CN114236034B - 一种飞龙掌血药材的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种飞龙掌血药材的检测方法，包括飞龙掌血药材的鉴别方法和HPLC特征指纹图谱研究及多成分含量测定方法。确定了通过专属性的薄层鉴别飞龙掌血药材不同产地、不同药用部位均能检出白屈菜红碱、毛两面针素及橙皮苷成分，以此判断药材真伪；通过HPLC特征指纹图谱研究及多成分含量测定，测定飞龙掌血药材橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱、毛两面针素的成分含量。确定不同产地不同药用部位的指纹图谱研究表明，根皮、根、根皮及茎皮、茎皮中共有成分一致。所述检测方法准确，灵敏度高，重复性好，结果可靠，能有效控制该产品的质量，确保药物的临床药效。
Description
技术领域
本发明涉及一种飞龙掌血药材的检测方法，特别是一种飞龙掌血药材的鉴别方法和HPLC特征指纹图谱研究及多成分含量测定方法。
背景技术
飞龙掌血又名见血飞、郎昌、白苦木、大救驾、三百棒、下山虎、簕钩、黄大金根、黄椒、血莲肠，为芸香科（Rutaceae）飞龙掌血属（Toddalia A. Juss）植物飞龙掌血Toddaliaasiatica（L.）Lam.。味辛、微苦，性温，小毒；归肝经；具有祛风止痛，散瘀止血，解毒消肿之功效；常用于风湿痹痛，腰痛，胃痛，痛经，经闭，跌打损伤，劳伤吐血，衄血，瘀滞崩漏，疮痈肿毒。飞龙掌血主要分布于非洲东部、亚洲东南部、南部及澳洲等地,我国主产于湖南、湖北、陕西、福建、台湾、浙江、四川、云南、贵州、广西等地，经调查，在贵州省内各地均有分布。
其在苗医中使用较多，由于苗族只有语言而没有文字记载，口传下来导致许多地方对同一事物描述不同，因此，飞龙掌血每个地方的称谓也不一样，贵州黔东南苗民称其为嘎龚布梭学嘎八（ghab jongx bel sob xok gax bas)，贵州黔南苗民称其为整象有（zendxangt vwd)、贵州毕节地区苗民称其为薄指（nbax nzhil）、贵州松桃苗民称其为阿散青（ghab sanb nqind）。该品种经考证：始载于《植物名实图考》，曰：“生滇南，粗蔓巨齿，森如鳞甲，新蔓密刺，叶如橘叶，结圆实如枸橘微小”。其文描述与附图特征毕与本种一致（源自《分类草药性》）。
见血飞：一物为飞龙掌血，另一物为竹叶椒根及根皮（源自《现代中药学大辞典》0271、1085），本发明研究的为飞龙掌血而非竹叶椒，在此有别。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种飞龙掌血药材的检测方法。本发明对飞龙掌血药材的薄层鉴别方法和HPLC特征指纹图谱研究及多成分含量测定方法进行了系统研究，确定了通过专属性的薄层鉴别飞龙掌血药材不同产地、不同药用部位均能检出白屈菜红碱、毛两面针素及橙皮苷成分，以此判断药材真伪；通过HPLC特征指纹图谱研究及多成分含量测定，测定飞龙掌血药材橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱、毛两面针素的成分含量。确定不同产地不同药用部位的指纹图谱研究表明，根皮、根、根皮及茎皮、茎皮中共有成分基本一致。所述检测方法准确，灵敏度高，重复性好，结果可靠，能有效控制该产品的质量，确保药物的临床药效。
目前，该药材药用部位混乱，用药需求量大，资源有限，质量标准低等问题，因此，我们对其进行质量标准研究，以期提高资源利用率，减少资源浪费，规范并提升药材标准，便于质量控制，提高药材的经济效益和社会效益。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案实现：一种飞龙掌血药材的检测方法包括对飞龙掌血药材的鉴别方法和HPLC特征指纹图谱研究及多成分含量测定方法；
所述鉴别方法包括对飞龙掌血药材中白屈菜红碱、毛两面针素及橙皮苷的薄层色谱鉴别；所述HPLC特征指纹图谱研究及多成分含量测定方法包括对飞龙掌血药材中橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱、毛两面针素HPLC特征指纹图谱研究及含量测定方法。
前飞龙掌血药材中白屈菜红碱、毛两面针素及橙皮苷的薄层色谱鉴别，具体方法如下：
供试品溶液制备：取本品粉末，加甲醇溶液，超声处理，滤过，收集滤液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液制备：取白屈菜红碱对照品、毛两面针素对照品及橙皮苷对照品，加甲醇制成混合溶液，作为对照品溶液；
照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液，分别点于硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯:甲酸:水=60～140:13～21:8～18为展开剂，展开，取出，晾干，继续喷以3%三氯化铝乙醇溶液，阴干，置紫外灯光365nm下检视；与白屈菜红碱及橙皮苷对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；置紫外灯254nm下检视，与毛两面针素对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
前述飞龙掌血药材中白屈菜红碱、毛两面针素及橙皮苷的薄层色谱鉴别，具体方法如下：
供试品溶液制备：取本品粉末0.2～0.8g，加50～95%甲醇溶液10～30mL，超声处理0.5～1.5小时，滤过，收集滤液，蒸干，残渣加50～95%甲醇10.5～1.5mL使溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液制备：取白屈菜红碱对照品、毛两面针素对照品及橙皮苷对照品，加50～95%甲醇制成每0.5～1.5mL各含0.2～0.6mg、1.5～2.5g、2.0～3.0mg的混合溶液，作为对照品溶液；
