CN115993405B - 斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种斑花黄堇药材不同部位中黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法，包括以下步骤：S1、检测斑花黄堇药材不同部位的水份含量；S2、色谱条件：phenomenex C₁₈柱，以乙腈为流动相A，三乙胺‑1.0％醋酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；在波长345nm处检测黄连碱和盐酸小檗碱；S3、制备含黄连碱、盐酸小檗碱的对照品溶液；S4、供试品溶液的制备：取斑花黄堇药材的不同部位的粉末适量，分别用甲醇‑盐酸溶液进行超声提取，过滤，取续滤液蒸干，残渣用甲醇溶解，定容，即得；S5、方法学考察；S6、斑花黄堇药材不同部位的黄连碱和盐酸小檗碱的含量测定。该方法可有效检测根部和全草中黄连碱和盐酸小檗碱的含量。

Description

斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法

技术领域

本发明涉及药材中功效成分定性定量技术领域，具体涉及一种斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法。

背景技术

斑花黄堇Corydalis conspersa Maxim.Fl.Tang.为罂粟科紫堇属多年生草本植物，也称密花黄堇，少数民族藏医将其作为“当日丝哇”、“桑格丝哇”或“廿冬欧薷”(西藏)使用，植物各个组织部位图片见图1。已有红外指纹图谱和成分预实验等研究表明，斑花黄堇药材主要含有生物碱、黄酮、挥发油、甾体、有机酸、氨基酸、蛋白质、多糖及苷、酚类、鞣质、微量元素等。而生物碱是斑花黄堇药材的主要功效成分之一，已有研究中应用酸提碱沉法提取斑花黄堇药材的不同组织部位的总生物碱，然后用二氯甲烷萃取有效部位的生物碱，然后用一测多评法结合HPLC法检测斑花黄堇药材的不同组织部位盐酸小檗碱、比枯枯灵、原阿片碱、黄连碱的含量情况。但是现有方法应用酸提碱沉法的提取效率低，且在提取过程中采用二氯甲烷萃取生物碱时存在很大的损失，导致斑花黄堇药材中有效成分检测含量偏低。

本次研究采用不同的提取方法提取分离斑花黄堇药材不同部位中黄连碱和盐酸小檗碱的成分，其结构见图2，并检测其含量情况，为进一步制订斑花黄堇药材的质量标准和质量评价提供充分的研究依据。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种斑花黄堇药材黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法，该方法先测定斑花黄堇药材不同部位的水份含量情况，以便于以干燥品计算黄连碱和盐酸小檗碱的具体含量；然后通过甲醇-盐酸双相溶液提取斑花黄堇药材中不同部位中的黄连碱和盐酸小檗碱化学成分；通过标准曲线法以干燥品(除去水份)计算斑花黄堇药材中不同部位的黄连碱和盐酸小檗碱的含量，为斑花黄堇药材的质量标准中指标性化学成分的检测和质量控制提供评价的依据。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下。

一种斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法，包括以下步骤：

S1、水份检测

检测斑花黄堇药材中不同部位的样品粉末的水份含量；

S2、色谱条件

phenomenex C₁₈柱，以乙腈为流动相A，三乙胺-1.0％醋酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序：0～10min，25％A；11～20min，25％A→28％A；21～30min，28％A→30％A；31～40min，30％A→25％A；在波长345nm处检测黄连碱和盐酸小檗碱；

S3、对照品溶液的制备

取黄连碱对照品、盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1mL含黄连碱0.15～0.17mg、盐酸小檗碱0.15～0.17mg的混合对照品溶液；

S4、供试品溶液的制备

取斑花黄堇药材不同部位的样品粉末适量，分别用甲醇-盐酸溶液进行超声提取，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液蒸干，残渣用甲醇溶解，定容，即得；

