按实施例1“2.2”项下方法制备6份供试品溶液,按实施例1“2.1”项下色谱条件,分别注入不同高效液相色谱仪,测定葫芦巴苷Ⅱ含量,结果见表16。结果表明,6次测得白背叶标准汤剂中葫芦巴苷Ⅱ的平均含量为5.76mg/g,RSD小于5%,该方法中间精密度良好。
表16中间精密度试验结果
6加样回收率试验
精密称取同一批白背叶标准汤剂冻干粉(批号:BBYBT-04,含量为5.93mg/g)共6份,每份约0.05g,分别加入1mL的含葫芦巴苷Ⅱ对照品0.2895mg/mL的溶液,照实施例1“2.2”项下方法制备,按实施例1“2.1”项色谱条件进行测定,计算回收率,结果显示葫芦巴苷Ⅱ的平均回收率为99.83%,RSD小于2%,表明该方法回收率良好。结果见表17。
表17加样回收率试验结果
7样品含量测定
取15批白背叶标准汤剂冻干粉,按上述方法测定,利用外标法计算葫芦巴苷Ⅱ的含量,结果见表18,葫芦巴苷Ⅱ的含量范围为4.87~7.74mg/g,均值为6.37mg/g,均值的±3SD范围为4.01~8.72。综合15批标准汤剂数据分布,确定以均值±3SD为葫芦巴苷Ⅱ含量限度范围为:每1g白背叶标准汤剂冻干粉中含葫芦巴苷Ⅱ(C27H30O15)应为4.0mg~8.7mg。
表18 15批白背叶标准汤剂冻干粉中葫芦巴苷Ⅱ的含量测定结果
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明,但是本发明不限于上述实施例,在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外,在不冲突的情况下,本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的含量测定方法,其特征在于,所述甲酸水溶液的体积百分数为0.1~0.2%。
3.根据权利要求1所述的含量测定方法,其特征在于,所述高效液相色谱法的条件还包括以下i-iv中的至少一项:
i.流速:0.2~0.4mL/min;
ii.柱温:30~35℃;
iii.进样量:1~5μL;
iv.检测波长:336nm。
4.根据权利要求1所述的含量测定方法,其特征在于,理论塔板数按葫芦巴苷Ⅱ峰计算,不低于2000。
5.根据权利要求1所述的含量测定方法,其特征在于,还包括供试品溶液和对照品溶液的制备;
优选地,所述供试品溶液的质量浓度为1~5mg/mL;
优选地,所述对照品溶液的质量浓度为20~100μg/mL。
6.根据权利要求5所述的含量测定方法,其特征在于,所述供试品溶液和对照品溶液的溶剂为水或醇水混合溶液;
优选地,所述溶剂为体积百分数为50~70%的甲醇水溶液、体积百分数为50~70%的乙醇水溶液或水。
7.一种白背叶标准汤剂特征图谱的构建方法,其特征在于,将对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液分别经高效液相色谱法测定,标定共有峰,即得;所述高效液相色谱法采用权利要求1至6中任一项所述的条件。
8.根据权利要求7所述的构建方法,其特征在于,所述特征图谱包括五个特征峰,其中,以峰1葫芦巴苷Ⅱ为参照峰,计算其余各特征峰与所述参照峰的相对保留时间,所述相对保留时间应在规定值的±10%范围之内,所述规定值为:峰2:1.36、峰3:1.48、峰4:1.59、峰5:2.86。
9.根据权利要求7所述的构建方法,其特征在于,所述对照药材溶液的质量浓度为1~5mg/mL。
10.如权利要求1至6中任一项所述的含量测定方法或权利要求7至9中任一项所述的构建方法在检测白背叶标准汤剂的质量中的应用。
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