照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl，分别点于硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯:甲酸:水=80～120:15～19:11～15为展开剂，展开，取出，晾干，继续喷以3%三氯化铝乙醇溶液，阴干，置紫外灯光365nm下检视；与白屈菜红碱及橙皮苷对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；置紫外灯254nm下检视，与毛两面针素对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
更具体的，前述飞龙掌血药材中白屈菜红碱、毛两面针素及橙皮苷的薄层色谱鉴别，具体方法如下：
供试品溶液制备：取本品粉末0.5g，加75%甲醇溶液20mL，超声处理1小时，滤过，收集滤液，蒸干，残渣加75%甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液制备：取白屈菜红碱对照品、毛两面针素对照品及橙皮苷对照品，加75%甲醇制成每1mL各含0.4mg、2.0mg、2.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；
照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl，分别点于硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯:甲酸:水=100:17:13为展开剂，展开，取出，晾干，继续喷以3%三氯化铝乙醇溶液，阴干，置紫外灯光365nm下检视；与白屈菜红碱及橙皮苷对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；置紫外灯254nm下检视，与毛两面针素对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
前述飞龙掌血药材中橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱、毛两面针素HPLC特征指纹图谱研究及含量测定方法，具体按照下述步骤进行：
a.对照品溶液的制备：精密称取橙皮苷对照品、氯化两面针碱对照品、白屈菜红碱对照品及毛两面针素对照品适量，加50-95%甲醇制成每1mL含橙皮苷0.10～0.20mg、氯化两面针碱5～15μg、白屈菜红碱15～25μg，毛两面针素5～15μg的混合溶液，即得；
b.供试品溶液的制备：取本品粉末约0.2～0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50-95%甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理15-45min，功率250W，频率40kHz，再称定重量，用50-95%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
c.指纹图谱的制作：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A：以0.75%冰醋酸为流动相B，按流动相进行梯度洗脱；检测波长为270～330nm，柱温25～40℃，流速0.5～1.2ml/min；理论塔板数按白屈菜红碱峰计算应不低于6000；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定并记录HPLC色谱图，分别计算出试品溶液中橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱，毛两面针素的含量，即可得到HPLC指纹图谱。
更具体的，前述步骤a中，对照品溶液的制备:精密称取橙皮苷对照品、氯化两面针碱对照品、白屈菜红碱对照品及毛两面针素对照品适量，加75%甲醇制成每1mL含橙皮苷0.15mg、氯化两面针碱10μg、白屈菜红碱20μg，毛两面针素10μg的混合溶液，即得。
更具体的，前述步骤b中，供试品溶液的制备：取本品过3号筛的粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理45min，功率250W，频率40kHz，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
更具体的，前述步骤c中，指纹图谱的制作：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A：以0.75%冰醋酸为流动相B，按流动相进行梯度洗脱；检测波长为290nm，柱温30℃，流速1ml/min；理论塔板数按白屈菜红碱峰计算应不低于6000；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定并记录HPLC色谱图，分别计算出试品溶液中橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱，毛两面针素的含量，即可得到HPLC指纹图谱:
流动相梯度洗脱：0-35分钟，21%→26%流动相A；35-45分钟，26%→50%流动相A；45-50分钟，50%→21%流动相A。
发明人进行了大量的实验，以下是本发明所述检测方法的研究：
一、薄层色谱研究
薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。
1、实验材料
1.1 仪器：WFH-201B紫外透射反射仪（上海精科实业有限公司）；QY-20三用紫外分析仪（上海澳瑞德精密仪器有限公司）；电子天平AUW-220D型（日本岛津）；超声波提取器CHXIN CH-250型（北京创新德超声电子研究所）；数显恒温水浴锅HH-4(国华电器有限公司)。
1.2 试剂：毛两面针素（飞龙掌血内酯）对照品（中国药品生物制品检定所，批号：1531-200001）；白屈菜红碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111718-200501）；橙皮苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110721-201014）。其余试剂均为分析纯。
1.3 药材：本实验用药材为表1前十个批次。根据实验分取不同部位备用。
表1 药材收集情况
Table 1 Collection herbs of medicinal materials