S5、方法学考察

取S3的对照品溶液和S4的各供试品溶液，采用S2的色谱条件进行方法学考察；

S6、斑花黄堇药材不同部位的黄连碱和盐酸小檗碱的含量测定

取S3的混合对照品溶液以及S4的各供试品溶液，采用S2的色谱条件进行HPLC检测，并通过黄连碱对照品和盐酸小檗碱对照品的标准曲线计算斑花黄堇药材不同部位的黄连碱和盐酸小檗碱的含量。

进一步，S1中，所述水份检测是采用干燥失重法对斑花黄堇药材不同部位的样品粉末进行水份检测，具体操作如下：

称取斑花黄堇药材不同部位的样品粉末至恒重的称量瓶中，在100～105℃干燥3～4小时，连续两次干燥后称重的差异在0.3mg以下恒重，计算减失重量的百分比即为样品的水份含量。

进一步，S2中，每1000mL流动相B中含有三乙胺8mL和1.0％醋酸水溶液992mL。

进一步，S3中，所述混合对照品溶液中，黄连碱的含量为0.16mg/mL，盐酸小檗碱的含量为0.15mg/mL。

进一步，S4中，所述甲醇-盐酸溶液是将甲醇与盐酸按照体积比100：1混合得到。

进一步，所述斑花黄堇药材的不同部位包括根、茎、叶、花和全草。

更进一步，S4中，斑花黄堇药材不同部位的样品粉末与甲醇-盐酸溶液的用量比为0.01～0.1g：30mL。

更进一步，S4的供试品溶液的制备方法如下：

取斑花黄堇药材的根、茎、叶、全草的样品粉末各0.1g，或取斑花黄堇药材花的样品粉末0.01g，分别加入甲醇-盐酸溶液30.0mL，精密称定，超声提取，放冷，再精密称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密吸取续滤液25.0mL，于50～60℃下回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，并转移至2.0mL容量瓶中定容，摇匀，即得。

进一步，S5中，所述方法学考察包括专属性试验、线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重复性试验和加样回收率试验。

进一步，S6中，通过黄连碱对照品和盐酸小檗碱对照品的标准曲线计算斑花黄堇药材不同部位的黄连碱和盐酸小檗碱的含量的具体操作如下：

将S3的混合对照品溶液分别以至少进样分析3个样本，以分析色谱图中各个对照品的保留时间和峰面积，并进行线性回归分析，得到黄连碱和盐酸小檗碱的标准曲线回归方程；然后进样分析样品，将样品中的黄连碱、盐酸小檗碱的保留时间和峰面积与相应对照品的进行对比，将测得的各供试品溶液中黄连碱、盐酸小檗碱的峰面积代入相应的标准曲线线性回归方程，计算斑花黄堇药材不同部位中黄连碱和盐酸小檗碱的含量。

本发明的有益效果：

1、本发明提供一种斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法，该方法先测定斑花黄堇药材不同部位的水份含量情况，以便于以干燥品计算黄连碱和盐酸小檗碱的具体含量；然后通过甲醇-盐酸双相溶液提取斑花黄堇药材中不同部位中的黄连碱和盐酸小檗碱化学成分；通过标准曲线法以干燥品(除去水份)计算斑花黄堇药材中不同部位的黄连碱和盐酸小檗碱的含量，为斑花黄堇药材的质量标准中指标性化学成分的检测和质量控制提供评价的依据。在计算含量的过程中减去样品的水份含量，可有效以干燥品计算和评价斑花黄堇药材中有效成分的实际含量。