| 批次 | 来 源 | 产 地 | 药材形态 | 采收日期 |
| 1 | 贵阳市万东桥 | 贵阳二戈寨(东站) | 根、茎 | 2012年8月上旬 |
| 2 | 贵阳市万东桥 | 花溪青岩 | 根、茎 | 2012年8月中旬 |
| 3 | 贵阳市万东桥 | 安顺关岭 | 根、茎 | 2012年8月中旬 |
| 4 | 贵阳市万东桥 | 贵阳乌当水田 | 根、茎 | 2012年7月下旬 |
| 5 | 贵阳市万东桥 | 黔南龙里 | 根、茎 | 2012年8月上旬 |
| 6 | 贵阳市万东桥 | 贵阳阿哈湖水库 | 根、茎 | 2012年3月中旬 |
| 7 | 贵阳市万东桥 | 毕节金沙 | 根、茎 | 2012年3月上旬 |
| 8 | 贵阳市万东桥 | 贵阳清镇 | 根、茎 | 2012年4月中旬 |
| 9 | 贵阳市万东桥 | 贵阳乌当水田 | 根、茎 | 2012年5月中旬 |
| 10 | 贵阳市万东桥 | 贵阳新添寨 | 根、茎 | 2011年12月中旬 |
| 11 | 贵州恒霸药业 | 不详 | 根、根皮、茎 | 不详 |
| 12 | 贵州恒霸药业 | 不详 | 根、根皮、茎 | 不详 |
2、方法选择与结果
2.1 展开剂的选择：实验过程中选择了甲醇-四氯化碳（1：20）做展开剂，对照品白屈菜红碱的比移值小，样品基本在原点处没有展开。选择原贵州省地标所用展开剂苯-乙酸乙酯（8：2），发现对照品同样在原点处没有展开，加入少量甲酸，还是没有展开。同样选择甲醇-乙酸乙酯-四氯化碳做展开剂（1：2：20），苯-乙酸乙酯-甲醇（8：2：0.5）、(8：2：1)、（8：2：2）、（8：2：1.5）、（8：2：4）、（8：2：2.5）、（8：2：8）、石油醚-乙酸乙酯-甲醇（8：2：0.5）、（8：2：3）、石油醚-乙酸乙酯-甲醇（8：2：2）、甲苯-乙酸乙酯-甲醇（8：2：2.5）、（8：2：3）、（6：4：8）、（6：4：6）、(16：4：1)、（16：4：2）甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（8：4：8：0.5）、（8：4：10：0.5）等展开剂进行展开，其效果均不理想，后用乙酸乙酯-甲酸-水（60～140:13～21:8～18）为展开剂进行展开，三种物质都能够显现，其中以乙酸乙酯-甲酸-水（100：17：13）进行展开效果最好，对照品和样品、对照药材均能够很好的呈现出来。由此定为该药材在三种对照品及对照药材中的最佳展开剂。
2.2 薄层板的选择：实验选择了自制薄层板硅胶G、H、GF254、购买的聚酰胺薄膜等，发现最终选择GF254薄层板最好。
2.3 薄层板粘合剂的选择：实验选择了0.5%羧甲基纤维素钠溶液、1%磷酸二氢钾-0.5%羧甲基纤维素钠溶液（1：1）、1%氢氧化钠-0.5%羧甲基纤维素钠溶液（1：1）做硅胶板的粘合剂，实验证明用0.5%羧甲基纤维素钠溶液作黏合剂效果最好。
2.4 显色剂的选择：橙皮苷在254 nm与365 nm处均不显色。需要加显色剂才能显色，因此实验选择了5%醋酸镁甲醇溶液与3%三氯化铝乙醇溶液做显色剂，实验证明用3%三氯化铝乙醇溶液显色效果较好。
3、供试品溶液的制备
称取样品粗粉（过2号筛）约0.5克，置具塞锥形瓶中，加入75%甲醇溶液20mL，超声提取1h，滤过，滤液蒸干，加入1mL甲醇溶液溶解，即得。
4、对照品溶液的制备
白屈菜红碱对照品溶液的制备，精取适量白屈菜红碱对照品，配制成415.6μg.mL-1的对照品溶液，即得；毛两面针素对照品溶液的制备：精取10.38㎎飞龙掌血内酯对照品于5mL量瓶中，甲醇溶解、定容至刻度，即得2.076㎎.mL-1飞龙掌血内酯对照品溶液；橙皮苷对照品溶液的制备：精取橙皮苷1.24㎎，精密量取0.5mL甲醇溶解，即得2.48mg.mL-1的橙皮苷对照品溶液。
5、具体展开步骤
薄层板的活化处理→点样→干燥→饱和→-展开→晾干-→喷显色剂→检视。
6、结果
在紫外光灯（365nm）下检视，供试品在与对照药材、白屈菜红碱对照品、橙皮苷对照品相应位置显相同颜色的荧光斑点。继续喷显色剂后，在紫外光灯（254nm）下检视，供试品在与对照药材、毛两面针素对照品相应位置显相同颜色的荧光斑点。10批根皮鉴别情况具体见图4和图5（图4和5中1-10为飞龙掌血根皮；11为白屈菜红碱对照品；12为毛两面针素对照品；13为橙皮苷对照品）。
7、讨论
通过本实验可知道，对于GF254荧光板的讲，在操作过程中，尤其是展开后的干燥，一定要阴干，温度过高会破坏内酯内成分，影响毛两面针素的检视。
8、拟定标准薄层鉴别方法
取本品粉末0.5g，加75%甲醇溶液20mL，超声处理1小时，滤过，收集滤液，蒸干，残渣加75%甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取白屈菜红碱对照品、毛两面针素对照品及橙皮苷对照品，加75%甲醇制成每1mL各含0.4mg、2.0mg、2.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010版一部附录VI B）试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（100:17:13）为展开剂，展开，取出，晾干，继续喷以3%三氯化铝乙醇溶液，阴干，置紫外灯光（365nm）下检视。与白屈菜红碱及橙皮苷对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。置紫外灯（254nm）下检视，与毛两面针素对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
二、HPLC特征指纹图谱研究及多成分含量测定方法
1、实验材料
1.1仪器：电子天平AUW-220D型（日本岛津）；超声波提取器CHXIN CH-250型（北京创新德超声电子研究所）；数显恒温水浴锅HH-4(国华电器有限公司)。TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）2010-AHT高效液相色谱仪（日本岛津）等。
1.2试剂：飞龙掌血内酯对照品（中国药品生物制品检定所，批号：1531-200001）；白屈菜红碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111718-200501）；橙皮苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110721-201014）；氯化两面针碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：112723-200504）。其余试剂均为分析纯。
1.3药材见表1。
2、方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
称取供试品粗粉约0.5g，精密称取于具塞锥形瓶中，精密量取75%甲醇50mL，称定锥形瓶的总重量，超声提取45min,冷却后不足损失的重量，滤过，取续滤液过0.45微米微孔滤膜，即得。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取橙皮苷10.16mg、氯化两面针碱10.1mg、白屈菜红碱10.39mg、毛两面针素10.13mg对照品于10mL量瓶；加甲醇稀释至刻度，作为对照品储备液。橙皮苷稀释为406.32μg.mL-1、氯化两面针碱稀释为101μg. mL-1、白屈菜红碱稀释为415.6μg. mL-1、毛两面针素稀释为41.52μg. mL-1作为储备液。分别吸取上述储备液4、1、1、2mL混合于10mL量瓶中，摇匀，制成混合对照品溶液，质量浓度分别为162.48μg. mL-1，10.1μg. mL-1，20.78μg. mL-1，8.304μg. mL-1。
2.3 试验条件的考察
2.3.1 流动相的选择
实验过程中选取了甲醇-水，甲醇-0.75%醋酸，甲醇-0.1%磷酸，乙腈-水，乙腈-0.2%醋酸，乙腈-0.5%醋酸，乙腈-0.75%醋酸作系统流动相，发现最终以乙腈-0.75%醋酸分离效果最好。
2.3.2 色谱柱的选择
本实验选用迪马公司生产的Diamonsil R C18 5μm（250x4.6mm）和大连依利特公司生产的Kromasil C18 5μm(250x4.6mm)的两种色谱柱。实验结果为迪马公司色谱柱的分离效果优于依利特公司色谱柱。因此选择迪马公司Diamonsil R C18 5μm(250x4.6mm)为本实验方法研究用色谱柱，不同色谱柱的液相色谱图见图6（1为Diamonsil R C18 的液相色谱图、2为Kromasil C18 的液相色谱图）。
2.3.3检测波长选择
实验选择以270nm、290nm、320nm、330nm进样，结果发现，290nm所得样品的整体性较好，而且分i离效果较好，因此选择以290nm作为最佳检出波长。具体谱图见图7（注：自上而下检测波长为270nm、290nm、320nm、330nm的图谱）。
3、供试品溶液制备方法的选择
3.1 提取时间和提取方式选择 实验选择超声提取15min、30min、45min；回流提取30min、60mn、90min；浸泡12h、24h、36。结果发现，超声提取45min提取效果较好，回流提取60min与90min各共有峰峰面积相差不大，浸泡36小时提取方式较浸泡12h、浸泡24h好，综合三种提取方法，比较发现，超声提取45分钟能够更好的提取完全，且操作简单，节约时间。最终选择以超声提取45min为最佳提取方法。具体提取方法所得谱图见图8（注：图从上到下为超声15min、30min、45min、回流30min、60min、90min、浸泡12h、24h、36h的图谱）。
3.2 提取溶剂选择
本实验选择以甲醇，乙醇，75%甲醇、75%乙醇、50%甲醇，50%乙醇，水，甲醇：乙醇（1：1）这几组提取溶剂进行提取，实验结果表明，75%甲醇能够最大限度的提取出所有的峰，而且整体效果较为明显。具体实验谱图见图9（注：图谱从上到下为甲醇、乙醇、75%甲醇、75%乙醇、50%甲醇、50%乙醇、水、甲醇-乙醇混合溶剂提取）。
3.3 总流速的选择
实验选择以1.0mL.min-1、0.5mL.min-1、0.8mL.min-1、1.2mL.min-1,结果发现，流速为0.5mL.min-1、0.8mL.min-1的分离效果较差，而1.2mL.min-1在60min至80min时间段分离效果较1.0mL.min-1差，综合认为1.0mL.min-1的流速最好。具体谱图见图4-5（注：自上而下为1.0mL.min-1、0.5mL.min-1、0.8mL.min-1、1.2mL.min-1的图谱）。
4、指纹图谱建立
4.1 色谱条件
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 流动相：以乙腈为流动相A：以0.75%冰醋酸为流动相B，按流动相进行梯度洗脱；检测波长为290nm，柱温30℃，流速1ml/min。流动相梯度洗脱：
| 时间（分钟） | 流动相A（%） | 流动相B（%） |
| 0-35 | 21→26 | 79→74 |
| 35-45 | 26→50 | 74→50 |
| 45-50 | 50→21 | 50→79 |
所得对照品谱图与样品谱图见图11。
4.2 方法学考察
4.2.1 精密度试验 实验用同一供试品连续进样6次，利用中药相似度评价软件2004版A版，选择其中一个谱图作为参照谱，时间窗宽度为0.50，对照谱以中位数方法生成，进行相似度评价，保留时间RSD小于0.5%，25个共有峰峰面积RSD小于5%，相似度为99.9%以上，说明精密度很好，方法可靠。具体图谱见图12。
4.2.2 重复性试验 分别称取同一批次（乌当水田0726）供试品6份，每份各0.5g,加入75%甲醇50mL,超声提取45min，滤过，所得供试品溶液分别进样。利用中药相似度评价软件2004版A版，选择其中一个谱图作为参照谱，时间窗宽度为0.50，对照谱以中位数方法生成，进行相似度评价，保留时间RSD小于1.0%，25个共有峰峰面积RSD只有极个别大于5%，相似度为98.8%以上，说明该方法重复性好。具体谱图见图13。
4.2.3 稳定性试验 以同一供试品溶液分别在0、3、5、7、9、11、15、19h进样，利用中药相似度评价软件2004版A版，选择其中一个谱图作为参照谱，时间窗宽度为0.50，对照谱以中位数方法生成，进行相似度评价，保留时间RSD小于1.0%，25个共有峰峰面积RSD小于5%，其相似度在99.8%以上，说明该方法在0-19h样品稳定，方法稳定性好。具体谱图见图14。