2、本发明主要对斑花黄堇药材中黄连碱和盐酸小檗碱进行定性定量。以黄连碱和盐酸小檗碱标准品作为对照，将对照品溶液分别以至少进样分析3个样本，分析色谱图中各个对照品的保留时间和峰面积情况，并进行线性回归分析，分别得到黄连碱和盐酸小檗碱的标准曲线回归方程；然后进样分析样品，将样品中的黄连碱、盐酸小檗碱的保留时间和峰面积与相应对照品的进行对比，将测得的各供试品溶液中黄连碱、盐酸小檗碱的峰面积代入相应的标准曲线线性回归方程，计算斑花黄堇药材不同部位中黄连碱和盐酸小檗碱的含量。本发明的方法能够实现对斑花黄堇药材不同部位中黄连碱和盐酸小檗碱应用HPLC法检测色谱图中的色谱峰保留时间，并应用标准曲线法对照检测样品中黄连碱和盐酸小檗碱含量的目的，提取方法简便，可有效控制成本，经济高效。

3、本发明的方法处理药材后，可有效检测斑花黄堇药材中根部和全草中黄连碱和盐酸小檗碱的含量，是斑花黄堇药材质量标准中功效成分和指标性成分定性定量的依据。

4、本发明的方法可以有效检测斑花黄堇药材不同部位中黄连碱和盐酸小檗碱的含量，由检测结果可知，斑花黄堇药材根部黄连碱的含量比茎、叶、全草中高且稳定，盐酸小檗碱在根部和全草中可有效定性定量，而花中黄连碱和盐酸小檗碱2种生物碱均未检出。

附图说明

图1是斑花黄堇植物全草和不同组织的照片。A：全草；B：根；C：茎；D：叶；E：花。

图2是斑花黄堇药材中黄连碱和盐酸小檗碱两种生物碱成分的结构式。其中，(a)为黄连碱的结构式；(b)为盐酸小檗碱的结构式。

图3是黄连碱和盐酸小檗碱的混合对照品检测的HPLC色谱图。

图4是斑花黄堇药材的根部位样品检测的HPLC色谱图。

图5是斑花黄堇药材的茎部位样品检测的HPLC色谱图。

图6是斑花黄堇药材的叶部位样品检测的HPLC色谱图。

图7是斑花黄堇药材的花部位样品检测的HPLC色谱图。

图8是斑花黄堇药材的全草样品检测的HPLC色谱图。

图9是黄连碱对照品的标准曲线。

图10是盐酸小檗碱对照品的标准曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优势更加清楚明白，以下结合附图及实施案例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施案例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1、材料与仪器

1.1、材料

1.1.1、斑花黄堇药材的采集及处理

药材于2017年8月采于青海省玉树藏族自治州囊谦县香龙峡谷山，经鉴定为斑花黄堇C.conspersa Maxim。将新鲜植物清洗干净后，分成根、茎、叶、花、全草各个部位，阴干，粉碎后过80目筛备用。

表1斑花黄堇药材的不同部分的样品编号

1.1.2、对照品及试剂

对照品黄连碱，购于上海源叶生物科技有限公司(批号T21S11C125202)，盐酸小檗碱，购于中国食品药品检定研究院(批号110713-201814)，质量分数均是HPLC检测后大于98％；乙腈(Fisher Chemical，HPLC级)；浓盐酸(浓度36～38％，西陇科学股份有限公司)；甲醇(西陇化工股份有限公司)；冰醋酸(西陇科学)；三乙胺(国药集团化学试剂有限公司)；水(杭州娃哈哈有限公司)；以上试剂均为分析纯。

1.2、仪器

Waters Alliance高效液相色谱系统：配有2695溶剂管理系统、2996二极管阵列检测器和Empower色谱工作站，仪器型号分别是Waters e2695(美国Waters公司)；抽滤装置套装津腾GM-0.33A过滤系统(天津市津腾实验设备有限公司)；101A-1E电热鼓风干燥箱(上海实验仪器厂有限公司)；实验室专用超纯水仪(型号为：Milli-Q Advantage A10，默克密理博merck millipore)；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；DK-S26型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)；KQ-600DB型超声波清洗器(东莞市科桥超声波设备有限公司)；微量移液器(德国普兰德Brand电动助吸器Accu-jetpro)；BSA224S-CW型电子天平(德国赛多利斯公司)；XPR404S/AC型电子天平(瑞士梅特勒-托利多集团)；SC-208G冷藏柜(河南新乡电器有限公司)。