4.3分析与讨论
4.3.1飞龙掌血样品共有模式建立
共有峰的标定：以10批不同产地样品根皮作为基准图谱，飞龙掌血根皮为参照图谱，采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004 A版）分析，通过多点校正，标定为25个共有峰。经对照品光谱对照，鉴定了4个组分峰，其中10号峰为橙皮苷、11号峰为氯化两面针碱、12号峰为白屈菜红碱、15号峰为毛两面针素。
4.3.2指纹图谱相似度分析
相似度分析：采用国际药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A 版），得出飞龙掌血药材指纹图谱的共有模式及样品的相似度。10批飞龙掌血的重叠图见图15（注：谱图从上到下分别为：对照、金沙、龙里、新添寨、乌当水田（20120726）、贵阳东站、花溪青岩、清镇九龙山、乌当水田（20120915）、
阿哈湖水库、安顺关岭十个批次药材），生成的共有模式见图16，以10批样品均值生成的共有模式为对照，计算各批样品的相似度，结果10批飞龙掌血药材根皮的相似度均在0.910以上。具体结果见表2。
表2 10批飞龙掌血根皮的相似度
Table 2 Similarity of ten batch root bark inToddalia asiatica
| S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | S9 | S10 | 对照 | |
| S1 | 1 | 0.874 | 0.984 | 0.977 | 0.975 | 0.991 | 0.960 | 0.973 | 0.975 | 0.891 | 0.986 |
| S2 | 0.874 | 1 | 0.873 | 0.879 | 0.866 | 0.845 | 0.844 | 0.924 | 0.905 | 0.999 | 0.911 |
| S3 | 0.984 | 0.873 | 1 | 0.969 | 0.981 | 0.967 | 0.983 | 0.968 | 0.953 | 0.888 | 0.986 |
| S4 | 0.977 | 0.879 | 0.969 | 1 | 0.987 | 0.968 | 0.954 | 0.980 | 0.975 | 0.893 | 0.988 |
| S5 | 0.975 | 0.866 | 0.981 | 0.987 | 1 | 0.967 | 0.969 | 0.981 | 0.958 | 0.883 | 0.990 |
| S6 | 0.991 | 0.845 | 0.967 | 0.968 | 0.967 | 1 | 0.946 | 0.967 | 0.975 | 0.865 | 0.977 |
| S7 | 0.960 | 0.844 | 0.983 | 0.954 | 0.969 | 0.946 | 1 | 0.942 | 0.949 | 0.856 | 0.969 |
| S8 | 0.973 | 0.924 | 0.968 | 0.980 | 0.981 | 0.967 | 0.942 | 1 | 0.969 | 0.938 | 0.992 |
| S9 | 0.975 | 0.905 | 0.953 | 0.975 | 0.958 | 0.975 | 0.949 | 0.969 | 1 | 0.916 | 0.979 |
| S10 | 0.891 | 0.999 | 0.888 | 0.893 | 0.883 | 0.865 | 0.856 | 0.938 | 0.916 | 1 | 0.925 |
| 对照 | 0.986 | 0.911 | 0.986 | 0.988 | 0.990 | 0.977 | 0.969 | 0.992 | 0.979 | 0.925 | 1 |
注：S10至S1编号对应金沙、龙里、新添寨、乌当水田（20120726）、贵阳东站、花溪青岩、清镇九龙山、乌当水田（20120915）、阿哈湖水库、安顺关岭。
4.4不同药用部位的对比研究分析
4.4.1同一批次不同药用部位指纹图谱的特征图谱分析
对飞龙掌血药材乌当水田20120726批次药材的不同药用部位进行指纹图谱分析，以飞龙掌血根皮为参照谱，其不同药用部位与生存的对照谱图相比及自身对比情况的相似度见表3。所得谱图见图17（注：以上自下而上为根皮、根、根及茎皮、根皮及茎皮、根及茎、根木质部、茎、茎皮的图谱）。
表3 乌当（20120726）不同药用部位的相似度
Table 3 Similarity of Wudang(20120726) batch different medicinalparts
| S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | S7 | S8 | 对照 | |
| S1 | 1 | 0.987 | 0.784 | 0.900 | 0.913 | 0.966 | 0.719 | 0.622 | 0.826 |
| S2 | 0.987 | 1 | 0.769 | 0.895 | 0.889 | 0.952 | 0.702 | 0.594 | 0.810 |
| S3 | 0.784 | 0.769 | 1 | 0.921 | 0.904 | 0.886 | 0.919 | 0.872 | 0.945 |
| S4 | 0.900 | 0.895 | 0.921 | 1 | 0.989 | 0.980 | 0.943 | 0.881 | 0.983 |
| S5 | 0.913 | 0.889 | 0.904 | 0.989 | 1 | 0.984 | 0.932 | 0.885 | 0.974 |
| S6 | 0.966 | 0.952 | 0.886 | 0.980 | 0.984 | 1 | 0.874 | 0.799 | 0.943 |
| S7 | 0.719 | 0.702 | 0.919 | 0.943 | 0.932 | 0.874 | 1 | 0.983 | 0.985 |
| S8 | 0.622 | 0.594 | 0.872 | 0.881 | 0.885 | 0.799 | 0.983 | 1 | 0.944 |