2、方法与结果

2.1、水份测定

采用“干燥失重测定法(烘箱干燥法)”进行斑花黄堇的根、茎、叶、花、全草各个部位的水份测定，具体操作如下：

称量空称量瓶，在100～105℃干燥3～4小时恒重后，精密称取不同组织部位的斑花黄堇药材0.1g(花称取0.01g)，混合均匀，至恒重的称量瓶中(尽量使样品平铺厚度不可超过5mm)，一个样品同时做平行实验三份；在100～105℃干燥3～4小时，连续两次干燥后称重的差异在0.3mg以下恒重后，计算减失重量的百分比即为药材中水份的含量，结果如表2所示。

表2斑花黄堇的不同部位中水份的含量情况

由表2结果可见，斑花黄堇的根、茎、叶、花和全草中的水份含量分别为9.33％，8.85％，9.37％，11.58％和9.14％，药材中的水份含量在8.00～12.00％之间，RSD平均值<5.0％，说明斑花黄堇各个部位测定的水份结果稳定且较均一良好。

2.2、色谱条件

色谱柱：phenomenex C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A为乙腈，三乙胺-1.0％醋酸水溶液为流动相B，其中，每1000mL流动相B中含有三乙胺8mL和1.0％醋酸水溶液992mL。三乙胺的加入主要是为了防止拖尾，提高检测结果的准确性。

按照表3的洗脱程序进行梯度洗脱；体积流量1.0mL/min；检测波长为345.0nm；柱温30℃。

表3梯度洗脱程序

2.3、溶液的制备

2.3.1、单一对照品溶液的制备

精密称取黄连碱对照品1.52mg、盐酸小檗碱对照品1.71mg，分别置于50.0mL的容量瓶中，用无水甲醇溶解并定容，配制成含黄连碱0.0304mg/mL的单一对照品溶液以及含盐酸小檗碱0.0342mg/mL的单一对照品溶液；

精密称取黄连碱对照品15.88mg、盐酸小檗碱对照品15.12mg，分别置于50.0mL的容量瓶中，用无水甲醇溶解并定容，配制成含黄连碱0.3176mg/mL的单一对照品溶液以及盐酸小檗碱0.3024mg/mL的单一对照品溶液；

以上溶液超声10min，摇匀，定容，静置备用。

2.3.2、混合对照品溶液的制备

用移液枪精密吸取含黄连碱0.0304mg/mL的单一对照品溶液、含盐酸小檗碱0.0342mg/mL的单一对照品溶液各1.0mL，置于2.0mL容量瓶中混匀，密封，静置备用，配置成含黄连碱0.0152mg/mL、盐酸小檗碱0.0171mg/mL的混合对照品溶液；

用移液枪精密吸取含黄连碱0.3176mg/mL的单一对照品溶液、含盐酸小檗碱0.3024mg/mL的单一对照品溶液各1.0mL，置于2.0mL容量瓶中混匀，密封，静置备用，配置成含黄连碱0.1588mg/mL、盐酸小檗碱0.1512mg/mL的混合对照品溶液。

2.3.3、供试品溶液的制备

精密称取干燥后的斑花黄堇的根、茎、叶、全草的粉末各0.1g，称取花的粉末0.01g；分别置于5个具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸溶液(体积比100:1)30.0mL，密塞，称定重量，超声60分钟(功率250W，频率40kHz)，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25.0mL，在通风橱水浴上60℃回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至2.0mL的容量瓶中定容，摇匀，即得斑花黄堇的根、茎、叶、全草的各供试品溶液。

2.4、方法学考察

2.4.1、专属性试验

在2.2的色谱条件下进行HPLC检测，将含黄连碱0.1588mg/mL、盐酸小檗碱0.1512mg/mL的混合对照品溶液进样20μL，斑花黄堇的根、茎、叶、花、全草的供试品溶液进样50μL。

混合对照品溶液和斑花黄堇药材的根、茎、叶、花、全草的各供试品溶液中的黄连碱和盐酸小檗碱2个生物碱峰和峰之间的分离度均＞1.5，理论塔板数按黄连碱计算不低于4000。混合对照品及供试品的色谱图见图2～7。

由图2～7可见，HPLC检测对照品溶液以及各供试品溶液的色谱图中，盐酸小檗碱和黄连碱分别在7.6min和10.5min附近具有特征性的色谱峰，可良好地定性。

2.4.2、线性关系考察

精密吸取2.3.2中含黄连碱0.1588mg/mL、盐酸小檗碱0.1512mg/mL的混合对照品溶液10.0，15.0，20.0，25.0，30.0μL，共计5个浓度进样分析，每个质量浓度进样3次，取平均值。

分别以对照品(黄连碱、盐酸小檗碱)的质量(μg)为横坐标(X)，峰面积A为纵坐标(Y)，绘制标准曲线并进行回归计算，得各对照品的标准曲线线性回归方程及线性范围，结果见表4，图8和图9。

表4黄连碱和盐酸小檗碱对照品的线性关系和线性范围(n＝3)

2.4.3、精密度试验

精密吸取含黄连碱0.1588mg/mL、盐酸小檗碱0.1512mg/mL混合对照品溶液20μL，连续进样6次，记录黄连碱和盐酸小檗碱的保留时间和峰面积，结果表明，黄连碱和盐酸小檗碱的色谱峰相对保留时间的RSD分别为0.11％、0.09％；峰面积的RSD分别为0.50％、0.49％。

2.4.4、稳定性试验

精密吸取斑花黄堇药材的根部位(批号BHHJ-NQ-R)的供试品溶液50μL，分别于配制后的0、4、6、12h测定其中黄连碱和盐酸小檗碱的保留时间和峰面积，可得黄连碱和盐酸小檗碱的保留时间的RSD分别为0.52％、0.15％；峰面积的RSD分别为3.38％、1.37％。

2.4.5、重复性试验

称取斑花黄堇药材的根部位粉末(批号BHHJ-NQ-R)共5份0.1g，精密称定，按2.3.3的方法制备供试品溶液，测定供试品溶液中黄连碱和盐酸小檗碱的质量分数分别为2.09mg/g、0.90mg/g，RSD分别为3.27％、1.34％。

2.4.6、加样回收率试验

精密量取已知含量的斑花黄堇药材的根部位(批号BHHJ-NQ-R)的供试品溶液9份：0.1mL，0.2mL，0.3mL共3个剂量，每个剂量平行3份；分别加入含黄连碱0.1588mg/mL、盐酸小檗碱0.1512mg/mL的混合对照品溶液0.5mL，混匀，各进样50μL，按照2.2的色谱条件测定，计算黄连碱和盐酸小檗碱的加样回收率分别为98.37％、99.13％，RSD分别为3.70％、1.14％。

2.5、斑花黄堇不同部位中黄连碱和盐酸小檗碱的含量测定

将斑花黄堇药材的不同部位(根、茎、叶、花、全草)粉末，采用2.3.3的方法制备各部位的供试品溶液；精密吸取各供试品溶液50μL自动进样器进样，每个样品重复测定3次，取平均值；通过标准曲线法，将测得的各供试品溶液中黄连碱、盐酸小檗碱的峰面积代入表4的标准曲线线性回归方程，以干燥品计算各供试品溶液中的黄连碱和盐酸小檗碱的含量及RSD值，结果见表5，RSD均＜5.0％。

表5斑花黄堇不同部位中黄连碱和盐酸小檗碱的含量测定结果(n＝3)