| 对照 | 0.826 | 0.81 | 0.945 | 0.983 | 0.974 | 0.943 | 0.985 | 0.944 | 1 |
注：S8至S1编号为根皮、根、根及茎皮、根皮及茎皮、根及茎、根木质部、茎、茎
4.4.2龙里批次不同药用部位指纹图谱的特征图谱分析
在同一液相条件下，以根皮作为参照谱，采用采用国际药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004 A 版），进行相似度分析，其图谱见图18（注：自上而下为对照谱图、根皮、根、根皮及茎皮、茎皮的图谱），相似度在0.821-0.997之间，具体结果见表4
表4 龙里批次不同药用部位的相似度
Table 3.29 Similarity of Longli batch different medicinal parts
| S1 | S2 | S3 | S4 | 对照 | |
| S1 | 1 | 0.811 | 0.834 | 0.750 | 0.821 |
| S2 | 0.811 | 1 | 0.989 | 0.983 | 0.997 |
| S3 | 0.834 | 0.989 | 1 | 0.986 | 0.997 |
| S4 | 0.750 | 0.983 | 0.986 | 1 | 0.988 |
| 对照 | 0.821 | 0.997 | 0.997 | 0.988 | 1 |
注：S4至S1分别为根皮、根、根皮及茎皮、茎皮
4.4东站批次不同药用部位指纹图谱的特征图谱分析
在同一液相条件下，以根皮作为参照谱，采用采用国际药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004 A 版），进行相似度分析，其图谱见图19(注：自上而下为对照、根皮、根、根皮及茎皮、茎皮的图谱)，相似度在0.873-0.965之间，具体结果见表5
表5 东站批次不同药用部位的相似度
Table5 Similarity of Dongzhan batch different medicinal parts
| S1 | S2 | S3 | S4 | 对照 | |
| S1 | 1 | 0.956 | 0.967 | 0.692 | 0.873 |
| S2 | 0.956 | 1 | 0.964 | 0.758 | 0.933 |
| S3 | 0.967 | 0.964 | 1 | 0.836 | 0.965 |
| S4 | 0.692 | 0.758 | 0.836 | 1 | 0.916 |
| 对照 | 0.873 | 0.933 | 0.965 | 0.916 | 1 |
注：S4至S1分别为根皮、根、根皮及茎皮、茎皮
4.4.5清镇九龙山批次不同药用部位指纹图谱的特征图谱分析
在同一液相条件下，以根皮作为参照谱，采用采用国际药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004 A 版），进行相似度分析，其图谱见图20（ 注：自上而下为对照、根皮、根、根皮及茎皮、茎皮的图谱），相似度在0.920-0.987之间，具体结果见表6
表6 九龙山批次不同药用部位的相似度
Table 6 Similarity of The jiulong hills Qingzhen batch differentmedicinal parts
| S1 | S2 | S3 | S4 | 对照 | |
| S1 | 1 | 0.825 | 0.943 | 0.894 | 0.920 |
| S2 | 0.825 | 1 | 0.884 | 0.972 | 0.942 |
| S3 | 0.943 | 0.884 | 1 | 0.948 | 0.987 |
| S4 | 0.894 | 0.972 | 0.948 | 1 | 0.982 |
| 对照 | 0.920 | 0.942 | 0.987 | 0.982 | 1 |
注：S4至S1分别为根皮、根、根皮及茎皮、茎皮
通过以上不同产地不同药用部位的指纹图谱研究表明，根皮、根、根皮及茎皮、茎皮中共有成分基本一致。
与现有技术相比，本发明针对飞龙掌血中成分的特点，建立了针对飞龙掌血药材的薄层色谱方法和指纹图谱及含量测定方法，该实验对提取溶剂及其浓度、提取方法及其提取时间、流动相、流速、柱温、检测波长进行了考察筛选，并进行了全面的方法学考察，通过系统研究可以看出从飞龙掌血药材的特征成分峰具有较好的相关性，该指纹图谱能较好地体现飞龙掌血药材的特有成分。本发明方法还具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。
本发明主要从药材的基源、产地分布情况着手，结合各部位化学成分的异同，药理情况研究进展，临床用药情况和药材质量研究情况对其进行综述。其次，对实验思路进行设计，进而分别对药学部分进行研究。通过对药学部分不同药用部位的特征指纹图谱进行对比研究、不同药用部位的指标性成分含量研究和不同药用部位其他药学指标对比研究，得出最佳药用部位为根皮及茎皮。
目前，该药材药用部位混乱，用药需求量大，资源有限，质量标准低等问题，因此，我们对其进行质量检验方法进行研究，以期提高资源利用率，减少资源浪费，规范并提升药材标准，便于质量控制，提高药材的经济效益和社会效益。
附图说明
图1飞龙掌血的叶及茎；
图2飞龙掌血根及木质部；
图3飞龙掌血茎皮；
图4 10批根皮和对照品在254nm下色谱图；
图5 10批根皮和对照品在365 nm下色谱图；
图6 Diamonsil R C18 5μm（250x4.6mm）和Kromasil C18 5μm(250x4.6mm)两种色谱柱的指纹图谱重叠图；
图7 波长的选择指纹图谱重叠图；
图8 提取时间的考察指纹图谱重叠图
图9 提取溶剂的选择指纹图谱重叠图
图10 总流速的选择指纹图谱重叠图
图11对照品与样品的指纹图谱重叠图
图12 精密度试验的指纹图谱重叠图
图13 重复性试验的指纹图谱重叠图
图14 定性试验的指纹图谱重叠图
图15 10批飞龙掌血根皮指纹图谱重叠图
图16 10批飞龙掌血根皮药材特征图谱生成的共有模式
图17 乌当批次不同药用部位指纹图谱重叠图
图18 龙里批次不同药用部位指纹图谱重叠图
图19 贵阳东站批次不同药用部位指纹图谱重叠图
图20 清镇九龙山批次不同药用部位指纹图谱重叠图
具体实施方式
实施例1.
薄层鉴别：
供试品溶液制备：取本品粉末0.5g，加75%甲醇溶液20mL，超声处理1小时，滤过，收集滤液，蒸干，残渣加75%甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液制备：取白屈菜红碱对照品、毛两面针素对照品及橙皮苷对照品，加75%甲醇制成每1mL各含0.4mg、2.0mg、2.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。
照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl，分别点于硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（100:17:13）为展开剂，展开，取出，晾干，继续喷以3%三氯化铝乙醇溶液，阴干，置紫外灯光（365nm）下检视。与白屈菜红碱及橙皮苷对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。置紫外灯（254nm）下检视，与毛两面针素对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例2
含量测定：同时测定12批样品中橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱及毛两面针素4中成分。
对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷对照品、氯化两面针碱对照品、白屈菜红碱对照品及毛两面针素对照品适量，加75%甲醇制成每1mL含橙皮苷0.15mg、氯化两面针碱10μg、白屈菜红碱20μg，毛两面针素10μg的混合溶液，即得。。
供试品溶液的制备 取本品粉末（过3号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）45min，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
所述所述步骤c中，指纹图谱的制作：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A：以0.75%冰醋酸为流动相B，按流动相进行梯度洗脱；检测波长为290nm，柱温30℃，流速1ml/min。理论塔板数按白屈菜红碱峰计算应不低于6000。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定并记录HPLC色谱图，分别计算出试品溶液中橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱，毛两面针素的含量，即可得到HPLC指纹图谱:
流动相梯度洗脱：
| 时间（分钟） | 流动相A（%） | 流动相B（%） |
| 0-35 | 21→26 | 79→74 |
| 35-45 | 26→50 | 74→50 |
| 45-50 | 50→21 | 50→79 |
12批样品含量检测结果见下表。
表7 12批样品含量（%）测定结果（n=2）
Table7 12group of root bark,stem bark content(%)(n=2)
| 批次 | 样品来源 | 橙皮苷 | 氯化两面针碱 | 白屈菜红碱 | 毛两面针素 |
| 1 | 乌当水田0726 | 5.551 | 0.051 | 0.066 | 0.025 |
| 2 | 安顺关岭 | 3.750 | 0.107 | 0.154 | 0.021 |
| 3 | 阿哈湖水库 | 3.415 | 0.076 | 0.092 | 0.048 |
| 4 | 新添寨 | 2.806 | 0.057 | 0.121 | 0.066 |
| 5 | 毕节金沙 | 4.398 | 0.077 | 0.161 | 0.045 |
| 6 | 花溪青岩 | 4.940 | 0.061 | 0.087 | 0.087 |
| 7 | 乌当水田0915 | 4.303 | 0.065 | 0.155 | 0.046 |
| 8 | 贵州恒霸药业 | 5.119 | 0.040 | 0.090 | 0.086 |
| 9 | 贵州恒霸药业 | 2.527 | 0.038 | 0.101 | 0.084 |
| 10 | 龙里 | 3.208 | 0.056 | 0.074 | 0.067 |
| 11 | 清镇 | 2.438 | 0.045 | 0.100 | 0.038 |
| 12 | 东站 | 3.422 | 0.081 | 0.091 | 0.024 |
根据12批样品的含量测定结果，橙皮苷最高含量为5.551%，最低含量为2.527%，平均含量为3.823%；氯化两面针碱最高含量为0.107%，最低含量为0.038%%，平均含量为0.063%；白屈菜红碱最高含量为0.161%，最低含量为0.066%，平均含量为0.108%；毛两面针素最高含量为0.087%，最低含量为0.021%，平均含量为0.053%。结合药材产地、采收季节及炮制加工等因素，规定本品按干燥品计算，含橙皮苷不得低于2.0%，氯化两面针碱不得低于0.030%，白屈菜红碱不得低于0.050%，毛两面针素不得低于0.020%。
Claims (7)
1.一种飞龙掌血药材的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括对飞龙掌血药材的鉴别方法和HPLC特征指纹图谱研究及多成分含量测定方法；
所述鉴别方法包括对飞龙掌血药材中白屈菜红碱、毛两面针素及橙皮苷的薄层色谱鉴别；所述HPLC特征指纹图谱研究及多成分含量测定方法包括对飞龙掌血药材中橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱、毛两面针素HPLC特征指纹图谱研究及含量测定方法；
所述飞龙掌血药材中白屈菜红碱、毛两面针素及橙皮苷的薄层色谱鉴别，具体方法如下：
供试品溶液制备：取本品粉末，加甲醇溶液，超声处理，滤过，收集滤液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液制备：取白屈菜红碱对照品、毛两面针素对照品及橙皮苷对照品，加甲醇制成混合溶液，作为对照品溶液；
照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液，分别点于硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯:甲酸:水=60～140:13～21:8～18为展开剂，展开，取出，晾干，继续喷以3%三氯化铝乙醇溶液，阴干，置紫外灯光365nm下检视；与白屈菜红碱及橙皮苷对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；置紫外灯254nm下检视，与毛两面针素对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