注：“—”表示未检出。

黄连碱和盐酸小檗碱的含量公式如下：

其中，C_对为对照品的浓度(mg/mL)；A_对为对照品的峰面积；A_供为供试品(样品)的峰面积；D为供试品的稀释倍数；V为供试品初次配制溶液的体积(mL)；m为供试品的取样量(g)；w％为供试品的水份百分含量。

从表5可知，斑花黄堇药材不同部位(根、茎、叶、花、全草)中黄连碱和盐酸小檗碱的含量测定结果表明，黄连碱的平均含量在0.20mg/g～2.03mg/g之间，百分含量在0.02％～0.20％之间；根和全草中的盐酸小檗碱的平均含量分别为0.90mg/g、0.39mg/g，百分含量分别为0.09％、0.04％。根和全草样品均有效检测出黄连碱和盐酸小檗碱，且含量高于茎、叶、花；茎、叶样品只能检出黄连碱而盐酸小檗碱未检出，花中黄连碱和盐酸小檗碱均未检出。检测结果表明，斑花黄堇根部生长发育过程中黄连碱和盐酸小檗碱能够稳定有效的产生且含量丰富，其他部位2种生物碱含量较少，甚至不能用当前的样品处理方法有效提取和检出。

3、结论与分析

3.1、药材水份与药材质量的关系

药材中的水份对药材处理、储藏和养护中的一切生理生化的变化过程均具有密切的关系，水份是病虫害和霉菌的必备物质，也是药材储藏中发生变质的附带产生物。由此适量的水份的存在是对中药材质量和化学成分的定性定量的依据。本发明实施例选用的斑花黄堇药材的根、茎、叶、花和全草各部位的水份含量在8.00～12.00％之间，RSD平均值<5.0％，由此说明，本发明实施例选用的药材粉末的水份稳定且较均一良好，有利于药材的处理、储藏和养护。而现有技术中检测的药材有效成分的含量主要是干燥药材中的含量，但是通常检测过程中采用的药材均含有一定的水份，而现有的检测手段均忽视了水份的存在，这对检测结果存在着很大的影响，因此，本发明采用先检测水份含量，然后在数据处理过程中减去了水份的影响，由此可提高检测结果的准确性。

3.2、供试品溶液处理方法的选择

为有效提取出黄连碱、盐酸小檗碱两种生物碱，本发明实施例选用盐酸-甲醇双相提取黄连碱、盐酸小檗碱。这主要是由于在弱酸介质中，酸与小檗碱反应形成离子缔合复合物时，会出现强共振瑞利散射(RRS)，倍频散射(FDS)和二阶散射(SOS)，而且RRS的散射峰分别为288和369nm，FDS位于290、370和390nm，SOS位于480、540和740nm。在最佳条件下，这三种散射强度均与小檗碱的浓度成正比，可灵敏的用于小檗碱的测定。由此可用盐酸能够更加有效溶解和提取出样品中的生物碱成分，故采用盐酸-甲醇双相可减少损失并高效提取黄连碱、盐酸小檗碱2种生物碱。

3.3、生物碱含量与药材野生栽培的关系

研究的样品是采自野外自然生长的斑花黄堇植物，根据采样时的情况，至少是生长了3年以上，而植物中的化学成分是随着生长年限不断积累和增加，故需要依照GAP法规对种质或小苗进行优选，他们是影响中药材质量分级标准的关键，后期的施肥和繁育条件也是不容忽视的，从种质来源开始规范种植斑花黄堇植物生长多年以上，才能确定生物碱化学成分与生长年限间的动态含量变化情况，不同的种质和小苗不仅能提供斑花黄堇药材地方标准中黄连碱和盐酸小檗碱的含量限度依据，对药材在实际市场和临床上的定量使用更具有科学的指导意义。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、水分检测

检测斑花黄堇药材中不同部位样品粉末的水分含量；

S2、色谱条件

phenomenex C₁₈柱，以乙腈为流动相A，三乙胺-1.0%醋酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序：0～10min，25%A；11～20min，25%A→28%A；21～30min，28%A→30%A；31～40min，30%A→25%A；在波长345nm处检测黄连碱和盐酸小檗碱；

S3、对照品溶液的制备

取黄连碱对照品、盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1mL含黄连碱0.15～0.17mg、盐酸小檗碱0.15～0.17mg的混合对照品溶液；

S4、供试品溶液的制备

取斑花黄堇药材不同部位的样品粉末适量，分别用甲醇-盐酸溶液进行超声提取，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液蒸干，残渣用甲醇溶解，定容，即得；

S5、方法学考察

取S3的对照品溶液和S4的各供试品溶液，采用S2的色谱条件进行方法学考察；

S6、斑花黄堇药材不同部位的黄连碱和盐酸小檗碱的含量测定

取S3的混合对照品溶液以及S4的各供试品溶液，采用S2的色谱条件进行HPLC检测，并通过黄连碱对照品和盐酸小檗碱对照品的标准曲线计算斑花黄堇药材不同部位的黄连碱和盐酸小檗碱的含量。

2.根据权利要求1所述的斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法，其特征在于，S1中，所述水分检测是采用干燥失重法对斑花黄堇药材不同部位的样品粉末进行水分检测，具体操作如下：

称取斑花黄堇药材不同部位的样品粉末至恒重的称量瓶中，在100~105℃干燥3~4小时，连续两次干燥后称重的差异在0.3mg以下恒重，计算减失重量的百分比即为样品的水分含量。

3.根据权利要求1所述的斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法，其特征在于，S2中，每1000mL流动相B中含有三乙胺8mL和1.0%醋酸水溶液992mL。

4.根据权利要求1所述的斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法，其特征在于，S3中，所述混合对照品溶液中，黄连碱的含量为0.16mg/mL，盐酸小檗碱的含量为0.15mg/mL。

5.根据权利要求1所述的斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法，其特征在于，S4中，所述甲醇-盐酸溶液是将甲醇与盐酸按照体积比100：1混合得到。

6.根据权利要求1所述的斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法，其特征在于，所述斑花黄堇药材的不同部位包括根、茎、叶、花和全草。

7.根据权利要求6所述的斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法，其特征在于，S4中，斑花黄堇药材不同部位的样品粉末与甲醇-盐酸溶液的用量比为0.01～0.1g：30mL。

8.根据权利要求7所述的斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法，其特征在于，S4的供试品溶液的制备方法如下：

取斑花黄堇药材的根、茎、叶、全草的样品粉末各0.1g，或取斑花黄堇药材花的样品粉末0.01g，分别加入甲醇-盐酸溶液30.0mL，精密称定，超声提取，放冷，再精密称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密吸取续滤液25.0mL，于50~60℃下回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，并转移至2.0mL容量瓶中定容，摇匀，即得。

9.根据权利要求1所述的斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法，其特征在于，S5中，所述方法学考察包括专属性试验、线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重复性试验和加样回收率试验。

10.根据权利要求1所述的斑花黄堇药材不同部位黄连碱和盐酸小檗碱含量测定方法，其特征在于，S6中，通过黄连碱对照品和盐酸小檗碱对照品的标准曲线计算斑花黄堇药材不同部位的黄连碱和盐酸小檗碱的含量的具体操作如下：

将S3的混合对照品溶液分别以至少进样分析3个样本，以分析色谱图中各个对照品的保留时间和峰面积，并进行线性回归分析，得到黄连碱和盐酸小檗碱的标准曲线回归方程；然后进样分析样品，将样品中的黄连碱、盐酸小檗碱的保留时间和峰面积与相应对照品的进行对比，将测得的各供试品溶液中黄连碱、盐酸小檗碱的峰面积代入相应的标准曲线线性回归方程，计算斑花黄堇药材不同部位中黄连碱和盐酸小檗碱的含量。