2.如权利要求1所述飞龙掌血药材的检测方法，其特征在于：所述飞龙掌血药材中白屈菜红碱、毛两面针素及橙皮苷的薄层色谱鉴别，具体方法如下：
供试品溶液制备：取本品粉末0.2～0.8g，加50～95%甲醇溶液10～30mL，超声处理0.5～1.5小时，滤过，收集滤液，蒸干，残渣加50～95%甲醇10.5～1.5mL使溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液制备：取白屈菜红碱对照品、毛两面针素对照品及橙皮苷对照品，加50～95%甲醇制成每0.5～1.5mL各含0.2～0.6mg、1.5～2.5g、2.0～3.0mg的混合溶液，作为对照品溶液；
照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl，分别点于硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯:甲酸:水=80～120:15～19:11～15为展开剂，展开，取出，晾干，继续喷以3%三氯化铝乙醇溶液，阴干，置紫外灯光365nm下检视；与白屈菜红碱及橙皮苷对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；置紫外灯254nm下检视，与毛两面针素对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
3.如权利要求2所述飞龙掌血药材的检测方法，其特征在于：所述飞龙掌血药材中白屈菜红碱、毛两面针素及橙皮苷的薄层色谱鉴别，具体方法如下：
供试品溶液制备：取本品粉末0.5g，加75%甲醇溶液20mL，超声处理1小时，滤过，收集滤液，蒸干，残渣加75%甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液制备：取白屈菜红碱对照品、毛两面针素对照品及橙皮苷对照品，加75%甲醇制成每1mL各含0.4mg、2.0mg、2.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；
照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl，分别点于硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯:甲酸:水=100:17:13为展开剂，展开，取出，晾干，继续喷以3%三氯化铝乙醇溶液，阴干，置紫外灯光365nm下检视；与白屈菜红碱及橙皮苷对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；置紫外灯254nm下检视，与毛两面针素对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。
4.如权利要求1所述飞龙掌血药材的检测方法，其特征在于：所述飞龙掌血药材中橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱、毛两面针素HPLC特征指纹图谱研究及含量测定方法，具体按照下述步骤进行：
a.对照品溶液的制备：精密称取橙皮苷对照品、氯化两面针碱对照品、白屈菜红碱对照品及毛两面针素对照品适量，加50-95%甲醇制成每1mL含橙皮苷0.10～0.20mg、氯化两面针碱5～15μg、白屈菜红碱15～25μg，毛两面针素5～15μg的混合溶液，即得；
b.供试品溶液的制备：取本品粉末0.2～0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50-95%甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理15-45min，功率250W，频率40kHz，再称定重量，用50-95%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
c.指纹图谱的制作：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A：以0.75%冰醋酸为流动相B，按流动相进行梯度洗脱；检测波长为270～330nm，柱温25～40℃，流速0.5～1.2ml/min；理论塔板数按白屈菜红碱峰计算应不低于6000；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定并记录HPLC色谱图，分别计算出试品溶液中橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱，毛两面针素的含量，即可得到的HPLC指纹图谱。
5.如权利要求4所述飞龙掌血药材的检测方法，其特征在于：所述步骤a中，对照品溶液的制备:精密称取橙皮苷对照品、氯化两面针碱对照品、白屈菜红碱对照品及毛两面针素对照品适量，加75%甲醇制成每1mL含橙皮苷0.15mg、氯化两面针碱10μg、白屈菜红碱20μg，毛两面针素10μg的混合溶液，即得。
6.如权利要求4所述飞龙掌血药材的检测方法，其特征在于：所述步骤b中，供试品溶液的制备：取本品过3号筛的粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理45min，功率250W，频率40kHz，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
7.如权利要求4所述飞龙掌血药材的检测方法，其特征在于：所述步骤c中，指纹图谱的制作：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A：以0.75%冰醋酸为流动相B，按流动相进行梯度洗脱；检测波长为290nm，柱温30℃，流速1ml/min；理论塔板数按白屈菜红碱峰计算应不低于6000；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定并记录HPLC色谱图，分别计算出试品溶液中橙皮苷、氯化两面针碱、白屈菜红碱，毛两面针素的含量，即可得到的HPLC指纹图谱:
流动相梯度洗脱：0-35分钟，21%→26%流动相A；35-45分钟，26%→50%流动相A；45-50分钟，50%→21%流动相A。
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